采用鋅指核酸酶技術破壞人bcr?abl融合基因以抑制CML細胞增殖和促使其凋亡的制作方法

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種采用鋅指核酸酶技術破壞人bcr-abl融合基因以抑制cml細胞增殖和促使其凋亡。

背景技術：

慢性粒細胞白血病(chronicmyeloidleukemia,cml)的致病根源是由于t(9；22)(q34；q11)平衡易位導致c-abl基因與bcr基因形成bcr-abl融合基因。該融合基因編碼的bcr-abl融合蛋白具有強烈的酪氨酸激酶活性，持續激活下游的ras/mapk，pi3k/akt，stat5等促增殖抑凋亡信號，導致細胞的惡性轉化。臨床上的一線治療藥物伊馬替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitors，tkis)，可以使近70％的cml慢性期患者達到血液學甚至遺傳學的完全緩解，但是，另外30％的患者由于bcr-abl激酶區突變引發耐藥，尤其是t315i突變，即使是新開發的第二代酪氨酸激酶抑制劑，也束手無策；并且，酪氨酸激酶抑制劑只能抑制abl激酶活性，不能使bcr-abl基因轉為陰性，特別是白血病干細胞(leukemiastemcell,lsc)對tkis不敏感，殘留的lsc成為復發的根源。因此，探索新的根治cml的方法迫在眉睫。

細胞本身存在一種dna損傷-修復機制，當dna雙鏈的一條鏈斷裂后，以另外一條鏈為模板進行同源修復；當dna雙鏈的兩條鏈均斷裂后，以同源染色體的dna雙鏈為模板進行同源修復，從而確保基因組的穩定。當兩條染色體的dna雙鏈均斷裂后，以非同源末端連接(nonhomologousendjoining,nhej)的方式進行修復，這種修復方式極易發生插入、缺失致移碼突變。利用細胞的這種損傷-修復原理，誕生了一種可以定點操作基因組的核酸酶修飾技術。它由特異性的dna識別結合結構域和非特異性剪切dna的核酸酶組成。該技術可以靶向特定位點的染色體dna雙鏈斷裂(double-strandedbreaks,dsb)，以供體dna為模板，促發同源定向修復(homologydirectedrepair,hdr)，或者以極易出錯的nhej方式進行修復。其中hdr可對靶基因進行定點插入、缺失、修正等操作，而nhej由于極易出錯，很容易導致靶基因發生插入、缺失和移碼突變，從而實現對靶基因的破壞(genedisruption)。

目前，主要的核酸酶修飾技術包括鋅指核酸酶(zincfingernucleases,zfns)，類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,tal-ens)和規律成簇間隔短回文重復/cas核酸酶(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatedsystems,crispr/cas)核酸酶。crispr/ca-s核酸酶技術起步較晚，該技術操作起來最簡單，但是，其潛在的完全性問題尚未得到證實。talens的主要優勢在于不受靶序列特征的限制，但是特異識別靶序列的talens片段太長，不利于后續載體的裝載和表達，并且在靶細胞內引入大量的重復序列也是未知的安全隱患。相比而言，雖然zfns構建過程較復雜，但其是人類基因編輯最確立的技術，技術成熟，免疫原性低，特異性較高，較適用于體內療法，且已在基因治療領域顯示出良好的前景，是本研究較為理想的工具。

技術實現要素：

針對以上問題，本發明一方面提供一種dna分子，其序列如seqidno:2所示。

本發明的另一方面在于提供如seqidno:2所示的dna分子作為靶點在抑制人bcr-abl融合基因表達或導致人bcr-abl基因功能喪失中的應用；所述抑制人bcr-abl基因表達或導致人bcr-abl基因功能喪失是由鋅指核酸酶介導的bcr-abl融合基因同源重組技術帶來的。

