2?(4?三氟甲基苯亞胺基)?5?(2?萘基亞甲基)噻唑烷?4?酮化合物及應用的制作方法

本發明涉及一種含噻唑雜環類化合物及其應用，尤其涉及一種2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物及其作為芳香烴受體激動劑的應用；屬醫藥化學領域。

背景技術：

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)是堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)超亞家族bHLH-PAS(Bhlh-PER-ARNT-SIM)成員之一，是該家族中唯一可以被配體激活的受體。進化分析顯示AhR基因在哺乳動物、兩棲動物、爬行動物和鳥類中都有存在。在人體的肝、肺、腎、胎盤、扁桃體、B淋巴細胞等各種組織和細胞中也都有存在。AhR作為一種配體激活轉錄因子，主要調控細胞色素P-450酶系家族Ⅰ相(CYP1)和一些Ⅱ相代謝酶的表達，參與一些藥物和毒物的代謝過程。同時，AhR還具有許多內源性功能，如調控細胞周期、免疫應答、細胞分化和晝夜節律等。

有研究表明芳香烴受體可以通過參與細胞增殖與凋亡、免疫代謝等過程，影響腫瘤的生長、生活、遷移和侵襲。AhR對腫瘤的調控具有雙重作用，在多環芳烴、鹵代芳烴等配體作用下，AhR可促進腫瘤生成；但苯并噻唑、氨基黃酮等化合物激活AhR后，可發揮抑癌功能，因此以芳香烴受體為作用靶點，尋找含有活性氮類的化合物不失為一種尋找抗腫瘤藥物的手段。

針對上述內容，要尋找以芳香烴受體為治療腫瘤靶點的化合物，首先需要確定該化合物是否為芳香烴受體的激動劑。通過激活芳香烴受體的信號通路，可以激活下游靶基因(如CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1)的相關外源物質代謝酶，可以促進對外源性毒物的代謝，從而保護機體不受外源物質影響。同時間接干預與芳香烴受體相關抗腫瘤信號通路，防止腫瘤的發生。由于芳香烴受體具有一個較為寬松的配體結合口袋，多種內源性和外源性的化合物都被確定為芳香烴受體的配體。確定一個化合物是否為芳香烴受體的激動劑，其方法主要通過檢測其通過信號通路對下游相關基因(CYP1A1、CYP1B1等)和相關蛋白表達水平(CYP1A1、CYP1B1等)的上調來進行確定。但經權威機構檢索查新發現：有關2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物及其作為芳香烴受體激動劑的應用目前國內外尚未見報導。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種新型含噻唑雜環類化合物即2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物及其作為芳香烴受體激動劑的應用。

本發明所述含噻唑雜環類化合物，其特征在于：該化合物是2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮，簡稱TNTO(2-(4-trifluoromethyl-phenylimino)-5-(2-naphthyl)methylene-thiazolidin-4-one)，其化學結構如通式(I)所示：

上述式(I)化合物的制備方法，是由4-三氟甲基苯胺為起始原料，通過與硫氰酸銨反應生成取代苯硫脲，再經過與乙酸乙酯的關環反應，形成噻唑雜環，最后與取代苯甲醛發生縮合反應得到最終產物，其具體合成步驟見實施例1。

本發明所述含噻唑雜環類化合物作為芳香烴受體激動劑的應用，其中所述化合物優選是2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮。

實驗證實：上述2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮，即TNTO化合物在激活芳香烴受體方面具有明顯作用，此為新型腫瘤治療藥物的開發提供了美好的前景。

為了更好的理解本發明的實質及本發明所述化合物的作用，下面結合TNTO化合物的實驗及結果，來進一步闡述其在激活芳香烴受體中的作用。

HepaWT細胞的制備：以常規方法培養HepaWT細胞，收集生長狀態良好的且處于對數期的細胞，備用。

1.10μM的TNTO化合物作用于HepaWT細胞24小時后，實時熒光定量PCR(RT-PCR)分析CYP1A1的表達(圖1)。顯示2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1基因表達量上調。

2.10μM的TNTO化合物作用于HepaWT細胞24小時后，蛋白質印跡法(Western Blot)分析CYP1A1蛋白的表達(圖2)。顯示2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1蛋白表達量上調。

