抗PD1抗體及其作為治療劑與診斷劑的用途的制作方法

本申請是申請日為2013年09月13日、中國申請號為201380079581.6、發明名稱為“抗pd1抗體及其作為治療劑與診斷劑的用途”的發明申請的分案申請。

發明背景

程序性死亡-1(programmeddeath-1；pd-1，也稱為cd279)是一種與cd28/ctla4共同刺激/抑制受體家族相關的55kd受體蛋白質(blank等人，2005cancerimmunolimmunother54:307-314)。在小鼠及人類中克隆及表征了編碼pd-1的基因及cdna(ishida等人，1992emboj11:3887-3395；shinohara等人，1994genomics23:704-706)。全長pd-1含有288個氨基酸殘基(ncbi登錄號：np_005009)。它的胞外域由氨基酸殘基1-167組成，而胞質c末端尾部包含殘基191-288，該尾部具有兩個假設性免疫調節基序，一個是基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(itim；vivier等人，1997immunoltoday18:286-291)，一個是免疫受體酪氨酸轉換基序(itsm；chemnitz等人，2004jimmunol173:945-954)。

迄今為止，兩個序列相關配體pd-l1(b7-h1)與pd-l2(b7-dc)已被鑒定為與pd-1特異性相互作用，誘導細胞內信號轉導，該細胞內信號轉導抑制cd3及cd28介導的t細胞激活(riley,2009immunolrev229:114-125)，繼而削弱t細胞活性(例如，減少細胞增殖、il-2與ifn-γ分泌，以及其他生長因子及細胞因子分泌)。

經常在諸如t細胞、b細胞、單核細胞及天然殺傷(nk)細胞等免疫細胞中發現pd-1的表達。pd-1很少在諸如肌肉、上皮、神經元組織等其他人類組織中表達。此外，高水平的pd-1表達常常與免疫細胞的激活關聯。舉例而言，當藉由植物血球凝集素(pha)或佛波醇酯(12-o-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯或tpa)激活人類t細胞系jurkat時，在western印跡中可見pd-1的表達上調(vibharka等人，1997expcellres232:25-28)。在被抗cd3抗體刺激后，在受刺激鼠類t淋巴細胞及b淋巴細胞中及在原代人類cd4+t細胞中觀察到相同現象(agata等人，1996intimmunol8:765-772；bennett等人，2003jimmunol170:711-118)。t效應細胞刺激后的pd-1表達增強使得朝耗竭及減少免疫活性方向再導向激活的t效應細胞。因此，pd-1介導的抑制信號在免疫耐受方面起到重要作用(bour-jordan等人，2011immunolrev241:180-205)。

在各種涉及不同類型組織及器官的癌癥方面，報告了腫瘤浸潤淋巴細胞(til)中的pd-1表達及腫瘤細胞中的pd-1配體表達的增強，所述組織及器官諸如肺(konishi等人，2004clincancerres10:5094-5100)、肝(shi等人，2008intjcancer128:887-896；gao等人，2009clincancerres15:971-979)、胃(wu等人，2006actahistochem108:19-24)、腎(thompson等人，2004procnatlacadsci101:17174-17179；thompson等人，2007clincancerres13:1757-1761)、乳腺(ghebeh等人，2006neoplasia8:190-198)、卵巢(hamanishi等人，2007procnatlacadsci104:3360-3365)、胰腺(nomi等人，2007clincancerres13:2151-2157)、黑素細胞(hino等人，2010cancer116:1757-1766)及食道(ohigashi等人，2005clincancerres11:2947-2953)。更經常地，那些癌癥中的pd-1及pd-l1增強表達與患者生存結果的不良預后關聯。具有抑制異體移植癌細胞生長的pd-1基因敲除的轉基因小鼠進一步闡明在癌癥根治或耐受的免疫系統調控中pd-1信號傳導的重要性(zhang等人，2009blood114:1545-1552)。

pd-1信號傳導上調不僅導致對癌生長的免疫耐受，而且導致人類中的病毒感染及擴充。流行性肝感染病毒hbv及hcv誘導肝細胞中的pd-1配體的過度表達及激活t效應細胞中的pd-1信號傳導，從而引起t細胞耗竭及對病毒感染的耐受(boni等人，2007jvirol81:4215-4225；golden-mason等人，2008jimmunol180:3637-3641)。同樣地，hiv感染常常藉由類似機制避開人類免疫系統。拮抗劑分子對pd-1信號傳導的治療性調控可從耐受中反轉免疫細胞，并經再激活以根治癌癥及慢性病毒感染(blank等人，2005cancerimmunolimmunother54:307-314；okazaki等人，2007intimmunol19:813-824)。

發明概述

本發明提供pd-1的免疫抑制的方法及組合物。在一個方面中，本發明提供一種抗體抗原結合域，該抗體抗原結合域特異性結合人類pd-1，且包含具有選自序列編號11-22、31-42及59-63的序列的互補決定區(cdr)。

cdr可經歷重組成為重鏈可變區(vh)及輕鏈可變區(vκ)，所述區分別包含(cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3)及(cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3)序列，且保持特異于pd-1的結合及/或功能性。

在特定實施方案中，域包含重鏈可變區(vh)或輕鏈可變區(vκ)，所述可變區包含：

在特定實施方案中，域包含重鏈可變區(vh)及/或輕鏈可變區(vκ)，所述可變區包含：

a)mu317cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號11-13)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號14-16)；

b)mu326cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號17-19)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號20-22)；

c)317-4b6cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號31-33)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號34-36)；

d)326-4a3cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號37-39)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號40-42)；

e)317-1cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號11、59、13)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號14-16)；

f)317-4b2cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號11、60、13)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號61、15、16)；

g)317-4b5cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號11、60、13)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號61、15、16)；

h)317-4b6cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號11、32、13)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號61、15、16)；

i)326-1cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號17、62、19)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號20-22)；

j)326-3b1cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號17、62、19)；

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號20-22)；

k)326-3g1cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3(序列編號17、62、19)；及

cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3(序列編號20-22)。

在特定實施方案中，域包含重鏈可變區(vh)及輕鏈可變區(vκ)，所述可變區包含：

(a)cdr-h1(序列編號31)、cdr-h2(序列編號12、32、59或60)及cdr-h3(序列編號33)，

cdr-l1(序列編號14、34或61)、cdr-l2(序列編號35)及cdr-l3(序列編號36)；或

(b)cdr-h1(序列編號37)、cdr-h2(序列編號18、38或62)及cdr-h3(序列編號39)，

cdr-l1(序列編號40)、cdr-l2(序列編號41)及cdr-l3(序列編號42)。在特定實施方案中，域包含重鏈可變區(vh)或輕鏈可變區(vκ)，所述可變區包含：

在特定實施方案中，域包含重鏈可變區(vh)及輕鏈可變區(vκ)，所述可變區包含：

在特定實施方案中，域特異性結合pd1殘基：(a)k45及i93(基于2008pnas,105:10483進行aa編號；相當于序列編號2中的k58及i106)；或(b)i93、l95及p97(基于2008pnas,105:10483進行aa編號；相當于序列編號2中的i106、l108及p110)。

在特定實施方案中，域誘導與hek293/os8/pd-l1細胞或與hek293/os8/pd-l2細胞共同培養的hut78/pd-1細胞中的il-2釋放，及/或抑制與hek293/pd-l1細胞或與hek293/pd-l2細胞共同培養的hut78/p3z細胞中的il-2分泌。

本發明還提供一種抗體igg4重鏈效應器或恒定域，該效應器或恒定域包含序列編號83-88中的任一者，尤其是序列編號87或88。

本發明還提供包含專屬pd-1結合域的抗體、f(ab)或f(ab)2。

本發明還提供抗體，所述抗體包含專屬pd-1結合域及igg4重鏈效應器或恒定域，該效應器或恒定域包含序列編號83-88中的任一者，尤其是序列編號87或88。

本發明還提供一種編碼專屬pd-1結合域的多核苷酸，尤其是cdna序列。

本發明提供使用該專屬域的方法，該方法藉由向確定患有癌癥或病毒感染或確定另外需要pd-1拮抗作用的個人施用該域。

本發明還提供融合蛋白，所述融合蛋白包含：(a)融合至小鼠cd8α的c末端域(113-220)的抗人類cd3單抗okt3的單鏈可變片段(scfv)(序列編號89)；或(b)融合至人類cd3ζ鏈的胞質域的人類pd-1的胞外域及跨膜域(序列編號90)。

本發明還提供使用該專屬融合蛋白的方法，該方法包含用表達融合蛋白的細胞系檢定、篩選或選擇抗pd-1抗體。

附圖簡述

圖1：pd-1/fc(上圖)及pd-1/his(下圖)的示意性呈現。ecd：胞外域。l：接頭。h：his標簽。fc：人類igg4中的γ4fc片段。n：n末端。c：c末端。

圖2：在elisa中結合至人類pd-1的鼠類單抗的劑量依賴型反應曲線。各圖的左上角指示鼠類單抗。單抗317及517共享重鏈及輕鏈的可變區的高度同源性。藉由直接od450讀數指示結合信號強度。抗原pd-1/his以50微升的體積中增加濃度，至高達每孔70納克來包被。在實施例1中描述該方法。

圖3：藉由facs分析產生的結合至活細胞上所表達的人類pd-1的鼠類單抗的劑量依賴型反應曲線。在各個小圖上指示鼠類抗體代碼及ec50。mfi代表熒光強度均值。使hut78/pd-1細胞以每孔5x10⁴個細胞懸浮于96孔板中用于facs。如實施例1中所描述執行pd-1單抗結合至細胞表面靶點及facs檢測。

圖4：用于檢定抗pd-1單抗的功能活性的細胞共同培養系統的示意性表示。t細胞(cd4⁺或cd8⁺)表示hut78/pd-1或pbmc中的原代t細胞。tcr：t細胞受體。n：細胞核。c：細胞質。

圖5：與hek293/os8/pd-l1細胞共同培養的hut78/pd-1細胞中鼠類單抗誘導的il-2分泌的劑量依賴型反應曲線。基線：在所有受測試濃度下由migg所誘導的平均il-2釋放。頂線：基于prizmsoftware回歸計算所得的最高il-2釋放。

圖6：(a)圖示與細胞系hek293/os8/pd-l1共同培養的pbmc(供體19)中抗pd-1單抗所誘導的ifn-γ分泌的直方圖。(b)圖示與細胞系hek293/os8/pd-l1共同培養的pbmc(供體20)中抗pd-1單抗所誘導的ifn-γ分泌的直方圖。

圖7：(a)與(b)藉由共同培養效應細胞(nk92mi/pd-1)及靶細胞(hut78/pd-1)所得的抗pd-1單抗的adcc活性。由代表性實驗的兩個數據點計算均值。將單抗添加到10μg/ml的濃度。如實施例9中所描述執行實驗。

圖8：藉由elisa(上圖)及western印跡(下圖)定位抗pd-1單抗的結合表位。使用含有wt或mtpd-1的條件培養基藉由elisa及western印跡評估結合活性。**指示單抗結合活性降低至wtpd-1的25-50％的aa殘基。***指示單抗結合活性降低至wtpd-1的25％以下的aa殘基。

圖9：來自不同健康供體的原代人類pbmc中由人源化抗pd-1單抗所誘導的ifn-γ釋放，原代人類pbmc與hek293/os8/pd-l1細胞共同培養。

圖10：由人源化抗pd-1單抗hu317(a)及hu326(b)增強的nk92mi/pd-1細胞的細胞毒性。靶肺癌細胞sk-mes-1/pd-l1與效應細胞以1:2的(t比e)比率共同培養，以及如實施例12所述進行檢定。