在上述技術方案中，所述人bcr-abl基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

所述的鋅指核酸酶的鋅指蛋白的核苷酸編碼序列如seqidno:3和4所示。

所述的同源重組為同源定向修復，使用到的供體dna的左臂擴增引物如seqidno:7和8所示，右臂擴增引物如seqidno:9和10所示。

本發明的有益效果是：本發明定位了bcr-abl基因中一段特異的靶序列位點dna片段，并針對此特異位點構建zfn質粒，將此質粒核轉染k562細胞可以使bcr-abl基因發生定點斷裂,并以供體dna為模板進行同源修復，使其插入8個堿基最終導致bcr-abl基因的破壞。本發明的顯著優勢表現在針對bcr-abl序列中特異的靶序列位點構建的zfn質粒可高效靶向bcr-abl基因發生dna雙鏈斷裂，以hdr方式進行修復使bcr-abl發生移碼等突變而被破壞，從而喪失促增殖、抑凋亡等惡性轉化潛能，證實zfns靶向破壞bcr-abl基因殺傷和抑制cml細胞的可行性。

附圖說明

圖1是鑒定轉染zfn質粒的k562細胞基因組dna測序結果峰圖。

圖2是k562細胞相關蛋白westernblot檢測結果圖，blank：空白對照組；gfp:空載組。

圖3是k562細胞、gfp和zfn-l/r+donor質粒核轉染k562細胞克隆形成鏡下圖，k562細胞：未處理細胞，gfp：空載質粒，zfn-l/r+donor：zfns和donor同時作用于k562細胞。

圖4是gfp和zfn-l/r+donor質粒核轉染k562細胞后細胞克隆形成數柱狀圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1、針對人bcr-abl基因特異靶位點序列的zfn質粒和donor質粒的設計與構建

一、針對人bcr-abl基因特異靶位點序列的鋅指核酸酶的設計合成

根據ncbi的查詢和拼接確定了人bcr-abl基因的基因序列(如seqidno:1所示)，通過生物信息學的方法，完成zfns設計，確定了該人bcr-abl基因的鋅指核酸酶作用的特異靶位點序列為：

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgag(如seqidno:2所示)；中間部分序列(gactac)為foki內切核酸酶切割位點，也即zfn特異敲除的靶位點序列，且本發明中所用的foki內切核酸酶為專性異二聚化foki質粒，購自addgene公司，可避免同源二聚化導致的非特異切割。

本發明中設計的針對人bcr-abl基因的鋅指核酸酶(zfns)由鋅指蛋白(zfp)和foki酶構成

(1)鋅指蛋白(zfp)的左臂(zfp-l)、右臂(zfp-r)序列

zfp-l的dna序列為(如seqidno:3所示)：

5’-gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcgccctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcaagaagaccagctgcggccgc-3’。

zfp-r的dna序列為(如seqidno:4所示)：

5’-gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcaagaagaccagctgcggccgc-3’。

在上述zfp-l和zfp-r的dna序列中，5’端的下劃線部分為sali酶切位點。3’端的下劃線部分為noti酶切位點，下劃線前面的堿基t為防止移碼添加的堿基。

(2)foki酶

foki-l質粒(質粒編號37198)和foki-r質粒(質粒編號37199)均購自addgene。

二、質粒pad-track-cmv-zfn-l的構建

按照如下步驟操作：

(1)將上述zfp-l的編碼序列交由北京華大基因公司合成；用sali酶和noti酶(takara公司)對zfp-l和pad-track-cmv(重慶醫科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室保存)進行雙酶切，37℃，1h；

(2)隨后將酶切產物分別進行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產物純化試劑盒(貨號dp204)；