通過上述實驗及其結果，可以得到以下結論：

本發明所述的化合物2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮能顯著引起CYP1A1相關基因和蛋白的表達上調，激活芳香烴受體信號通路。提示這種含有活性氮類的芳香烴受體激動劑對尋找以芳香烴受體為靶點的抗腫瘤藥物具有重要意義。

本發明公開的新型含噻唑雜環類化合物即2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物及其作為芳香烴受體激動劑的應用預示該化合物有望成為以芳香烴受體為靶點的治療腫瘤的有潛力藥物，具有很大的開發應用前景。

附圖說明

圖1為HepaWT細胞中TNTO(10μM)對CYP1A1基因表達的影響。

其中，DMSO(0.1％)為陽性對照，TCDD(1nM)為陰性對照，TNTO(10μM)化合物。

圖2為HepaWT細胞中TNTO(10μM)對CYP1A1蛋白表達的影響。

其中，DMSO(0.1％)為陽性對照，TCDD(1nM)為陰性對照，TNTO(10μM)化合物。

具體實施方式

實施例1：2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮的制備

按HCl:H2O(1:4)的比例配成鹽酸溶液。稱取11.4g(150mmol)硫氰酸銨溶于50mL鹽酸溶液中，加入12.4mL(100mmol)4-三氟甲基苯胺,攪拌條件下加熱到85℃，混合物變澄清，反應12小時候后，TLC監測反應，反應結束后，將混合物冷卻到室溫，有黏稠的油狀液體出現，用乙酸乙酯萃取，萃取液用10％鹽酸溶液，氯化鈉飽和溶液，水依次洗滌，萃取液減壓蒸除溶劑，得到4-三氟甲基苯硫脲。

將4-三氟甲基苯硫脲0.906mL(6.0mmol)，無水乙酸鈉2479mg(30mmol)，加入到20mL乙醇中,攪拌條件下，加入氯代乙酸乙酯1.28mL(12mmol)，然后在60℃下加熱6個小時，TLC檢測反應,反應結束后冷卻到室溫，出現沉淀。將反應液過濾,固體用乙醇洗滌，得到部分粗產物，濾液減壓蒸餾，然后用乙酸乙酯和水萃取，有機相合并得到更多的粗產物。粗產物在乙酸乙酯中重結晶，得到產物2-(4-三氟甲基苯基)氨基-1,3-噻唑-4-酮。

稱取2-(4-三氟甲基苯基)氨基-1,3-噻唑-4-酮130.1mg(0.5mmol)溶于3mL乙醇中，加入2-萘甲醛81.2mg(0.6mmol)，哌啶100μL，在平行合成儀上，60℃恒溫振蕩，反應24小時。反應通過TLC監測，反應完畢后冷卻到室溫，在反應過程中有大量沉淀生成，經過分析表征，沉淀即為產物2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮。過濾，用乙酸乙酯，乙醇，石油醚依次進行洗滌，若沒有沉淀生成，將溶劑蒸干，按1：2配比加入乙醇(乙酸乙酯)或者石油醚，振蕩，則大部分出現沉淀，過濾，濾渣用大量乙酸乙酯，乙醇，石油醚依次進行洗滌。仍舊沒有沉淀產生的通過硅膠柱層析進行分離，展開液由不同比例的乙酸乙酯和石油醚組成。

產物為黃色粉末，收率30％。

1HNMR(400MHz,DMSO)：δ(ppm)＝8.55(s,1H),8.00～7.90(m,3H),7.82(s,1H),7.70(s,1H),7.66～7.62(d,2H),7.58～7.55(m,1H),7.50～7.43(m,2H),7.30～7.26(d,2H)；ESI-MS,C21H13F3N2OS,m/z 399.7(M+1)。

上述2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮的合成路線如下：

實施例2：2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1基因表達量上調驗證

1.將HepaWT細胞以1×105mL-1的密度接種至直徑60mm的細胞培養皿中。24h后，將此細胞分別與2-(4-三氟甲基苯胺基)-5-(2-萘基亞甲基)-1,3-噻唑-4-酮(10μM)、DMSO(0.1％,陰性對照)、TCDD(1nM,陽性對照)在37℃含5％CO2的條件下作用24h。