圖11：三個治療群組：媒劑(pbs)、人類igg(huigg)及抗pd-1單抗(hu317-1/igg4mt2)中的個體腫瘤生長曲線。各個曲線表示腫瘤生長路徑，藉由各小圖右側指示數字對負有腫瘤小鼠編代碼。在第1天時接種hep3b/os8/pd-l1細胞(自肝細胞癌系hep3b建立)，在第15天時植入pbmc，及在第18天、第28天及第38天時分別注射三劑hu317-1/igg4mt2。在實施例12中描述方法。

發明詳述

當被pd-1的配體pd-l1或pd-l2接合時，pd-1啟動免疫細胞中的抑制性信號傳導。在癌長出及病毒感染的情況下，pd-1信號傳導的激活促進了免疫耐受，導致癌癥或病毒感染細胞逃避免疫監視及癌癥轉移或病毒負荷增長。藉由治療劑抑制pd-1介導的細胞信號傳導可激活包括t細胞、b細胞及nk細胞在內的免疫細胞，并因此增強抑制癌細胞生長或病毒感染的免疫細胞功能，及恢復免疫監視及免疫記憶功能以治療此類人類疾病。

本發明提供抗體，這些抗體的功能拮抗免疫細胞中配體誘導及pd-1介導的細胞信號傳導。鼠類抗pd-1抗體經人源化為在框架區中高度類似于人類抗體。以經修飾的人類igg4變體形式產生的全抗體在效應器功能及物理化學特性的方面中具有獨特的特征集合。所揭露抗pd-1抗體適合于癌癥治療、控制病毒感染及機制上涉及加劇免疫耐受的其他人類疾病中的治療用途。

定義

除非上下文另有指示，否則術語“抗體”是用于廣義上，且具體覆蓋抗體(包括全長單克隆抗體)及抗體片段，只要它們識別pd-1即可。抗體分子通常為單特異性，但也可描述為獨特特異性、異種特異性或多特異性。抗體分子經由特異性結合位點結合至抗原上的特定抗原決定簇或表位。“抗體片段”包含全長抗體的一部分，大體而言為全長抗體的抗原結合或可變區。抗體片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2及fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。

可藉由熟悉此項技術者已知的方法獲得單克隆抗體(單抗)。請參看例如，kohler等人(1975)；美國專利第4,376,110號；ausubel等人(1987-1999)；harlow等人(1988)；及colligan等人(1993)。本發明的單抗可以是任何免疫球蛋白類別，包括igg、igm、ige、iga及上述的任何亞類。可在體外或體內培養產生單抗的雜交瘤。在體內產生中可獲得高滴度的單抗，其中將來自個別雜交瘤中的細胞經腹膜內注射至小鼠(諸如原始致敏balb/c小鼠)體內以產生含有高濃度所欲單抗的腹水液。可使用熟習此項技術者所熟知的柱層析法自此類腹水液或自培養物上清液中純化同種型igm或igg的單抗。

“經分離多核苷酸”是指已與天然產生狀態下位于側翼的序列分開的多核苷酸區段或片段，例如已自正常鄰接于片段的序列移除的dna片段，例如在天然產生片段的基因組中鄰接于片段的序列。因此，該術語包括(例如)并入載體中、并入自主復制質粒或病毒中或并入原核生物或真核生物的基因組dna中的重組dna，或作為獨立于其他序列的單獨分子存在(例如，作為cdna或由pcr或限制酶消化產生的基因組或cdna片段)的重組dna。還包括如下重組dna，該重組dna為雜合基因中編碼額外多肽序列的一部分。

“構建體”意謂任何重組多核苷酸分子(諸如質粒、粘粒、病毒、自主復制多核苷酸分子、噬菌體或線性或環狀單鏈或雙鏈dna或rna多核苷酸分子)，衍生自任何來源，能夠基因組整合或自主復制，構成如下多核苷酸分子，其中已經以功能操作的方式連接(即，可操作地連接)一或多個多核苷酸分子。重組構建體通常會包含可操作地連接至轉錄起始調節序列的本發明的多核苷酸，這些序列會導引多核苷酸在所欲宿主細胞中的轉錄。可使用異源及非異源(即，內源)啟動子兩者導引本發明的核酸的表達。

“載體”是指任何重組多核苷酸構建體，該構建體可用于轉化的目的(即，將異源dna引入到宿主細胞中)。一種類型的載體為“質粒”，是指環狀雙鏈dna環，可將額外dna區段連接至該環中。另一類型的載體為病毒載體，其中可將額外dna區段連接至病毒基因組中。某些載體能夠在被引入到的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體及游離型哺乳動物載體)。在引入到宿主細胞中后，其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)整合至宿主細胞的基因組中，且因此與宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠導引被操作性連接的基因的表達。本文將此類載體稱為“表達載體”。

本文所使用的“表達載體”是指能夠在轉化、轉染或轉導至宿主細胞中時復制及表達感興趣基因的核酸分子。表達載體包含一或多個表型選擇標記及復制起點，以確保維護載體及以在需要的情況下于宿主內提供擴增。表達載體進一步包含啟動子，以驅動多肽在細胞內的表達。適宜表達載體可為衍生自pbr322的質粒或各種puc質粒，這些質粒為市售。其他表達載體可衍生自噬菌體、噬菌粒或粘粒表達載體。

本發明的額外實施方案

在特定實施方案中，本發明提供自篩選本文所揭露的鼠類雜交瘤克隆所鑒定的小鼠單克隆抗體。

在其他實施方案中，本發明提供以下多核苷酸及蛋白質序列的組合物：

a)編碼鼠類單抗317的重鏈可變區的cdna序列，序列編號3；

b)mu317_vh或鼠類單抗317的重鏈可變區的蛋白質序列(序列編號4)；

c)編碼鼠類單抗317的輕鏈可變區的cdna序列，序列編號5；

d)mu317_vκ或鼠類單抗317的輕鏈可變區的蛋白質序列(序列編號6)；

e)編碼鼠類單抗326的重鏈可變區的cdna序列，序列編號7；

f)mu326_vh或鼠類單抗326的重鏈可變區的蛋白質序列(序列編號8)；

g)編碼鼠類單抗326的輕鏈可變區的cdna序列，序列編號9；

h)mu326_vκ或鼠類單抗326的輕鏈可變區的蛋白質序列(序列編號10)。

在一個方面中，本發明提供包含互補決定區(cdr)序列的組合物，這些序列介導結合至靶抗原pd-1，包括mu317及mu326的cdr序列：

a)mu317重鏈的cdr1(mu317h-cdr1)含有氨基酸序列gfsltsygvh(序列編號11)；

b)mu317h-cdr2含有氨基酸序列viwaggstnynsalms(序列編號12)；

c)mu317h-cdr3含有氨基酸序列araygnywyidv(序列編號13)；

d)mu317輕鏈的cdr1(mu317l-cdr1)含有氨基酸序列kasqsvsndva(序列編號14)；

e)mu317l-cdr2含有氨基酸序列yafhrft(序列編號15)；

f)mu317l-cdr3含有氨基酸序列hqaysspyt(序列編號16)；

g)mu326h-cdr1含有氨基酸序列gytftnygmn(序列編號17)；

h)mu326h-cdr2含有氨基酸序列winnnngeptyaeefkg(序列編號18)；

i)mu326h-cdr3含有氨基酸序列ardvmdy(序列編號19)；

j)mu326l-cdr1含有氨基酸序列rasesvdnygysfmh(序列編號20)；

k)mu326l-cdr2含有氨基酸序列rasnles(序列編號21)；

l)mu326l-cdr3含有氨基酸序列qqskeypt(序列編號22)。

在另一實施方案中，本發明提供包含源自鼠類單抗mu317及mu326的人源化單克隆抗體的序列的組合物，包括：

a)人源化單抗hu317-4b6包含作為序列編號24的重鏈可變區(vh)的蛋白質序列，該重鏈可變區由以下編碼：

b)hu317-4b6_vh的cdna(序列編號23)；

c)人源化單抗hu317-4b6還包含作為序列編號26的輕鏈可變區(vκ)的蛋白質序列，該輕鏈可變區由以下編碼：

d)hu317-4b6的cdna(序列編號25)；

e)人源化單抗hu326-4a3包含作為序列編號28的vh的蛋白質序列，該vh由以下編碼：

f)hu326-4a3-vh的cdna(序列編號27)；

g)人源化單抗hu326-4a3還包含作為序列編號30的vκ的蛋白質序列，該vκ由以下編碼：

h)hu326-4a3_vκ的cdna(序列編號29)；

i)hu317-4b2_vh的蛋白質序列(序列編號43)與hu317-4b2_vκ的蛋白質序列(序列編號44)；

j)hu317-4b5_vh的蛋白質序列(序列編號45)與hu317-4b5_vκ的蛋白質序列(序列編號46)；

k)hu317-1_vh的蛋白質序列(序列編號48)與編碼hu317-1_vh的cdna(序列編號47)；

l)hu317-1_vκ的蛋白質序列(序列編號50)與編碼hu317-1_vκ的cdna(序列編號49)；

m)hu326-3b1_vh的蛋白質序列(序列編號51)與hu326-3b1_vκ的蛋白質序列(序列編號52)；

n)hu326-3g1_vh的蛋白質序列(序列編號53)與hu326-3g1_vκ的蛋白質序列(序列編號54)；

o)hu326-1_vh的蛋白質序列(序列編號56)與編碼hu326-1_vh的cdna(序列編號55)；

p)hu326-1_vκ的蛋白質序列(序列編號58)與編碼hu326-1_vκ的cdna(序列編號57)；

q)源自mu317的其他人源化單抗的蛋白質序列(序列編號63-74)；

r)源自mu326的其他人源化單抗的蛋白質序列(序列編號75-82)。

在一個方面中，本發明提供包含人源化單克隆抗體的cdr序列的組合物。在相同系列的人源化單抗(諸如hu317或hu326)中可共享cdrs(參看表15-16)。以下列出非冗余cdrs：

a)h-cdr1序列gfsltsygvh(序列編號31)，為所有人源化單抗hu317及mu317重鏈所共享；

b)h-cdr3序列araygnywyidv(序列編號33)，為所有人源化單抗hu317及mu317重鏈所共享；

c)l-cdr1序列kssesvsndva(序列編號34)，為所有人源化單抗hu317-4b2、hu317-4b5及hu317-4b6輕鏈所共享；

d)l-cdr2序列yafhrft(序列編號35)，為所有人源化單抗hu317及mu317輕鏈所共享；

e)l-cdr3序列hqaysspyt(序列編號36)，為所有人源化單抗hu317及mu317輕鏈所共享；

f)hu317-4b6_vh中的h-cdr2序列viyadgstnynpslks(序列編號32)；

g)hu317-4b2_vh與hu317-4b5_vh中的h-cdr2序列viyaggstnynpslks(序列編號60)；

h)hu317-1_vh中的h-cdr2序列viwaggstnynpslks(序列編號59)；

i)hu317-1_vk中的l-cdr1序列kasqsvsndva(序列編號11)；

j)h-cdr1序列gytftnygmn(序列編號37)，為所有人源化單抗hu326及mu326重鏈所共享；

k)h-cdr3序列ardvmdy(序列編號39)，為所有人源化單抗hu326及mu326重鏈所共享；

l)l-cdr1序列rasesvdnygysfmh(序列編號40)，為所有人源化單抗hu326及mu326輕鏈所共享；

m)l-cdr2序列rasnles(序列編號41)，為所有人源化單抗hu326及mu326輕鏈所共享；

n)l-cdr3序列qqskeypt(序列編號42)，在為所有人源化單抗hu326及mu326輕鏈所共享；

o)hu326_4a3_vh中的h-cdr2序列winnnnaeptyaqdfrg(序列編號38)；

p)hu326_1及其他hu317單抗的vh中的h-cdr2序列winnnngeptyaqgfrg(序列編號62)。

在另一方面中，本發明提供抗原上人源化抗pd-1單抗的特定結合表位及其功能用途。使pd-1中配體結合所需要的六個關鍵氨基酸(aa)殘基個別突變，及使用突變體與野生型pd-1蛋白質評估結合表位。將突變使抗體結合明顯削弱的殘基視為關鍵或明顯結合表位。單抗hu317-4b5及hu317-4b6的明顯結合表位為k45及i93(基于2008pnas,105:10483進行aa編號；相當于序列編號2中的k58及i106)；及單抗hu326-3b1及hu317-4a3的明顯結合表位為i93、l95及p97(基于2008pnas,105:10483進行aa編號；相當于序列編號2中的i106、l108及p110)。