(3)將酶切回收產物用t4連接酶(takara公司)進行連接，16℃，16h；

(4)連接產物轉化入dh5α感受態后在kana抗性的平板上進行分區劃線，隨后在37℃孵箱中培養12h；

(5)在上述kana平板上挑取8-10個單克隆菌落進行擴大培養；

(6)在擴增得到的菌液中提取質粒，具體步驟按照天根生化科技有限公司質粒小提試劑盒(貨號dp103)；

(7)提取得到的質粒進行測序驗證，其中得到的測序結果正確的質粒就為pad-track-cmv-zfp-l；

(8)以foki-l質粒為模板，pcr擴增foki-l質粒，以表1所列的引物進行目的片段pcr擴增反應。反應體系為25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物foki-senceprimer、1μl25μm引物foki-antisenceprimer、100ng質粒dna，加超純水至25μl。pcr擴增程序：94℃5min；94℃30s，退火溫度58℃，72℃30s，循環29次，最后72℃延伸5min；pcr擴增產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測；

表1擴增foki質粒dna目的片段引物表

注：foki-senceprimer中gcggccgc為noti酶切位點，下劃線為linker序列，5’端的aaggaaaaaa為保護堿基。foki-antisenceprimer中ctcgag為xhoi酶切位點，5’端的ccg為保護堿基。

(9)隨后將pcr產物進行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產物純化試劑盒(貨號dp204)；

(10)用xhoi酶和noti酶(takara公司)對foki-l和pad-track-cmv-zfp-l質粒進行雙酶切，37℃，1h；

(11)隨后將酶切產物分別進行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產物純化試劑盒(貨號dp204)；

(12)將它們的酶切回收產物用t4連接酶(takara公司)進行連接，16℃，16h；

(13)連接產物轉化入dh5α感受態后在kana抗性的平板上進行分區劃線，隨后在37℃孵箱中培養12h；

(15)在上述kana平板上挑取8-10個單克隆菌落進行擴大培養；

(16)在擴增得到的菌液中提取質粒，具體步驟按照天根生化科技有限公司質粒小提試劑盒(貨號dp103)；

(17)提取得到的質粒進行測序驗證，其中得到的測序結果正確的質粒就為pad-track-cmv-zfn-l。

三、質粒pad-track-cmv-zfn-r質粒的構建

過程與上述“質粒pad-track-cmv-zfn-l的構建”過程類似，不同處是將zfp-r合成后構建pad-track-cmv-zfp-r質粒，再與foki-r質粒相連接構建pad-track-cmv-zfn-r質粒。(擴增foki-r質粒所用的pcr引物\程序和產物長度同表1)。

四、同源模板donor質粒的構建

以k562細胞cdna為模板，pcr擴增donor(左臂bcr217～758，長542bp；右臂：bcr759～1523bp，長765bp)，左臂克隆入kpni和noti酶切位點，右臂克隆入noti和xbai酶切位點，將左、右臂同時克隆入質粒pad-track-cmv中。

按照如下步驟操作：

(1)以k562細胞(上海細胞所提供)cdna為模板，pcr擴增donor左臂(donor-l)，以表2所列的引物進行目的片段pcr擴增反應。反應體系為25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物donor-l-f、1μl25μm引物donor-l-r、100ngcdna，加超純水至25μl。pcr擴增程序：94℃5min；94℃30s，退火溫度56℃，72℃30s，循環29次，最后72℃延伸5min，pcr擴增產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測；

表2擴增donor左臂的引物

注：以上2條引物的下劃線處堿基分別為kpni和noti酶切位點

(2)用kpni酶和noti酶(takara公司)對donor-l的pcr產物和pad-track-cmv進行雙酶切，37℃，1h；

(3)隨后將酶切產物分別進行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產物純化試劑盒(貨號dp204)；