2.RNA的提取：收集細胞，棄掉培養基，用預熱的PBS溶液沖洗2遍。加入適量的裂解液裂解細胞，用移液器緩慢地吹打幾次。將裂解物轉移到放在2mL收集管中的離心柱內13000rpm離心1分鐘。棄下清，將離心柱放入新2mL收集管內。

向離心柱內加入700μL Wash Buffer 1(已加無水乙醇)，13000rpm離心1分鐘。棄下清，向離心柱內加入600μL Wash Buffer 2(已加無水乙醇)，13000rpm離心1分鐘。棄下清，向離心柱內加入250μL Wash Buffer 2(已加無水乙醇)，13000rpm離心2分鐘。

洗脫：將離心柱放入新的1.5mL離心管內，取50-100μL無核酸酶的水滴加到離心柱的膜中央，13000rpm離心1分鐘，獲得樣品的總RNA溶液，做好標記后冰浴待用或-70℃長期保存。

3.RNA的純化

DNAse I消化RNA樣品，去除可能含有的基因組DNA。用無RNA酶的水將經過DNAse I消化的RNA樣品(RNA≤45μg)的體積調整為200μL。隨后加700μL buffer RLT，充分混勻。加500μL無水乙醇，用移液器輕輕吸打數次混勻后，取700μL得到的溶液過柱，輕輕蓋上管蓋，室溫10,000rpm離心15秒，去除收集管中的液體。重復，將剩余樣品過柱，每次所加的樣品體積≤700μL。將柱子轉移到新的2mL收集管后，加500μL Buffer RPE洗柱子，輕輕蓋上管蓋，室溫10,000rpm離心15秒，去除收集管中的液體，將柱子放回收集管中。加500μL 80％乙醇到柱子中，輕輕蓋上管蓋，室溫10,000rpm離心2分鐘，將收集管及液體丟棄。將柱子轉移到一新的2mL收集管，打開柱子的蓋子，最大轉速離心5分鐘，將收集管及液體丟棄。洗脫，將柱子轉移到一新的1.5mL收集管，取14μL無RNA酶的水懸空加到柱子的膜中央，輕輕蓋上蓋子，最大轉速離心1分鐘洗脫RNA。

4.測定總RNA的濃度并評價其提取質量。

使用儀器NanoDrop 2000C前用無核酸酶的水調零，測定RNA的濃度及其在260nm和280nm處的紫外吸收。RNA提取質量參考A260/A280的比值，適宜比值范圍為1.8至2.1。

5.cDNA的合成

將總RNA濃度調平后，使用第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA：

a.將無菌無核酸酶的PCR管置于冰上，將下述反應物依次加入：

b.將上述混合物放入PCR儀中，65℃孵育5分鐘，4℃孵育10分鐘，期間配制并加入：

c.混合，短暫離心。放入PCR儀中，25℃孵育5分鐘，42℃孵育60分鐘，70℃孵育5分鐘終止反應。做好標記后冰浴待用或-30℃長期保存。

6.qPCR分析

引物：CYP1A1 5’-TCTCGTGGAGCCTCATGTACCT-3’(正向引物)

5’-TGCCGATCTCTGCCAATCA-3’(反向引物)

β-actin 5’-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3’(正向引物)

5’-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3’(反向引物)

a.按下表配制PCR反應混合液(反應液配制可在室溫進行)，

b.qPCR時，取10μL RT-PCR產物加260μL H₂O配成270μL cDNA工作液，按上表配PCR反應混合液：二步法配制，對于10μL體系，若有M個樣品，先將Mix 5μL×(6M+10)與一對primers 0.25μL×(6M+10)預混合(一般每個樣品設5-6個技術重復)，分裝到5mL離心管，用電子槍依次將下述液體加入反應管中(Mix+primers)5.5μL+(cDNA工作液)4.5μL。

c.貼好封膜，短暫離心60s。

結果見圖1，顯示2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1基因表達量上調。

實施例3：2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1蛋白表達量上調驗證

1.將HepaWT細胞以1×10⁵mL^-1的密度接種至直徑60mm的細胞培養皿中。24h后，將此細胞分別與2-(4-三氟甲基苯胺基)-5-(2-萘基亞甲基)-1,3-噻唑烷-4-酮(10μM)、DMSO(5％，陰性對照)、TCDD(1nM,陽性對照)在37℃含5％CO₂的條件下作用24h。