在又一方面中，本發明提供包含重組人類igg4變體的恒定區序列的組合物，該恒定區序列可連接至特定抗體(包括人源化抗pd-1單抗)的可變區，這些恒定區序列展示出優選的效應器功能及物理化學特性。序列如下：

igg4mt10的恒定區序列(序列編號88)；

a)igg4mt1的參考序列(序列編號83)；

b)igg4mt2的參考序列(序列編號84)；

c)igg4mt6的參考序列(序列編號85)；

d)igg4mt8的參考序列(序列編號86)；

e)igg4mt9的參考序列(序列編號87)。

在另一實施方案中，本發明提供檢定抗pd-1抗體功能的方法，該方法使用表達重組融合蛋白os8的質粒產生穩定細胞系hek293/os8/pd-l1或hek293/os8/pd-l2，該穩定細胞系共同表達os8(一種t細胞激活分子)及pd-1配體。使用細胞系藉由共同培養接合t細胞及pbmcs，以評估抗pd-1單抗的功能性(參看實施例3及實施例4)。或者，使用表達重組融合蛋白p3z的另一質粒產生穩定細胞系hut78/p3z，其中p3z用作分子傳感器及信號轉導介體。當由pd-1配體接合p3z時，p3z會傳導細胞內信號以激活hut78細胞中的il-2釋放。這些系統可用于評估抗pd-1單抗的抑制效果(參看實施例3)。

在一個方面中，本發明提供包含重組融合蛋白的氨基酸序列的組合物，這些序列如下：

a)os8的蛋白質序列(序列編號89)；

b)p3z的蛋白質序列(序列編號90)。

在另一方面中，本發明提供產生表達本文所描述的重組融合蛋白的穩定細胞系的方法，及使用該系統定量檢定抗pd-1單抗的功能活性的方法。

在另一實施方案中，本發明提供編碼主題蛋白質的多核苷酸。可將多核苷酸可操作地連接至異源轉錄調節序列用于表達及可并入載體、細胞等中。

在另一實施方案中，本發明提供鼠類抗pd-1抗體及人源化型式的抗pd-1抗體，這些人源化型式的抗pd-1抗體包括hu317-4b6、hu317-4b5、hu317-4b2等及hu326-4a3、hu326-3b1、hu326-3g1等，這些抗體具有抑制pd-1介導的信號轉導及激活免疫細胞的功能，這些功能觸發包括細胞因子分泌及對靶細胞(諸如癌細胞)的細胞毒性的級聯免疫反應，及提供這些抗體的此類功能用途。

在一個方面中，本發明提供激活表達pd-1的若干類型免疫細胞的人源化抗pd-1抗體，這些免疫細胞包括人類t細胞、nk細胞及pbmcs，這些免疫細胞的功能為放大免疫應答信號，調動免疫系統，及充當免疫效應細胞以便清除癌細胞及病毒感染，及提供這些抗體的此類功能用途。

在另一方面中，將人源化抗pd-1單抗用作治療劑來治療涉及由pd-1介導的細胞內信號傳導抑制免疫細胞而導致病情惡化的人類疾病，尤其是癌癥及病毒感染。

本發明的組合物對于治療癌癥、神經退化性疾病及傳染性疾病(尤其是病毒性疾病)及人類pd-1的不適宜或不利表達是其病因學或病理學的組份的其他疾患是有用的。因此，本發明提供用專屬抗pd-1蛋白質在有需要的受試者中治療癌癥或抑制腫瘤發展的方法。本發明進一步提供專屬多核苷酸制造在受試者中治療癌癥或抑制腫瘤發展的藥劑中的用途。

本發明包括所敘述特定實施方案的所有組合。本發明的進一步實施方案及可應用性的完整范疇將自下文所提供的詳細描述變得顯而易見。然而，應理解，盡管詳細描述及特定實施例指示本發明的優選實施方案，但僅以說明的方式提供這些描述及實施例，因為本發明的精神及范疇內的各種改變及修改將自此詳細描述對熟悉此項技術者變得顯而易見。出于所有目的，包括引文在內的本文所引用的所有公開物、專利及專利申請將以引用的方式全部并入本文。

實施例

實施例1：抗pd-1單克隆抗體的產生

基于常規雜交瘤融合技術(kohler與milstein1976eurjimmunol6:511-519；destgroth與sheidegger1980，jimmunolmethods35:1-21；mechetner2007methodsmolbiol378:1-13)并略作修改產生抗pd-1單克隆抗體(單抗)。選擇在酶聯免疫吸附檢定(elisa)及熒光激活細胞分選(facs)檢定中具有高結合活性的單抗以便進一步作表征。

用于免疫及結合檢定的pd-1重組蛋白質

含有全長人類pd-1cdna的表達質粒購自origene(產品編號sc117011，ncbi登錄號：nm_005018.1，中國，北京)。pcr擴增由pd-1的氨基酸(aa)1-168(序列編號1、序列編號2)組成的胞外域，在基于pcdna3.1的表達載體(invitrogen，carlsbad，ca，usa)中亞克隆，其中c末端融合至his6標簽或者融合至人類igg4重鏈的γfc域，從而產生兩個重組融合蛋白表達質粒pd-1-ec/his與pd-1-ec/fc(縮寫為pd-1/his與pd-1/fc)。圖1圖示免疫原/抗原蛋白質的示意性呈現。針對重組融合蛋白產生，在1-3升培養基(invitrogen)中將pd-1/his與pd-1/fc質粒瞬時轉染入293-f細胞，及在配備有旋轉振動器的co2培育箱中培養5-7天。收集含有重組蛋白質的上清液及在15000g下離心處理30分鐘使該上清液透明。經由使用ni-sepharosefastflow(產品編號17531801，gelifesciences，中國，上海)的固定化金屬親和層析法，然后使用hiload16/60superdex200柱(產品編號17106901，gelifesciences，中國，上海)執行大小排阻層析法純化pd-1/his。使用蛋白gsepharosefastflow柱(產品編號17061805，gelifesciences)純化pd-1/fc。用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)透析pd-1/his與pd-1/fc蛋白質兩者，并以小等分試樣儲存于-80℃冷凍箱中。

基于已公開序列(ncbi登錄號：nm_014143)，藉由genescript(中國，南京)化學合成編碼人類pd-l1的cdna。pd-l2表達質粒購自origene(產品編號sc108873，ncbi登錄號：nm_025239.2，中國，北京)。在pcdna3.1/潮霉素(產品編號v870-20，invitrogen)及pcdna3.1/v5-his(產品編號v810-20，invitrogen)中分別克隆兩個cdna。

穩定表達細胞系

藉由分別將含有pd-1、pd-l1及pd-l2的pcdna3.1質粒轉染至hut78(atcc，manassas，va，usa)及hek293(atcc)，及然后用含有每毫升200微克潮霉素(產品編號10687-010，invitrogen)或1mgg418(sigma)的培養基選擇來建立表達人類pd-1、pd-l1或pd-l2的穩定細胞系。藉由常規方法分離單個克隆，該方法為有限稀釋或從培養皿表面采集單個群落。分別使用抗pd-1、pd-l1及pd-l2抗體(產品編號12-9969、17-5983、12-5888，ebioscience，sandiego，usa)藉由western印跡及facs分析篩選所有克隆，及選擇頂級表達克隆用于facs結合檢定以篩選雜交瘤單克隆抗體，或在功能性檢定中使用。

免疫、雜交瘤融合及克隆

用含有5微克pd-1/fc的100μl佐劑(產品編號kx0210041，康碧泉公司，中國，北京)皮下注射使八至十二周大balb/c小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司，中國，北京)免疫。間隔三周注射上述免疫原兩次來實施免疫。在第二次免疫后兩周，藉由facs(下文中)評估小鼠血清的pd-1結合。選擇血清中具有高抗pd-1抗體滴度的小鼠及在腹膜內注射無任何佐劑的50微克pd-1/fc進行強化。在強化后三天，使用標準技術(gefter,m.l.等人，1977somatcellgenet，3:231-236)使脾細胞分離及與鼠類骨髓瘤細胞系sp2/0細胞(atcc)融合。

藉由elisa及facs評估抗體的pd-1結合活性

如在“flanagan,m.l.等人，2007methodsinmolecularbiology378:33-52”中所描述的并略作修改，最初藉由酶聯免疫吸附檢定(elisa)篩選雜交瘤克隆的上清液。簡而言之，在96孔板(深圳市金燦華實業有限公司，中國，深圳)中的每個孔基底上包被50微升磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中50-200納克pd-1/his或pd-1/fc蛋白質。使用hrp偶聯抗小鼠igg抗體(產品編號7076s，cellsignalingtechnology，usa與中國上海)及化學發光試劑(產品編號pa107-01，tiangen，中國)檢測及顯現elisa信號，該信號在450nm的波長處由讀板儀(phreastarfs，bmglabtech，germany)讀取。使用常規方法藉由熒光激活細胞分選(facs)進一步驗證elisa陽性抗體產生者克隆。在v形底96孔板(產品編號3897，corning，usa與中國上海)中用來自抗pd-1雜交瘤的上清液染色上文所描述的pd-1穩定表達細胞系hut78/pd-1(10⁵個細胞/孔)。為了封閉人類fc受體，用人類igg(20μg/ml)(產品編號h11296，lifeholder，usa與中國上海)預溫育細胞。用dylight^tm649標記山羊抗小鼠igg抗體(產品編號405312，biolegend，sandydiego，usa)檢測pd-1抗體及使用流式細胞儀(guavaeasycyte8ht，merck-millipore，usa與中國上海)檢測細胞熒光。

在elisa與facs檢定兩者中展示陽性信號的雜交瘤細胞的條件培養基經受功能性檢定以鑒定在基于人類免疫細胞的檢定中(在本文中)具有良好功能活性的抗體。進一步亞克隆及表征具有陽性功能活性的抗體。

亞克隆及對無血清或低血清培養基的適應

藉由受限稀釋的常規方法亞克隆來自經由elisa、facs及功能性檢定的初級篩選的陽性雜交瘤克隆。在96孔板中放入各個陽性克隆，在co2培育箱中，在具有10％胎牛血清(fbs，產品編號sh30084.03，hyclone，中國，北京)的rpmi1640培養基(產品編號sh30809.01b，hyclone，中國，上海)中培養。選擇各個有限稀釋板中的三個亞克隆及藉由facs及功能性檢定表征這些亞克隆。將經由功能性檢定所選擇的亞克隆定義為單克隆抗體。頂級亞克隆經適應在具有1-3％fbs的cdm4mab培養基(產品編號sh30801.02，hyclone)中生長。