(4)將它們的酶切回收產物用t4連接酶(takara公司)進行連接，16℃，16h；

(5)連接產物轉化入dh5α感受態后在kana抗性的平板上進行分區劃線，隨后在37℃孵箱中培養12h；

(6)在上述kana平板上挑取8-10個單克隆菌落進行擴大培養；

(7)在擴增得到的菌液中提取質粒，具體步驟按照天根生化科技有限公司質粒小提試劑盒(貨號dp103)；

(8)提取得到的質粒進行測序驗證，其中得到的測序結果正確的質粒就為pad-track-cmv-donor-l；

(9)再以k562細胞cdna為模板，pcr擴增donor右臂(donor-r)，以表3所列的引物進行目的片段pcr擴增反應。反應體系為25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物donor-r-f、1μl25μm引物donor-r-r、100ngcdna，加超純水至25μl。pcr擴增程序：94℃5min；94℃30s，退火溫度56℃(見表3)，72℃30s，循環29次，最后72℃延伸5min，pcr擴增產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測；

表3擴增donor右臂的引物

注：以上2條引物的下劃線部分堿基分別為noti和xbai酶切位點

(10)隨后將pcr產物進行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產物純化試劑盒(貨號dp204)；

(11)用noti酶和xbai酶(takara公司)對donor-r的pcr產物和pad-track-cmv-donor-l質粒進行雙酶切，37℃，1h；

(12)隨后將酶切產物分別進行純化回收，具體步驟按照天根生化科技有限公司普通dna產物純化試劑盒(貨號dp204)；

(13)將它們的酶切回收產物用t4連接酶(takara公司)進行連接，16℃，16h；

(14)連接產物轉化入dh5α感受態后在kana抗性的平板上進行分區劃線，隨后在37℃孵箱中培養12h；

(15)在上述kana平板上挑取8-10個單克隆菌落進行擴大培養；

(16)在擴增得到的菌液中提取質粒，具體步驟按照天根生化科技有限公司質粒小提試劑盒(貨號dp103)；

(17)提取得到的質粒進行測序驗證，其中得到的測序結果正確的質粒就為pad-track-cmv-donor。

實施例2、鋅指核酸酶定點切割bcr-abl基因并插入noti酶切位點促發同源定向修復

1、凍存細胞的復蘇與培養

從液氮中取出裝有k562細胞的凍存小管，立即投入37℃的溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解；在2min內完成復溫；將細胞懸液移入無菌的離心管，加入5ml培養液，輕輕吹勻；將細胞懸液1000r/min離心5min，棄上清；向含有細胞沉淀的離心管加入1ml完全培養基。

2、細胞培養條件及傳代培養：

細胞培養條件

培養基組成成分：1640(gibcolot:1737734)

10％fbs(bilot:1616756)

傳代培養：

(1)k562細胞密度達約80％左右；

(2)用移液器反復吹打數次，至細胞全部均勻重懸在培養基中，將其轉移到離心管中；500rpm離心5min；

(3)棄上清，加入2ml培養基重懸細胞，分兩份加到有培養基的培養瓶中；

(4)晃動培養瓶使細胞分布均勻后，至37℃、5％co2培養箱中培養。

3、核轉染方法

使用lonza公司提供的電轉試劑celllinenucleofectorkitv及核轉染儀進行轉染實驗，具體操作按照試劑說明書進行。

4、細胞基因組dna提取：按照天根生化科技有限血液/組織/細胞基因組提取試劑盒(貨號：dp304)操作步驟說明，提取步驟3得到的培養48小時的細胞基因組dna。

5、目的片段pcr擴增反應和pcr產物測序驗證

以上述步驟4得到的細胞基因組dna為模板，以下表4所列的引物進行目的片段pcr擴增反應。反應體系為25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物senceprimer、1μl25μm引物anti-senceprimer、100ng基因組dna，加超純水至25μl。pcr擴增程序：94℃5min；94℃30s，退火溫度56℃，72℃30s，循環29次，最后72℃延伸5min。pcr擴增產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表4擴增bcr-abl基因組dna目的片段引物表

將pcr產物直接進行測序，將測序所得的序列結果與bcr-abl基因中的靶位點序列進行同源性比較分析，以鑒定轉染zfn質粒k562細胞基因組dna中靶位點是否被定點插入noti酶切位點。測序結果峰圖如圖1所示，k562細胞基因組dna的靶位點被定點插入noti酶切位點。