將皿內培養液棄去，用4℃預冷好的PBS洗滌三遍。將PBS棄凈后把皿置于冰上，加入4mL PBS。用細胞刮下細胞。顯微鏡下觀察剩余細胞量。將PBS用無菌軟管吸入無菌15mL離心管中，5min，1000rpm，4℃條件下離心。離心，去除上清液，獲得細胞團。加3mL冷PBS，用槍吹散。類似洗滌重復三遍。

將上清液去除干凈，每管加50μL裂解液(1mL Ripa+10μL protein inhibitor cocktail+1μL 0.3％PMSF)，用槍吹散，移到置于冰上的1.5mL離心管內，細胞被冰上裂解30min，每隔10min渦旋一次。將裂解完畢的液體，進行離心(1300rpm，10min，4℃)。取上清，于-80℃條件下保存。應用BCA蛋白濃度測定法對細胞裂解液中的蛋白濃度進行定量。

2.電泳部分

2.1丙烯酰胺凝膠的制備

根據待分離的蛋白分子量確定所需膠的濃度。在小燒杯中依次加入高純水，十二烷基硫酸鈉(SDS)，丙烯酰胺，Tris-Base(分離膠為pH 8.8，濃縮膠為pH 6.8)，混勻，迅速加入過硫酸鈉(AP)，四甲基乙二胺(TEMED)，混勻，迅速加入玻璃板間，異丙醇液封。待30min膠凝固后，按上述順序配置濃縮膠(Tris-Base，pH 6.8)，除凈液封水，灌入濃縮膠至其溢出玻璃板，小心插入點樣梳，如有空隙，補膠，待其凝固。

2.2電泳

濃縮膠凝固后會與分離膠間形成一清晰界面，將膠板取下，放入玻璃板，使電極、膠構成回路。將膠、電極放入電解槽內，將電解槽放入電泳盒內。將1×電泳緩沖液倒入內槽至溢出，使外槽電泳液面高于內槽的鉑絲。小心拔出點樣梳，使電泳緩沖液充滿每個點樣孔。將準備好的樣品和蛋白質Marker，依次小心加入每個點樣孔。將電泳槽的蓋子蓋好。60V電泳30min左右，至溴酚藍被壓縮成細線進入分離膠，繼而用120V電泳90min，當溴酚藍(約10kDa)到達膠底部時停止電泳。

2.3電轉

取出膠板，小心打開，切除濃縮膠及溴酚藍以下部分，量尺寸，切角做標記，置于電轉緩沖液中，浸泡15min。電轉所用海綿、濾紙也用電轉緩沖液浸泡15min。根據膠的尺寸，剪取PVDF膜。依次用甲醇15s，MilliQ水2min，放于電轉緩沖液中浸泡15-60min。注意趕氣泡，關好夾子。插入電轉槽，放上準備好的冰盒，放在外槽內，倒入電轉液，蓋上蓋子。蛋白荷負電，使蛋白從低電勢的膠轉移至高電勢的膜上。電轉時間90min，電壓70V。

2.4免疫印跡

電轉完畢后，打開夾子，將PVDF膜置于搖床上，依次浸于甲醇中10s，定性濾紙干燥15min，甲醇10s，麗春紅染色2-5min，水洗可見條帶，作為中間檢測電轉是否成功。根據預染的protein marker切膜，做好標記，TBS/T洗3次，每次5min。將膜至于封閉液中，室溫下在搖床上搖1h。將膜置于相應的一抗稀釋液中，室溫下搖1h，于4℃過夜。膜用TBS/T洗3次，每次5min。之后，將膜置于二抗稀釋液中，室溫孵育1h。棄二抗，膜用TBS/T洗3次，每次5min。

2.5分析

利用雙色紅外激光成像系統(Odyssey Infrared Imaging，LI-COR)對膜進行拍攝，并用軟件ImageJ software分析條帶結果。

結果見圖2，顯示2-(4-三氟甲基苯亞胺基)-5-(2-萘基亞甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1蛋白表達量上調。