單克隆抗體的表達及純化

在37℃的co2培育箱中，在cdm4mab培養基(產品編號sh30801.02，hyclone)或freestyle293表達培養基(產品編號12338018，invitrogen)內分別培養產生鼠類單克隆抗體的雜交瘤細胞或重組抗體質粒轉染的293-f細胞(產品編號r79007，invitrogen)5至7天。經由在10,000g下離心處理30分鐘移除所有細胞及細胞碎片收集條件培養基，并在純化前經由0.22μm薄膜過濾。遵循制造商規則，將鼠類或重組抗體加入及結合至蛋白a柱(產品編號17127901，gelifesciences)，用pbs清洗，在含有20mm檸檬酸鹽、150mmnacl的緩沖液(ph3.5)中洗脫。用1mtrisph8.0中和所洗脫物質，這些物質通常含有90％以上純度的抗體。用pbs透析或使用hiload16/60superdex200柱(產品編號17531801，gelifesciences)進一步純化經蛋白a親和純化的抗體以移除聚集體。藉由在280nm處測量吸收率或藉由bradford檢定(產品編號1856210，thermoscientific，rockford，il，usa)測定蛋白質濃度，使用所界定濃度的牛igg(產品編號23212，thermoscientific)作為標準品。在-80℃的冷凍箱中以等分試樣儲存純化抗體。

實施例2：抗pd-1抗體中的結合活性的比較

經由篩選數千種雜交瘤克隆，發明人鑒定出一些頂級單克隆抗體(單抗)，這些單克隆抗體以高特異性及強度結合人類pd-1。如elisa檢定(圖2)所示，頂級抗體中的三者引發此結合強度及特異性。facs分析結果表明，選定單克隆抗體結合至表達于細胞表面上的天然pd-1蛋白質。鼠類單抗317(mu317)、mu326及mu150展示出濃度依賴型結合活性，且其結合ec50(50％活性處的有效濃度)明顯比對照mu55更低(圖3)。

藉由表面等離子共振(spr)評定單抗結合親和力

對在elisa及facs中具有高結合活性以及在基于細胞的檢定中(在本文中)具有有力功能活性的單抗在實時結合反應中檢查結合動力學常數。使用蛋白aflow柱(產品編號17531801，gelifesciences)，然后使用hiload16/60superdex200柱(產品編號17106901，gelifesciences)執行排阻層析法從雜交瘤上清液中純化鼠類抗pd-1單抗。將純化抗pd-1抗體濃縮至pbs中0.5-1mg/ml及以等份試樣儲存于-80℃冷凍箱中。

為了測定pd-1單抗的結合親和力，使用biacore^tmt-200儀器(gelifesciences)在hbs-n緩沖液(10mmhepesph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％v/v表面活性劑p20，gehealthcare)中執行spr測量。使用標準伯胺偶聯規程產生抗小鼠fccm5生物傳感器芯片(gehealthcare)。以10μl/分鐘在抗小鼠fc表面上捕捉0.3μg/ml的pd-1單抗達1分鐘。以30μl/分鐘在抗體結合表面上注射自3.3nm連續稀釋至120nm的pd-1/fc達3分鐘，然后經歷10分鐘解離階段。使用一對一朗謬(langmuir)結合模型(biaevaluationsoftware,gelifesciences)計算結合速率(ka或kon)及解離速率(kd或koff)。以比率koff/kon來計算平衡解離常數(kd)。

如表1所示，與mu317相關的關聯序列家族成員mu326及mu517兩者具有分別等于0.324nm及0.289nm的亞納摩爾kd，此情況明顯比mu134更佳。表1中所列出的三個單抗的kon速率相似，但koff速率明顯不同，mu134中所觀察到的解離速率快得多。

表1：某些頂級抗體的結合常數

藉由spr測定抗pd-1fab的親和力

藉由pcr將抗pd-1單抗轉換成fab形式以使重鏈及輕鏈的可變區分別融合至人類igg2-ch1及κ鏈恒定區的n末端，及在pcdna3.1載體(invitrogen)中亞克隆。使用與整個抗體的瞬時表達類似的瞬時轉染方法在293-f細胞中共同表達兩個表達載體。簡而言之，pcr擴增fabκ鏈及在基于pcdna3.1的表達載體(invitrogen，carlsbad，ca，usa)中亞克隆。在另一質粒中，藉由交疊pcr將重鏈可變區(vh)以及來自人類igg2中的ch1編碼序列與c末端c-myc-his8標簽融合，及隨后在表達載體中亞克隆。在igg2重鏈中引入c232s及c233s(kabat殘基編號，kabat等人，sequenceofproteinsofimmunologicinterest，第5版，bethesda,md,nih1991)突變以防止二硫鍵交換及穩定人類igg2處于igg2-a構象(lightle等人，2010proteinsci19(4):753-762)。兩個構建體含有fab成熟序列上游的信號肽。藉由上述2個質粒共同轉染入293-f細胞實現fab的分泌表達及在轉染后6-7天收獲細胞培養物上清液。使用ni-sepharosefastflow柱(產品編號17531801，gelifesciences)，然后使用hiload16/60superdex200柱(產品編號17106901，gelifesciences)執行大小排阻層析法從細胞培養物上清液中純化帶有his8標簽的fab。將純化fab濃縮至pbs中0.5-5mg/ml及以等份試樣儲存于-80℃冷凍箱中。

針對抗pd-1fab的親和力測定，使用biacore^tmt-200儀器(gelifesciences)進行spr檢定。簡而言之，將人類pd-1/his或食蟹猴pd-1/his偶聯至已活化的cm5生物傳感器芯片(產品編號br100530，gelifesciences)以實現大約100-200個響應單位(ru)，然后用1m乙醇胺封閉未反應基團。以30μl/分鐘在spr運行緩沖液(10mmhepes,150mmnacl,0.05％tween20,ph7.4)中注射自0.12nm至90nm遞增濃度的fab樣品，且藉由減去來自空白流動室的ru來計算人類pd-1/his或猴pd-1/his上的結合響應。使用一對一朗謬結合模型(biaevaluationsoftware,gelifesciences)計算結合速率(kon)及解離速率(koff)。以比率koff/kon來計算平衡解離常數(kd)。

表18中列出spr測定的抗pd-1fab的結合親和力。各個抗pd-1fab以高親和力(kd＝0.15-1nm)結合至人類pd-1。除326-3g1外的所有fab以略微較低但相當(kd的5倍內)親和力結合至食蟹猴pd-1。

實施例3：抗pd-1抗體在人類t細胞中的功能活性

穩定細胞系的產生

逆轉錄病毒封裝細胞系pt67、人類t細胞系hut78及hek293購自美國典型培養物保藏中心(atcc,rockville,md)。根據前述操作程序(zhang等人，2005blood106:1544-1551)，使用含有pd-1基因的pfb-neo載體(strategene/agilenttech，santaclara，ca)藉由逆轉錄病毒轉導產生表達pd-1的hut78亞株hut78/pd-1。藉由將抗人類cd3單抗okt3的單鏈可變片段(scfv)(kipriyanov等人，1997，peds10:445-453)融合至小鼠cd8α的c末端域(113-220)(ncbi登錄號：np_001074579.1)建構t細胞接合物，膜錨定嵌合抗體(os8)，該小鼠cd8α的c末端域包括鉸鏈、跨膜及胞質域。藉由此舉，將抗cd3scfv錨定至細胞表面作為t細胞激活物。將人類pd-l1、pd-l2及os8cdna亞克隆入pcdna3.1載體。藉由用成對質粒共同轉染hek293及hep3b細胞(atcc)，然后用潮霉素或g418選擇10-14天來產生共同表達os8與pd-l1或pd-l2cdna兩者的穩定細胞系hek293/os8/pd-l1、hep3b/os8/pd-l1及hek293/os8/pd-l2。隨后藉由如先前所描述的有限稀釋法克隆細胞系(fullersa等人，currprotocmolbiol.，第11章：第11.8.單元，2001)。藉由將人類pd-1的胞外域及跨膜域融合至人類cd3ζ鏈的胞質域(ncbi登錄號：np_932170.1)構建稱為p3z的嵌合pd-1受體。將p3z編碼cdna序列克隆入pfb-neo，并經由逆轉錄病毒轉導輸送入hut78細胞中以產生hut78/p3z細胞。

藉由hut78/pd-1細胞中的il-2釋放測定pd-1抗體功能

為了測定抗pd-1抗體是否能阻斷pd-l1誘導的pd-1信號傳導的相互作用，用雜交瘤上清液或pd-1抗體預溫育hut78/pd-1細胞(在96孔板中每孔1.5x10⁴個細胞)15分鐘，之后在37℃下于平底板中與hek293/os8/pd-l1或hek293/os8/pd-l2細胞(每孔4x10⁴)共同培養，每孔以200μlrpmi1640生長培養基供給營養。在16-18小時后，收集共同培養物上清液。藉由elisa使用人類il-2ready-set-go！elisa試劑盒(產品編號88-7025，ebiosciences，sandiego，ca)檢定il-2。在此檢定中，用抗pd-1抗體阻斷pd-1信號傳導引發增強的tcr信號傳導及il-2產生(圖4)。

如圖5及表2所示，鼠類抗pd-1單抗mu317及mu326引發比mu30明顯更高的功能活性，抑制pd-l1誘導的pd-1信號傳導，從而導致il-2分泌增加。兩者比mu30抗體皆具有較高il-2分泌(頂線，表2)，分別為675及634pg/ml，且兩者皆具有更低的ec50(在il-2分泌誘導的50％水平上的單抗的有效濃度)。

表2：與hek293/os8/pd-l1細胞共同培養的hut78/pd-1細胞中藉由抗pd-1單抗所誘導的il-2釋放

由抗pd-1單抗結合hut78/pd-1細胞不僅阻斷了pd-l1誘導的t細胞激活，而且阻斷了pd-l2誘導的il-2釋放。表3呈現數據，這些數據展示，mu317及mu326在激活t細胞中具有比mu476高得多的效能，如il-2分泌的參數(ec50)所指示。

表3：與hek293/os8/pd-l2細胞共同培養的hut78/pd-1細胞中藉由抗pd-1單抗所誘導的il-2釋放

藉由hut78/p3z細胞中的il-2釋放的反向信號傳導測定pd-1抗體功能

在嵌合受體p3z中，用cd3ζ的胞質域替換pd-1信號傳導域。因此，p3z在與pd-l1結合后介導激活，而非像原始pd-1受體那樣產生抑制。在此檢定中，用雜交瘤上清液或pd-1抗體預溫育hut78/p3z細胞(3x10⁴/孔)15分鐘，之后在37℃于96孔平底板(總體積200μl/孔)中與hek293/pd-l1或hek293/pd-l2細胞(5x10⁴/孔)共同培養。在16-18小時后，收集上清液及藉由如上所述的elisa檢定il-2產生。

藉由在上文所描述的反向信號傳導檢定中直接讀出t細胞激活進一步證實鼠類抗pd-1單抗的功能活性。與上文所描述的結果一致，mu317及mu326在發明人所篩選的單抗中具有最佳功能活性。如表4及表5所示，就ic50及最大抑制兩方面而言，mu317及mu326比低活性單抗之一的mu37有力得多。