6、westernblot檢測相關蛋白變化

提取細胞總蛋白與濃度測定：

(1)收集前述步驟3得到的培養48小時的細胞到10ml離心管里，1000rpm離心10min，棄盡上清液；

(2)再加入2mlpbs于離心管中將細胞懸液，吹打混勻，1000rpm離心10min，棄盡上清液；

(3)加入1mlpbs重新混勻，將細胞懸液轉至新的1.5mlep管中；

(4)配制裂解液：pmsf：naf：navo4：ripa＝1:1:1:100，每個dish加60μl裂解液。冰上裂解30分鐘，每10分鐘振蕩一次(5-10s)；

(5)將ep管放入4℃離心機，12000rpm離心40分鐘，上清液轉移至另一個新的ep管中，記錄體積，加上清液1/4體積的5×蛋白上樣buffer，沸水煮5分鐘，-80℃超低溫冰箱保存；

(6)bca試劑盒測蛋白濃度：配制bca標準品工作液，終濃度0.5mg/ml。將標準品和待測品加入96孔板，按照說明書向每孔加工作液，振蕩混勻后37℃水浴箱孵育35分鐘，測定560nm處吸光度值，繪制標準曲線并計算蛋白濃度及上樣量(見表5)。

表5蛋白濃度測定

westernblot：

(1)配制10％分離膠加入安裝好的電泳儀中，1ml無水乙醇壓線，37℃烤箱靜置30min取出，棄去無水乙醇，配制5％濃縮膠，根據實驗需求加入適量孔梳，再將配好的濃縮膠加入，37℃烤箱靜置20min。待濃縮膠完全凝固后去掉膠條放入電泳槽中，加入內槽液(1×sds)后拔掉梳子，加入外槽液后排氣泡。每孔加入30μg蛋白樣品，兩步法電泳：80v電泳30分鐘，120v電泳90分鐘；

(2)提前預冷濕轉液并將濾紙浸泡在濕轉液中，按目的條帶分子量切膠浸潤濕轉液待用。剪與切膠大小相等的膜，甲醇活化1min，雙蒸水2min轉入濕轉液中。轉膜：按照三層濾紙、膜、膠和三層濾紙的順序放入轉膜儀，210ma恒流，小分子蛋白按照分子量大小相同時間轉膜，大分子量蛋白按照分子量×0.85時間轉膜；

(3)配制5％的封閉奶粉待轉膜結束時將pvdf膜放入進行封閉，4℃冰箱4h；

(4)tbst去除膜上封閉液放置于蠟板上，加入一抗(1:1000稀釋)后密封，4℃冰箱充分反應14-18h；

(5)取出pvdf膜，tbst洗3次/5min，加入二抗(1:2000稀釋)，4℃90分鐘后再用tbst洗2次/5min，tbs洗5min；

(6)配制發光液：a液：b液＝1:1，加在膜上避光于發光儀內顯像。

westernblot檢測相關蛋白結果如圖2所示，與空白組，空載組以及各種質粒單獨作用組對比zfn-l/r和donor共同作用于cml細胞后能使p-bcr-abl蛋白明顯下調，且bcr-abl蛋白下游的效應分子p-stat5和p-erk都明顯下調；與空白組，空載組以及各種質粒單獨作用組對比zfn-l/r和donor共同作用于cml細胞后能激活parp和caspase-3蛋白，說明其能促進cml細胞凋亡。

7、克隆形成實驗

(1)分別用空載質粒gfp和zfn-l/r+donor質粒核轉染k562細胞，并且設對照組(無質粒轉染)，每組處理設置5個復孔，每孔鋪300個細胞于24孔板，調整每孔終培養基至750μl；

(2)在每孔中加入750μl2.7％甲基纖維素，混勻；

(3)37℃、5％co2恒溫細胞孵箱內培養7-10天觀察結果。結果如圖3、4所示：zfn-l/r和donor共同作用于k562細胞后能明顯抑制k562細胞的克隆大小和克隆數量，即抑制k562細胞的克隆形成能力。