表4：在與hek293/pd-l1細胞共同培養的hut78/p3z細胞中藉由抗pd-1單抗抑制il-2分泌

表5：在與hek293/pd-l2細胞共同培養的hut78/p3z細胞中藉由抗pd-1單抗抑制il-2分泌

實施例4：與hek293/os8/pd-l1細胞共同培養的原代人類pbmc中藉由抗pd-1單抗激活ifn-γ分泌

為了驗證針對pd-1選定的頂級單抗是否也對原代人類免疫細胞施加功能性效果，發明人藉由使用新鮮分離的外周血單個核細胞(pbmc)檢定抗體功能，這些pbmc主要由t細胞(50-70％)、b細胞及nk細胞(15-30％)及單核細胞(2-10％)組成。根據制造商說明書，藉由使用ficoll淋巴細胞分離介質(histopaque-1077；sigma-aldrich，mo)的密度梯度離心處理而從健康供體中分離人類pbmc。所有人類血液采集遵循beigene的內部程序。隨后用抗cd3單抗(40ng/ml)okt3(產品編號16-0037，ebioscience，ca)刺激pbmcs達3天，之后進行檢定。facs分析(實施例1)顯示，激活的pbmc(原代t細胞)上的pd-1表達均有不同程度的增加，取決于不同供體(表6)。為了測定在結合tcr/cd3復合物后預激活t細胞對pd-1配體陽性腫瘤細胞的反應，在96孔平底板中將pbmcs(1x10⁴)與hek293/os8/pd-l1或hek293/os8/pd-l2細胞(3x10⁴)共同培養15-18小時。藉由elisa使用ready-set-go！elisa試劑盒(產品編號88-7316，ebiosciences)對無細胞上清液檢定ifn-γ水平，此ifn-γ水平為t細胞激活以及其他免疫細胞激活的最突出指標(thakura.等人，2012vaccine，30:4907-4920)。

圖6表明預激活pbmcs與hek293/os8/pd-l1細胞的共同培養液中存在單抗mu317及mu326導致以劑量依賴型方式增加ifn-γ累積。盡管用對照鼠類igg處理的ifn-γ的基礎水平在不同供體間各異，但由mu317或mu326處理的pbmc，在0.1至10μg/ml抗體處理范圍內，ifn-γ分泌的增加在統計學上是明顯的。與migg處理的pbmcs的對應水平相比，由介于0.1至10μg/ml濃度水平之間的mu317及mu326所誘導的ifn-γ分泌分別在供體-19的pbmcs中增加2.5至3.2倍及在供體-20的pbmcs中增加1.4至2.3倍。

實施例5：藉由抗pd1單抗激活人類nk細胞

用于nk細胞中的功能性檢定的穩定細胞系

先前報告了原代人類nk細胞響應il-2處理表達pd-1蛋白質及抑制pd-1介導的信號傳導，增強了nk細胞的細胞毒性(2010blood,116:2286)。為了定量檢定nk細胞中由抗pd-1單抗所施加的功能效果，人類nk細胞系nk92mi(atcc)及肺癌細胞系sk-mes-1(atcc)經工程設計以根據先前所描述的操作程序，藉由逆轉錄病毒轉導分別穩定表達人類pd-1及pd-l1(zhang等人，2005，blood106:1544-1551；zhang等人，2006，cancerres，66:5927)。兩個穩定細胞系被命名為nk92mi/pd-1及sk-mes-1/pd-l1。

抗pd-1抗體促進nk92mi/pd-1細胞中的ifn-γ產生及分泌

藉由定量測量nk92mi/pd-1細胞中的ifn-γ產生及分泌檢定抗pd-1單抗對nk細胞的功能活性，在96孔平底板中將這些nk92mi/pd-1細胞與肺癌細胞系sk-mes-1/pd-l1以1:2的比率共同培養，每孔總計6x10⁴個細胞。在共同培養開始前15分鐘，將抗pd-1單抗添加至nk92mi/pd-1細胞，隨后在co2培育箱中將這些細胞共同培養過夜。藉由實施例4中所描述的elisa對無細胞上清液檢定ifn-γ水平。

所有抗pd-1單抗觸發ifn-γ產生，自具有低濃度抗體處理的基線明顯增加至具有高濃度抗體處理的頂線。兩個頂級抗體mu317及mu326具有比參照抗體5c更低的ec50，顯示這些抗體具有對nk細胞有力得多的激活效果(表7)。

表7：在抗pd-1單抗及sk-mes-1/pd-l1細胞存在下，nk92mi/pd-1細胞在培養基中分泌的ifn-γ(pg/ml)

抗pd-1抗體增強由nk92mi/pd-1細胞所介導的癌細胞殺死

藉由使用cytotox96非放射性細胞毒性檢定試劑盒(promega，madison，wi)的乳酸脫氫酶(ldh)釋放檢定測定nk92mi/pd-1細胞針對sk-mes-1/pd-l1細胞的細胞毒性。簡言之，用抗pd-1單抗以最終濃度為0.004-10μg/ml的范圍將nk92mi/pd-1細胞(10⁵)預溫育15分鐘，并以效應細胞與腫瘤細胞(e:t)成5:1的比率將sk-mes-1/pd-l1細胞(2x10⁴)添加至96孔v形底板中的免疫細胞培養物中，隨后共同培養5小時。將完全腫瘤細胞裂解設定為最大細胞殺死，將各個樣品的ldh釋放檢定讀值計算為最大細胞殺死的百分比。使用基線的10％作為共同標準，跨板標準化所有樣品的細胞殺死(％)。

在上文所設定的特異性細胞毒性檢定中，所選定抗pd-1單抗以高濃度的單抗輸入引發凈腫瘤細胞殺死(＝頂線-基線)，范圍自19％至20.2％。mu317及mu326具有比mu336更低的ec50，顯示觸發nk92mi/pd-1細胞介導的腫瘤細胞殺死的較佳效力(表8)。

表8：由抗pd-1單抗誘導的nk92mi/pd-1細胞對腫瘤細胞的細胞毒性

實施例6：pd-1單抗的克隆及序列分析

在100mm組織培養皿中將分泌特定單抗的鼠類雜交瘤克隆培養至3x10⁶至10x10⁶個細胞的密度，經由在搖擺桶旋轉器中以1500rpm離心處理來收獲細胞。遵循制造商操作程序，使用ultrapurerna試劑盒(產品編號cw0581，cwbiotech，中國，北京)分離總細胞rna。在二次去離子水中再懸浮rna，藉由nanodrop(thermofisher，中國，上海)測量濃度。

基于先前所報告的序列(brocks等人，2001molmed7:461-469)，藉由invitrogen(中國，北京)合成用于單抗cdna克隆的pcr引物。使用逆轉錄酶(產品編號ah301-02，transgenbiotech，中國，北京)合成第一鏈cdna。使用pcr試劑盒(產品編號ap221-12，transgenbiotech，中國，北京)且遵循制造商操作程序進行特定單抗cdna的pcr擴增。由服務提供商對pcr產物直接測序(genewiz，中國，北京)或將pcr產物亞克隆入pcr載體(invitrogen)，隨后測序(genewiz)。

藉由序列同源性比對分析鼠類單抗的蛋白質序列。基于序列同源性及表位定位結果(實施例13)將單抗分組。基于kabat(wu,t.t.及kabat,e.a.,1970j.exp.med.132:211-250)及imgt系統(lefrancm.-p.等人，1999nucleicacidsresearch，27，209-212)，藉由序列批注及藉由基于因特網的序列分析(http://www.imgt.org/imgt_vquest/share/textes/index.html與http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)鑒定互補決定區(cdr)。如表9所示，mu317及mu326的cdr在序列長度及同源性上極為不同。

表9：mu317及mu326的cdr

實施例7：鼠類單抗的人源化

抗體3d結構的模擬

針對mu317及mu326的可變域模擬三維結構，以便鑒定對于支持cdr環結構可能重要的框架殘基。在第一輪抗體人源化中將潛在重要的框架殘基保持為原始鼠類殘基。采用先前建立的針對抗體的結構建模方法(morea等人，methods200020:267-279)基于抗體的已知規范結構模擬抗pd-1單抗的3d結構(al-lazikani等人，1997journalofmolecularbiology273:927-948)。簡而言之，在pdb數據庫(proteindatabank，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索(blast)鼠類抗體的各個可變域(vk及vh)的序列以鑒定具有已知高分辨率結構(分辨率小于2.5埃)的最同源抗體序列。針對mu317及mu326建模選定的結構模板(表10中列出)在l-cdr1、l-cdr2、l-cdr3、h-cdr1及h-cdr2中具有與待建模的靶抗體相同類別的規范環結構。若vκ及vh的模板來自不同的免疫球蛋白，則藉由主鏈原子的最小平方擬合將這些模板堆疊(pack)在一起，以形成vκ-vh界面殘基的雜合結構，該結構被swiss模型程序用作結構同源性建模的模板(kiefer等人，2009nucleicacidsresearch37，d387-d392)。在保持主鏈構象的同時，調整某些側鏈構象。在親本結構與建模結構具有相同殘基的位點處，保持側鏈構象。在殘基為不同的位點處，在模板結構、旋轉異構體庫及堆疊考慮的基礎上對側鏈構象建模。在同源性建模后，使用plop程序(jacobson等人，2002journalofphysicalchemistry106:11673-11680)細化同源性模型以最小化所有原子能量及優化vκ及vh界面。執行此步驟以改良立體化學，尤其是在來自不同抗體的結構的區段已被結合在一起的那些區域中。

表10：用于抗體結構模擬的結構模板

也針對cdr嫁接317-1及326-1模擬結構，以便導引更多輪抗體工程設計以增強人源化的程度及/或增強抗體穩定性。表10也列出選定結構模板。以與上文程序類似的方式實行結構模擬，所不同的是分別從針對317-1的pdb模板1ay1及針對326-1的模板3cxd中取得h-cdr3的可能構象，這些模板含有相似大小及軀干(torso)區域的h-cdr3。使用plop實行嫁接h-cdr3殘基的能量最小化。

人源化

對于抗pd-1單抗的人源化，發明人藉由檢索imgt(http://www.imgt.org/imgt_vquest/share/textes/index.html)及ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)網站中的人類免疫球蛋白基因數據庫搜尋與mu317及mu326可變區的cdna序列同源的人類種系igg基因。將與pd-1單抗具有高同源性的人類igvh及igvκ選為人源化模板。

原則上藉由cdr嫁接實施人源化。在第一輪人源化中，如上文所描述的，藉由模擬3d結構導引可變區的框架序列中鼠類至人類氨基酸殘基的突變，且僅使得其變化保持了總體抗體及cdr環結構的鼠類氨基酸殘基突變至人類序列。人源化單抗的初始型式為hu317-1(序列編號47-50)及hu326-1(序列編號55-58)，它們包含：重鏈，其中人源化可變重鏈(vh)融合至人類igg2恒定區(ncbi登錄號：p01859)；及輕鏈，其中人源化可變輕鏈κ(vκ)融合至人類igκc區(ncbi登錄號：p01834)。同樣地，發明人從mu317及mu326中產生嵌合抗體，這些嵌合抗體由融合至人類igg2恒定區的鼠類vh及融合至人類igκc區的鼠類vκ組成。將全嵌合抗體分別命名為ch317及ch326。如實施例1所描述表達及純化所有重組單抗。

facs及功能性檢定表明，單抗hu317-1幾乎保持了與mu317及ch317相同的結合及功能活性。可藉由在facs中使用兩個不同檢測抗體(山羊抗小鼠igg及山羊抗人類igg)的事實解讀mu317對比ch317與hu317-1之間在facs分析中的ec50差異。在兩個功能性檢定中，更同等地處理317的所有三個型式，且結果也接近于彼此(表11)。

作為針對mu326的初輪人源化的結果，單抗hu326-1保持了與親本ch326及mu326相似的功能特征，盡管facs結合檢定及基于hut78/pd-1細胞的il-2釋放檢定中的功能活性可比ch326略微更弱(表12)。

表11：藉由facs及功能性檢定比較mu317、ch317及hu317-1

表12：藉由facs及功能性檢定比較mu326、ch326及hu326-1

基于第一輪人源化，發明人進一步使hu317-1_vh及_vκ的框架(fr)中的其他鼠類氨基酸(aa)殘基個別突變，以評估對抗體功能的影響。如表13所示，hu317-1的vh中的七個個體突變及vκ中的一個突變皆具有相似功能活性。在一些vh突變中僅觀察到較小變化，諸如hu317-2_k71v在突變中具有略微較弱的抑制功能。然而，當所有鼠類氨基酸殘基一起突變成人類時(hu317-3a)，在facs及il-2釋放檢定中功能比其余突變明顯更弱。

在上文所描述的初期試驗中，除留下少數鼠類aa殘基外，hu326-1在fr中達到明顯的人源化水平。然而，hu326-1具有比mu326更弱的功能。因此，發明人實行更個別的突變，這些突變返回到鼠類殘基或者朝向人類殘基，以探索各個個體aa對單抗326功能的貢獻。表14呈現基于hu326-1_vh模板(序列編號56、序列編號57)產生的所有單個aa突變及其功能性檢定結果。大多數突變展示出比hu326-1更好的功能活性，匹配原始mu326單抗。一對突變(e46k及f95y)展示出ec50或ic50上略微較少的效力，表明那些殘基在抗體結構及功能中的作用。

表13：hu317-1框架中具有人源化突變的fab的功能活性的比較

表14：hu326-1框架中具有突變的單抗的功能活性的比較

為了探索可在人類中用作治療劑的單抗317及326的最佳可能vh及vκ序列組成，發明人考慮到抗體特征實行各種組合突變(包括在cdr序列中的一些突變)，這些抗體特征諸如fr中的人源化水平、功能活性、物理化學特性、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)及補體依賴性細胞毒性(cdc)。認為突變中的大多數未通過合格標準。經由工程設計過程，出于它們的潛在治療效用選擇人源化重組單抗中的六個：hu317-4b2(序列編號43-44)、hu317-4b5(序列編號45-46)、hu317-4b6(序列編號23-26)、hu326-3b1(序列編號51-52)、hu326-3g1(序列編號53-54)及hu326-4a3(序列編號27-30)。將單抗的cdrs與原始鼠類抗體相比較，展示于表15及表16中。

在六個單抗中，hu317-4b2、hu317-4b5及hu317-4b6在序列上彼此密切相關且在功能活性及強度上極為相似。另一方面，hu326-3b1、hu326-3g1及hu326-4a3在序列及功能性上彼此相當接近(表17-18)。在兩組單抗的各者內，盡管存在一些較小差異，但它們也共享在序列及功能以外的許多其他特征，諸如物理化學特性及結合表位(實施例10及11中所描述)。

表15：單抗317的不同型式間的cdr比較

表16：單抗326的不同型式間的cdr比較

表17：藉由elisa及facs檢定的人源化單抗的結合活性

表18：藉由spr檢定的fab的結合親和力

藉由spr的人源化抗pd-1fab的親和力測定

藉由pcr將抗pd-1單抗轉換成fab型式以使重鏈及輕鏈的可變區分別融合至人類igg2-ch1及κ鏈恒定區的n末端，及在pcdna3.1載體(invitrogen)中亞克隆。使用與整個抗體的瞬時表達類似的瞬時轉染方法在293-f細胞中共同表達兩個表達載體。簡而言之，pcr擴增fabκ鏈及在基于pcdna3.1的表達載體(invitrogen，carlsbad，ca，usa)中亞克隆。在另一質粒中，藉由交疊pcr將重鏈可變區(vh)以及來自人類igg2中的ch1編碼序列與c末端c-myc-his8標簽融合，及隨后在表達載體中次克隆。在igg2重鏈中引入c232s及c233s(kabat殘基編號，kabat等人，sequenceofproteinsofimmunologicinterest，第5版，bethesda,md,nih1991)突變以防止二硫鍵交換及穩定人類igg2處于igg2-a構象(lightle等人，2010proteinsci19(4):753-762)。兩個構建體含有fab成熟序列上游的信號肽。藉由上述2個質粒共同轉染入293-f細胞實現fab的分泌表達及在轉染后6-7天收獲細胞培養物上清液。使用ni-sepharosefastflow柱(產品編號17531801，gelifesciences)，然后使用hiload16/60superdex200柱(產品編號17106901，gelifesciences)執行大小排阻層析法從細胞培養物上清液中純化帶his8標簽的fab。將純化fab濃縮至pbs中0.5-5mg/ml及以等份試樣儲存于-80℃冷凍箱中。

為了抗pd-1fab的親和力測定，使用biacore^tmt-200儀器(gelifesciences)進行spr檢定。簡而言之，將人類pd-1/his或食蟹猴pd-1/his偶聯至已活化的cm5生物傳感器芯片(產品編號br100530，gelifesciences)以實現大約100-200個響應單位(ru)，然后用1m乙醇胺封閉未反應基團。以30μl/分鐘在spr運行緩沖液(10mmhepes,150mmnacl,0.05％tween20,ph7.4)中注射自0.12nm至90nm遞增濃度的fab樣品，且藉由減去來自空白流動室的ru來計算在人類pd-1/his或猴pd-1/his上的結合響應。使用一對一朗謬結合模型(biaevaluationsoftware,gelifesciences)計算結合速率(kon)及解離速率(koff)。以比率koff/kon來計算平衡解離常數(kd)。

表18中列出spr測定的抗pd-1fab的結合親和力。各個抗pd-1fab以高親和力(kd＝0.15-1nm)結合至人類pd-1。除326-3g1外的所有fab以略微較低但相當(kd的5倍內)親和力結合至食蟹猴pd-1。

實施例8：具有經修飾人類igg4恒定區的重組抗pd-1單抗的產生及表達

由于pd-1主要表達于激活t細胞中，連接至天然產生類型igg-fc模塊的pd-1阻斷性抗體預期取決于igg亞類會以不同程度誘導fc介導的效應器功能(諸如adcc及cdc)，從而導致消除激活t細胞(natsumea等人，2009drugdesdevelther.3:7-16)。在許多先前報告中已展示人類抗體亞類igg4，igg4具有適度adcc且幾乎沒有cdc效應器功能(mooregl等人，2010mabs，2:181-189)。另一方面，已發現天然igg4在壓力條件下(諸如在酸性緩沖液中或在上升的溫度下)不太穩定(angal,s.1993molimmunol，30:105-108；dall'acqua,w.等人，1998biochemistry，37:9266-9273；aalberse等人，2002immunol，105:9-19)。為了使pd-1⁺t細胞免遭殺死及改良抗pd-1抗體的物理化學特性，將人源化單抗連接至由突變組合所設計的igg4以具有減小的或零fcγr結合或c1q結合活性，因此減弱或消除adcc及cdc效應器功能。考慮到抗體作為生物學藥物的物理化學特性，igg4的不太理想的固有特性之一為其在溶液中動態分離兩個重鏈而形成半抗體，此舉導致經由稱為“fab臂交換”的過程在體內產生雙特異性抗體(vanderneutkolfschotenm等人，2007science，317:1554-157)。在位置228(eu編號系統)處的絲氨酸至脯氨酸的突變呈現對igg4重鏈分離的抑制(angal,s.1993molimmunol，30:105-108；aalberse等人，2002immunol，105:9-19)。已報告鉸鏈及γfc區中的一些氨基酸殘基對抗體與fcγ受體的相互作用具有影響(chappelsm等人，1991proc.natl.acad.sci.usa，88:9036-9040；mukherjee,j.等人，1995fasebj，9:115-119；armour,k.l.等人，1999eurjimmunol，29:2613-2624；clynes,r.a.等人，2000naturemedicine，6:443-446；arnoldj.n.，2007annurevimmunol，25:21-50)。此外，人類群體中一些罕見發生的igg4同等型也可引發不同的物理化學特性(brusco,a.等人，1998eurjimmunogenet，25:349-55；aalberse等人，2002immunol，105:9-19)。然而，將先前發現的所有突變及同等型集中成特定抗體并不保證理想抗體分子共享諸如上文所描述的用作治療劑的所有特征，原因可為組合突變的矛盾效果及可變區對抗體的效應器功能及物理化學特性的影響(igawat.等人，2010protengdesignselect，23:385-392；perchiaccaj.m.與tessierp.m.，2012annrevbiomoleng3:263-286)。

為了產生具有最小adcc、cdc及不穩定性的抗pd-1單抗，發明人藉由引入一定數目突變組合來修飾人類igg4的鉸鏈及γfc區，創建igg4mt1至igg4mt12。如發明人的檢定結果所示，一些經修飾的igg4變體顯然不太理想，表19中列出若干相關igg4變體及修飾后序列。本文描述這些抗體的評估。

表19：igg4變體的序列修飾

實施例9：igg4mt10沒有fcγr結合、具有最低的adcc及cdc效應器功能

當抗體結合至細胞表面靶蛋白質，然后連接至效應細胞上所表達的fcγ受體(fcγr)時，啟動adcc。很清楚地記載了人類igg1對fcγr具有比igg2及igg4明顯更高的結合親和力，尤其是結合fcγr-i及fcγr-iiia，該親和力與igg1激活adcc的強度相關聯。聯想到adcc，當抗體交聯細胞表面靶點及c1q蛋白質，繼之以補體復合物形成及靶細胞裂解的級聯反應時，激活cdc。作為adcc及cdc的代理，抗體結合至fcγr及c1q的檢定可充當adcc及cdc的基本指標。因此，發明人系統地評估單抗對所有主要fcγr的結合。

fcγr結合

藉由流式細胞術測定各種igg4突變體對fcγr的結合。簡言之，建立表達人類fcγr的一系列hek293轉染子。這些轉染子表達fcγri、fcγriia、fcγriib或fcγriiia。與fcrγ共同表達多亞基fcγr(即，fcγri及fcγriiia)。還包括多態性變體(即，fcγriiah131與r131、fcγriiiaf158與v158)。使用二體(山羊抗人類iggf(ab)'2-alexafluor488，jacksonimmunoresearch，westgrove，pa，usa)檢測抗pd-1單抗與經修飾igg4變體(表19)對fcγr⁺hek293細胞的結合。如預期，igg1型式的抗pd-1單抗(hu317-1/igg1及hu317-4b6/igg1)強有力地結合所有fcγr，包括fcγri、fcγriia(h131及r131等位基因)、fcγriib及fcγriiia(v158及f158等位基因)(表20)。有趣的是，當以相同igg4變體型式(諸如igg4mt1或者igg4mt6型式)產生兩個不同型式的人源化單抗，即hu317-1及hu317-4b6(在vh及vκ兩者中具有差異)時，它們的結合強度(mfi)自2倍至接近于100倍的范圍變化(例如，455.2/115.7＝3.9倍；13.6/1.0＝13.6倍；434.6/4.9＝88.7倍；等等，參看表20)。與其他人的先前發現一致的是，抗體的可變區對與fcr的結合具有明顯影響，因此，對諸如adcc的效應器功能施加影響(igawat.等人，2010protengdesignselect，23:385-392；perchiaccaj.m.與tessierp.m.，2012annrevbiomoleng3:263-286)。

如表20中所表明，當以igg4mt10型式產生hu317-4b6及hu326-4a3時，它們在表中所列出的pd-1單抗及igg變體型式中以及研究中已測試的許多其他人源化單抗及igg型式中具有對fcγr的最低結合活性。igg4mt10型式的hu317-4b6及hu326-4a3在這個方面的獨特性不可延伸至具有某些遠序列同源性的人源化單抗的相同家族(諸如hu317-1)，如上文所描述。