序列表

<110>重慶醫科大學

<120>采用鋅指核酸酶技術破壞人bcr-abl融合基因以抑制cml細胞增殖和促使其凋亡

<130>1

<160>12

<210>1

<211>6021

<212>dna

<213>人工序列

<223>人bcr-abl基因

<400>1

atggtggacccggtgggcttcgcggaggcgtggaaggcgcagttcccggactcagagccc60

ccgcgcatggagctgcgctcagtgggcgacatcgagcaggagctggagcgctgcaaggcc120

tccattcggcgcctggagcaggaggtgaaccaggagcgcttccgcatgatctacctgcag180

acgttgctggccaaggaaaagaagagctatgaccggcagcgatggggcttccggcgcgcg240

gcgcaggcccccgacggcgcctccgagccccgagcgtccgcgtcgcgcccgcagccagcg300

cccgccgacggagccgacccgccgcccgccgaggagcccgaggcccggcccgacggcgag360

ggttctccgggtaaggccaggcccgggaccgcccgcaggcccggggcagccgcgtcgggg420

gaacgggacgaccggggaccccccgccagcgtggcggcgctcaggtccaacttcgagcgg480

atccgcaagggccatggccagcccggggcggacgccgagaagcccttctacgtgaacgtc540

gagtttcaccacgagcgcggcctggtgaaggtcaacgacaaagaggtgtcggaccgcatc600

agctccctgggcagccaggccatgcagatggagcgcaaaaagtcccagcacggcgcgggc660

tcgagcgtgggggatgcatccaggcccccttaccggggacgctcctcggagagcagctgc720

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgagttgaacccccgcttcctgaaggacaacctg780

atcgacgccaatggcggtagcaggcccccttggccgcccctggagtaccagccctaccag840

agcatctacgtcgggggcatgatggaaggggagggcaagggcccgctcctgcgcagccag900

agcacctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtcctactccccccggagt960

tttgaggattgcggaggcggctataccccggactgcagctccaatgagaacctcacctcc1020

agcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtccccaagccccaccacctac1080

cgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgcaacagtccttcgacagc1140

agcagtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactgcccggttgtcgtgtcc1200

gaggccaccatcgtgggcgtccgcaagaccgggcagatctggcccaacgatggcgagggc1260

gccttccatggagacgcagatggctcgttcggaacaccacctggatacggctgcgctgca1320

gaccgggcagaggagcagcgccggcaccaagatgggctgccctacattgatgactcgccc1380

tcctcatcgccccacctcagcagcaagggcaggggcagccgggatgcgctggtctcggga1440

gccctggagtccactaaagcgagtgagctggacttggaaaagggcttggagatgagaaaa1500

tgggtcctgtcgggaatcctggctagcgaggagacttacctgagccacctggaggcactg1560

ctgctgcccatgaagcctttgaaagccgctgccaccacctctcagccggtgctgacgagt1620

cagcagatcgagaccatcttcttcaaagtgcctgagctctacgagatccacaaggagttc1680

tatgatgggctcttcccccgcgtgcagcagtggagccaccagcagcgggtgggcgacctc1740

ttccagaagctggccagccagctgggtgtgtaccgggccttcgtggacaactacggagtt1800

gccatggaaatggctgagaagtgctgtcaggccaatgctcagtttgcagaaatctccgag1860

aacctgagagccagaagcaacaaagatgccaaggatccaacgaccaagaactctctggaa1920

actctgctctacaagcctgtggaccgtgtgacgaggagcacgctggtcctccatgacttg1980

ctgaagcacactcctgccagccaccctgaccaccccttgctgcaggacgccctccgcatc2040

tcacagaacttcctgtccagcatcaatgaggagatcacaccccgacggcagtccatgacg2100

gtgaagaagggagagcaccggcagctgctgaaggacagcttcatggtggagctggtggag2160

ggggcccgcaagctgcgccacgtcttcctgttcaccgagctgcttctctgcaccaagctc2220

aagaagcagagcggaggcaaaacgcagcagtatgactgcaaatggtacattccgctcacg2280

gatctcagcttccagatggtggatgaactggaggcagtgcccaacatccccctggtgccc2340

gatgaggagctggacgctttgaagatcaagatctcccagatcaagagtgacatccagaga2400

gagaagagggcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggag2460

caggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaac2520

ggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaac2580

atccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcag2640

atgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaat2700

aaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaa2760

gccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaac2820

cttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaa2880

ggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaacc2940

aaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaa3000

cactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcggg3060

atcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcg3120

ctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctc3180

tacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacg3240

gtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccact3300

gtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatg3360

aagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatac3420

agcctgacggtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttg3480

aaagaagctgcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctggtgcagctccttggggtc3540

tgcacccgggagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctg3600

gactacctgagggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggcc3660

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agcaggttgatgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaa3840

tggactgcacccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggca3900

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ctgtcccaggtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatggagcgcccagaaggctgc4020

ccagagaaggtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccc4080

tcctttgctgaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagac4140

gaagtggaaaaggagctggggaaacaaggcgtccgtggggctgtgagtaccttgctgcag4200

gccccagagctgcccaccaagacgaggacctccaggagagctgcagagcacagagacacc4260

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aatgaagatgagcgccttctccccaaagacaaaaagaccaacttgttcagcgccttgatc4440

aagaagaagaagaagacagccccaacccctcccaaacgcagcagctccttccgggagatg4500

gacggccagccggagcgcagaggggccggcgaggaagagggccgagacatcagcaacggg4560

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agacagtttgactcgtccacatttggagggcacaaaagtgagaagccggctctgcctcgg4920

aagagggcaggggagaacaggtctgaccaggtgacccgaggcacagtaacgcctcccccc4980

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gaggcagtcctgggcgcaaagacaaaagccacgagtctggttgatgctgtgaacagtgac5460

gctgccaagcccagccagccgggagagggcctcaaaaagcccgtgctcccggccactcca5520

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ttgccatcagcatcctcggccctggcaggggaccagccgtcttccaccgccttcatccct5640

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aggaactccgagcagatggccagccacagcgcagtgctggaggccggcaaaaacctctac5820

acgttctgcgtgagctatgtggattccatccagcaaatgaggaacaagtttgccttccga5880

gaggccatcaacaaactggagaataatctccgggagcttcagatctgcccggcgacagca5940

ggcagtggtccggcggccactcaggacttcagcaagctcctcagttcggtgaaggaaatc6000

agtgacatagtgcagaggtag6021

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<223>人bcr-abl基因的鋅指核酸酶作用的特異靶位點

<400>2

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgag30

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<223>zfp-l

<400>3

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gactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgc120

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<210>4

<211>375

<212>dna

<213>人工序列

<223>zfp-r

<400>4

gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagc60

cgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgc120

cccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccac180

accggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaac240

ctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggc300

aagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcaagaag360

accagctgcggccgc375

<210>5

<211>78

<212>dna

<213>人工序列

<223>foki-senceprimer

<400>5

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<210>6

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<223>foki-antisenceprimer

<400>6

ccgctcgagtcagaagttgatctcgccgttgttgaacttgcgccgc46

<210>7

<211>29

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<213>人工序列

<223>donor-l-f

<400>7

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<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-l-r

<400>8

aaggaaaaaagcggccgcgggttcaactcggcgtcctcgtagtcg45

<210>9

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-r-f

<400>9

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<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-r-r

<400>10

gctctagagccaggattcccgacaggacccattttc36

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<223>senceprimer

<400>11

gacgccgagaagcccttc18

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>anti-senceprimer

<400>12

aatcctcaaaactccggggg20