表20：由facs所測定的抗pd-1單抗對fcγr的結合強度(mfi*)

adcc

經典adcc涉及藉由抗體結合至fcγriiia或cd16而激活nk細胞。為了驗證人源化抗pd-1單抗是否誘導adcc，將nk92mi/cd16v細胞用作效應細胞，該細胞藉由共同轉導含有cd16(v158等位基因)與fcrγ基因的表達質粒自nk92mi細胞(atcc)產生，及將表達pd-1的t細胞系hut78/pd-1用作靶細胞。在96孔v形底板中將nk92mi/cd16v細胞(4x10⁴)與相等數目的hut78/pd-1細胞共同培養5小時。由前文中所描述的ldh釋放檢定測定細胞毒性。結果確認，與陽性對照相比較，hu317-4b2/igg4mt6、hu317-4b6/igg4mt6、hu317-4b6/igg4mt10及hu326-4a3/igg4mt10全部具有adcc的基礎水平(圖7)。那4個單抗之間adcc的較小差異可歸因于實驗誤差(參看圖7中的誤差棒)。

cdc

大體而言，人類igg4抗體并不經由經典路徑誘導任何cdc。使用pd-1表達t細胞系hut78/pd-1及來自健康供體的新鮮人類血清評估igg4mt10型式的抗pd-1單抗是否會觸發cdc。藉由celltiterglo檢定試劑盒(promega，中國，北京)測定cdc的細胞裂解。簡言之，在96孔平底板中，在37℃在具有抗pd-1抗體(10μg/ml)的無血清rpmi1640(invitrogen)中溫育hut78/pd-1細胞(2x10⁴)15分鐘，隨后添加正常人類血清(nhs)，終濃度為15％或50％，總體積為120μl。在37℃過夜溫育后，細胞裂解并檢定atp濃度。為了測試igg4mt10的人源化抗pd-1單抗是否能經由cdc殺死pd-1⁺原代t細胞，用抗cd3抗體okt3(40ng/ml)預激活自健康供體分離的pbmcs達3天，隨后與抗pd-1抗體加nhs共同培養。atp量與培養液中存在的細胞數目成正比。使用96孔熒光計(pherastarfs,bmglabtech)讀取熒光。以與活細胞數目成比例的相對熒光單位(rfu)表述這些結果。百分比cdc活性計算如下：％cdc活性＝[(rfu測試-rfu背景)/(完全細胞裂解下的rfu-背景下的rfu)]x100。大體而言，發明人未能檢測由結合至激活pbmcs的igg4mt10型式的抗pd-1單抗所介導的任何adcc。在高度敏感性實驗條件下，諸如使用pd-1高表達細胞系、高血清與抗體濃度，發明人在一些場合中檢測到極低水平的cdc，且不同型式與抗pd-1單抗之間不存在太多差異，此指示igg4變體型式的抗pd-1單抗保持與常見形式的igg4相同的低cdc活性或無cdc活性的特征。

實施例10：igg4mt10型式的人源化抗pd-1單抗在壓力條件下具有增強的穩定性

抗pd-1抗體在高溫及酸性條件中的穩定性

用于穩定性研究的抗pd-1抗體全部由前文中所描述的蛋白a柱及隨后的大小排阻層析法(sec)純化。在純化后，在分析性大小排阻層析法-高效液體層析法(sec-hplc)中監測純化抗體樣品的聚集體含量，這些含量處于0％-0.5％的范圍內。

對于sec-hplc分析，在等度洗脫條件下(洗脫緩沖液0.2m磷酸鈉，ph7.2)，使用tskgelg3000swxl柱(7.8x300mm，產品編號08541，tosohbioscience，中國，上海)分析抗體樣品，隨后在uv-215nm處檢測。在各次執行中，將10微升抗體樣品加載到柱上并以1ml/分鐘的流速洗脫。將抗體的二聚體或較大聚集體種類與單體種類分開，并基于uv線的積分峰面積測定二聚體及聚集體的百分比。

對于速度增強的貯存穩定性研究，將抗pd-1抗體(pbs中10-40mg/ml)保存于40-50℃的培育箱中長達4-7天，以便測試抗體在高溫條件中的穩定性。隨后在sec-hplc中針對熱誘導形成二聚體及聚集體分析抗體樣品。對于所分析的各個抗pd-1抗體，2％以下變成較高分子量種類(二聚體及聚集體)，說明抗pd-1抗體在高溫條件下具有良好穩定性。

在下游制造過程中，酸性條件中的抗體穩定性已成為關鍵性挑戰(liu等人，2010mabs2:480-499)。自蛋白a的抗體洗脫及病毒的滅活通常需要在低ph(2.5-4)條件中溫育抗體。然而，此類酸性條件可潛在引發抗體變性及聚集。已知人類igg4比igg1及igg2穩定性低(2002immunology105:9)。因此，發明人檢定用各種igg4突變體型式所產生的人源化單抗。簡而言之，藉由1:1體積的各個抗體樣品(pbs中10mg/ml)與低ph緩沖液混合研究低ph條件中的抗體穩定性，這些緩沖液含有50mm檸檬酸鈉，100mmnacl，ph分別為3.6、3.3、3.0或2.7。在室溫下溫育1小時后，藉由1:5稀釋入含有0.2m磷酸鈉(ph7.2)的sec-hplc洗脫緩沖液中和低ph條件中的抗體樣品。如上文所描述進行sec-hplc分析及量化由低ph條件所誘導的二聚體及聚集體的百分比。igg1型式的抗pd-1單抗317-4b6在生物工藝相關的酸性條件中最穩定，即使當ph值低到2.7時亦如此。在若干igg4變體中產生的抗pd-1單抗之中，hu317-4b6/igg4mt10與hu326-4a3/igg4mt10在酸性緩沖液條件下最穩定(表21)，因為酸誘導的聚集體明顯減少到與igg1型式的抗pd-1單抗317-4b6及326-4a3相當的水平(即，可溶性聚集體小于2％(表21))。

表21：在酸性緩沖液中形成及藉由sec-hplc檢定的二聚體及可溶性聚集體

實施例11：定位抗pd-1單抗的結合表位

關于pd-1/pd-l1及pd-1/pd-l2復合物的晶體結構的先前報告已經闡明而理解pd-1上配體結合所需要的關鍵氨基酸(aa)殘基(zhang等人，2004immunity，20:337-347；lind.y.等人，2008pnas105:3011-3016；lazar-molnare.等人，2008pnas，105:10483-10488)。事實上，在受體上經由點突變分析鑒定此類aa殘基中的六個是pd-l1結合所需要的。六個aa殘基中的五個也是pd-l2結合所需要的(lind.y.等人，2008pnas105:3011-3016)。基于結構導引突變分析中的信息，發明人假設，功能性單抗阻斷pd-1介導的信號傳導的最有效方式為藉由結合至六個關鍵aa殘基，從而占據配體結合所需要的結合表位而與pd-1配體競爭。為了探索該假設及理解功能性pd-1抗體的作用機制，發明人已藉由將六個關鍵aa的每一個個別地替換成ala，產生pd-1的六個突變體，即k45a、i93a、l95a、p97a、i101a及e103a(基于lind.y.等人，2008pnas105:3011-3016進行的aa殘基編號)。將突變型pd-1/fc及pd-1/his(圖1)作為模板，用于使用快速誘變系統(產品編號fm111，transgenbiotech，中國，北京)的pcr導引誘變或滾環誘變。在發明人基于pcdna的表達載體中亞克隆所有突變體，并藉由測序驗證。藉由瞬時轉染(實施例1中所描述)表達突變型及野生型pd-1蛋白質，并在培養4-6天后制備這些蛋白質。藉由western印跡分析條件培養基(cm)，以就質量與數量而言驗證pd-1蛋白質表達。在清除細胞碎片后，在elisa分析或western印跡中直接使用上清液(cm)以進行表位定位。

為了研究人源化抗pd-1單抗的結合表位，執行使用野生型(wt)及突變型(mt)pd-1的elisa檢定以評估hu317-4b5、hu317-4b6、hu326-3b1及hu326-4a3的結合活性。為了進行比較以檢查抗體結合簽名的獨特性，在研究中包括兩個參考抗體(分別來自us8008449b2及us8168757b2的參考抗體-1與參考抗體-2)。在相同elisa檢定中，在用于所有單抗的96孔板中包被相等體積的含有wt或mtpd-1的cm。使用wtpd-1結合信號的平均elisa讀數作為標準，標準化所有elisa結果。針對對某特定mtpd-1的最高抗體結合讀數(設定為100％)進一步標準化針對該特定mtpd-1的elisa結合信號。為了便于數據分析，當單抗針對特定突變體的elisa結合信號相對于wtpd-1下降到50％以下時，將該氨基酸殘基定義為明顯結合表位，因為其突變明顯消除了抗體結合。同樣地，若單抗針對特定突變體的elisa結合信號下降到25％以下，則定義為極其明顯。如圖8所示，pd-1中關鍵aa殘基中的兩者k45及i93為單抗hu317-4b5及hu317-4b6結合的明顯或極其明顯表位，且三個aa殘基i93、l95及p97為hu326-3b1及hu326-4a3的明顯或極其明顯表位。另一方面，兩個參考抗體具有可區別的結合表位，p97對于參考抗體-1明顯，而l95及p97對于參考抗體-2明顯。

有趣的是，當pd-1蛋白質在western印跡中變性后，單抗hu317-4b5及hu317-4b6仍然能夠結合至wtpd-1，雖然關鍵結合表位(k45及i93)彼此并不接近(非線性)。此表明，在western印跡過程的sds-page中變性后，pd-1蛋白質在某種程度上復性，從而允許抗pd-1單抗識別及結合它。利用此觀察結果，發明人針對上文elisa研究中所使用的所有六個抗體執行western印跡分析。western印跡的總體結果很好地印證了elisa結果，即，，其突變在elisa中引發弱結合信號的明顯或極其明顯表位也提供與其他突變型pd-1的結合相比最弱的western印跡帶(圖8)。還觀察到elisa與western印跡之間的一些較小差異，例如，由參考抗體-2在i93a及e103a上的elisa結合信號比western印跡中的信號相對更強。這可能指示，那些aa殘基還可幫助結合，因為那些aa殘基突變影響結合，但僅在壓力條件下(即，變性或喪失天然構象)。如表22中所歸納的，本發明中的抗pd-1單抗具有與其他抗pd-1抗體不同的可鑒定結合表位。

表22：抗pd-1單抗的關鍵表位的歸納*

實施例12：抗pd-1單抗在異種移植物小鼠模型中激活原代人類pbmc及抑制腫瘤生長

人源化抗pd-1單抗激活人類pbmc

貫穿人源化過程，人源化抗pd-1單抗在各種階段處保持相似功能活性，由elisa、facs及基于免疫細胞的細胞因子釋放檢定評估該功能活性。為了確認人源化單抗的最終型式的功能，發明人使用原代人類pbmcs檢定了hu317-4b5、hu317-4b6、hu326-3b1及hu326-4a3的激活功能。結果表明，盡管因個體遺傳背景不同造成四個供體之間的激活程度不同，但貫穿人源化的那些單抗維持了原始鼠類單抗激活原代pbmc的功能(圖9)。

人源化抗pd-1單抗增強基于nk細胞的對癌細胞的細胞毒性

聯想到原始鼠類單抗，人源化抗pd-1單抗hu317-4b5、hu317-4b6、hu326-3b1及hu326-3g1以劑量依賴型方式增強針對靶肺癌細胞sk-mes-1/pd-l1的nk92mi/pd-1細胞介導的細胞毒性(圖10，表23)。很明顯，原理上人源化抗pd-1單抗可發揮破壞由pd-1信號傳導所介導的免疫細胞耐受的功能，從而增強免疫細胞(例如，nk細胞及細胞毒性t淋巴細胞)的殺癌活性。

人源化抗pd-1單抗在小鼠異種移植物癌癥模型中體內激活人類pbmcs及抑制腫瘤生長

所有上述實驗證據顯示，抗pd-1單抗可在小鼠癌癥模型中起作用，這些模型利用異種移植有人類癌細胞的免疫受損小鼠，隨后植入人類pbmcs及應用單抗處理，以抑制體內癌細胞生長。實驗設計如下。在七至八周大scid雄性小鼠(vitalriverlaboratories，中國)右體側處皮下接種50％matrigel(bdbiosciences，newjesey，usa)中的3x10⁶個hep3b/os8-pd-l1細胞。在腫瘤接種后15天，使帶腫瘤大小100-250mm³的小鼠隨機分為三個處理組。瘤內注射來自2個健康供體的100微升匯集pbmcs(5x10⁵)。在pbmcs植入后3天，經由皮下注射以10mg/kg的劑量分別施用抗pd-1抗體(hu317-igg4mt2)及人類igg。抗體處理每10天重復一次，共計3次。在平行組中注射pbs作為陰性對照。在第7天開始，使用測徑規每周兩次測量腫瘤。使用以下公式計算腫瘤體積：[dx(d²)]/2，其中d表示腫瘤的大直徑，及d表示小直徑。所有動物研究皆遵循beigene動物護理及使用程序執行。

在體內研究中，盡管對照組中的60％腫瘤為自動消退，但體內實驗的剩余部分仍相當具有教益，此呈現于圖11中。在對照組中，媒劑處理組或人類igg(huigg)處理組各具有40％的腫瘤(5只小鼠中的2只)比在起始點處的基線長出更大。pbs處理組中的兩個腫瘤生長大得多(2000mm³以上，由于超過規程的腫瘤大小限制，提前終止一只帶腫瘤小鼠)。huigg處理組中的兩個腫瘤生長到800及1370mm³的大小，明顯超過164mm³的平均基線，但比pbs處理的腫瘤小。另一方面，在抗pd-1單抗(hu317-1/igg4mt2)處理組中，腫瘤完全消退或者接近于基線大小(一個腫瘤＝200mm³，該腫瘤在自pbmc植入起兩周時消退到基線的50％后緩慢重新生長)。結果顯示，上文所描述的抗pd-1單抗能在小鼠體內癌癥模型中激活抑制腫瘤細胞生長的人類免疫細胞，該結果與上文所描述的體外實驗結果一致。

序列表

<110>百濟神州有限公司

李康

張彤

宋兢

徐蘭蘭

劉琦

彭浩

<120>抗pd1抗體及其作為治療劑與診斷劑的用途

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servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr

202530

glymetasntrpvalargglnalaproglyglnglyleulystrpmet

354045

glytrpileasnasnasnasnalagluprothrtyralaglnaspphe

505560

argglyargphevalpheserleuaspthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnileserserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargaspvalmetasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval

100105110

serser

<210>29

<211>330

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>326-4a3cdna-vk

<400>29

gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccacc60

atcacctgcagagccagtgaaagtgttgataattatggctatagttttatgcactggtat120

cagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttaccgtgcatccaacctagaatct180

ggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaat240

cctgtggaagctgaggatactgcaaattattactgtcagcaaagtaaagaatatccgacg300

ttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa330

<210>30

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>326-4a3pro-vk

<400>30

aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserprogly

151015

glnargalathrilethrcysargalasergluservalaspasntyr

202530

glytyrserphemethistrptyrglnglnlysproglyglnpropro

354045

lysleuleuiletyrargalaserasnleugluserglyvalproala

505560

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileasn

65707580

provalglualagluaspthralaasntyrtyrcysglnglnserlys

859095

glutyrprothrpheglyglyglythrlysvalgluilelys

100105110

<210>31

<211>10

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>31

glypheserleuthrsertyrglyvalhis

1510

<210>32

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>32

valiletyralaaspglyserthrasntyrasnproserleulysser

151015

<210>33

<211>12

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>33

alaargalatyrglyasntyrtrptyrileaspval

1510

<210>34

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-4b6l-cdr1或cdr-l1

<400>34

lyssersergluservalserasnaspvalala

1510

<210>35

<211>7

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>35

tyralaphehisargphethr

15

<210>36

<211>9

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>36

hisglnalatyrserserprotyrthr

15

<210>37

<211>10

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>37

glytyrthrphethrasntyrglymetasn

1510

<210>38

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>326-4a3h-cdr2或cdr-h2

<400>38

trpileasnasnasnasnalagluprothrtyralaglnaspphearg

151015

gly

<210>39

<211>7

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>39

alaargaspvalmetasptyr

15

<210>40

<211>15

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>40

argalasergluservalaspasntyrglytyrserphemethis

151015

<210>41

<211>7

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>41

argalaserasnleugluser

15

<210>42

<211>8

<212>prt

<213>小家鼠（musmusculus）

<400>42

glnglnserlysglutyrprothr

15

<210>43

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-4b2pro-vh

<400>43

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile

354045

glyvaliletyralaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileserlysaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalatyrglyasntyrtrptyrileaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>44

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-4b2pro-vk

<400>44

aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslyssersergluservalserasnasp

202530

valalatrptyrglnglnlysproglyglnproprolysleuleuile

354045

asntyralaphehisargphethrglyvalproaspargphesergly

505560

serglytyrglythraspphethrleuthrileserserleuglnala

65707580

gluaspvalalavaltyrtyrcyshisglnalatyrserserprotyr

859095

thrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105

<210>45

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-4b5pro-vh

<400>45

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile

354045

glyvaliletyralaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileserlysaspthrserlysasnglnvalserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalatyrglyasntyrtrptyrileaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>46

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-4b5pro-vk

<400>46

aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslyssersergluservalserasnasp

202530

valalatrptyrglnglnlysproglyglnproprolysleuleuile

354045

asntyralaphehisargphethrglyvalproaspargphesergly

505560

serglytyrglythraspphethrleuthrileserserleuglnala

65707580

gluaspvalalavaltyrtyrcyshisglnalatyrserserprotyr

859095

thrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105

<210>47

<211>354

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>317-1cdna-vh

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acctgcactgtctctgggttttcattaaccagctatggtgtacactggatccggcagccc120

ccagggaagggactggagtggctgggggtcatatgggccggtggaagcacaaattataat180

ccctccctcaagagtcgactgaccatatcaaaagacaactccaagagccaggtttccctg240

aagatgagctctgtgaccgctgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagcctatggt300

aactactggtacatcgatgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca354

<210>48

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-1pro-vh

<400>48

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpleu

354045

glyvaliletrpalaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargleuthrileserlysaspasnserlysserglnvalserleu

65707580

lysmetserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalatyrglyasntyrtrptyrileaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>49

<211>321

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>317-1cdna-vk

<400>49

gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccacc60

atcaactgcaaggccagccagagtgtgagtaatgatgtagcttggtaccagcagaaacca120

ggacagcctcctaagctgctcattaactatgcatttcatcgcttcactggggtccctgac180

cgattcagtggcagcgggtatgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggct240

gaagatgtggcagtttattactgtcaccaggcttatagttctccgtacacgtttggcggg300

gggaccaagctggagatcaaa321

<210>50

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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151015

gluargalathrileasncyslysalaserglnservalserasnasp

202530

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354045

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505560

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65707580

gluaspvalalavaltyrtyrcyshisglnalatyrserserprotyr

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>51

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr

202530

glymetasntrpvalargglnalaproglyglnglyleulystrpmet

354045

glytrpileasnasnasnasnglygluprothrtyralaglnaspphe

505560

argglyargphevalpheserleuaspthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnileserserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargaspvalmetasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval

100105110

serser

<210>52

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>326-3b1pro-vk

<400>52

aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserprogly

151015

glnargalathrilethrcysargalasergluservalaspasntyr

202530

glytyrserphemethistrptyrglnglnlysproglyglnpropro

354045

lysleuleuiletyrargalaserasnleugluserglyvalproala

505560

argpheserglyserglyserargthraspphethrleuthrileasn

65707580

provalglualaasnaspthralaasntyrtyrcysglnglnserlys

859095

glutyrprothrpheglyglyglythrlysvalgluilelys

100105110

<210>53

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>53

glnvalglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr

202530

glymetasntrpvalargglnalaproglyglnglyleulystrpmet

354045

glytrpileasnasnasnasnglygluprothrtyralaglnaspphe

505560

argglyargphevalpheserleuaspthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnileserserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargaspvalmetasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval

100105110

serser

<210>54

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>326-3g1pro-vk

<400>54

aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserprogly

151015

glnargalathrilethrcysargalasergluservalaspasntyr

202530

glytyrserphemethistrptyrglnglnlysproglyglnpropro

354045

lysleuleuiletyrargalaserasnleugluserglyvalproala

505560

argpheserglyserglyserargthraspphethrleuthrileasn

65707580

provalglualaasnaspthralaasntyrtyrcysglnglnserlys

859095

glutyrprothrpheglyglyglythrlysvalgluilelys

100105110

<210>55

<211>342

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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agctgcaaggccagcggctacaccttcaccaactacggcatgaactgggtgagacaggcc120

cccggccagggcctggagtggatgggctggatcaacaacaacaacggcgagcccacctac180

gcccagggcttcagaggcagattcgtgttcagcctggacaccagcgccagcaccgcctac240

ctgcagatcagcagcctgaagaccgaggacaccgccgtgtacttctgcgccagagacgtg300

atggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc342

<210>56

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>326-1pro-vh

<400>56

glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr

202530

glymetasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

354045

glytrpileasnasnasnasnglygluprothrtyralaglnglyphe

505560

argglyargphevalpheserleuaspthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnileserserleulysthrgluaspthralavaltyrphecys

859095

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100105110

serser

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<213>人工序列

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cctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcaaagtaaagaatatccgacg300

ttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa330

<210>58

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>58

aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserprogly

151015

glnargalathrilethrcysargalasergluservalaspasntyr

202530

glytyrserphemethistrptyrglnglnlysproglyglnpropro

354045

lysleuleuiletyrargalaserasnleugluserglyvalproala

505560

argpheserglyserglyserargthraspphethrleuthrileasn

65707580

provalglualaasnaspthralaasntyrtyrcysglnglnserlys

859095

glutyrprothrpheglyglyglythrlysvalgluilelys

100105110

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-4b2h-cdr2或cdr-h2

<400>60

valiletyralaglyglyserthrasntyrasnproserleulysser

151015

<210>61

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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lyssersergluservalserasnaspvalala

1510

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>62

trpileasnasnasnasnglygluprothrtyralaglnglyphearg

151015

gly

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<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>326-3g1h-cdr2或cdr-h2

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trpileasnasnasnasnglygluprothrtyralaglnaspphearg

151015

gly

<210>64

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile

354045

glyvaliletrpalaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalatyrglyasntyrtrptyrileaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>65

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-3c1pro-vh

<400>65

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpleu

354045

glyvaliletrpalaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalatyrglyasntyrtrptyrileaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>66

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-3e1pro-vh

<400>66

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile

354045

glyvaliletrpalaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysserglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalatyrglyasntyrtrptyrileaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>67

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-3f1pro-vh

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glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile

354045

glyvaliletrpalaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnvalserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalatyrglyasntyrtrptyrileaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>68

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-3g1pro-vh

<400>68

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile

354045

glyvaliletrpalaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysserglnvalserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

argalatyrglyasntyrtrptyrileaspvaltrpglyglnglythr

100105110

thrvalthrvalserser

115

<210>69

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>317-3h1pro-vh

<400>69

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrsertyr

202530

glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile

354045

glyvaliletrpalaglyglyserthrasntyrasnproserleulys

505560

serargvalthrileserlysaspthrserlysserglnvalserleu

65707580

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859095

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