本發明涉及生物發酵技術領域，具體的涉及一種高產飼用復合酶米曲霉菌株及其應用。
背景技術：
豆粕、棉籽粕、谷朊粉、羽毛粉等農副產品中粗蛋白含量高，價格低廉，但蛋白分子量較大，不易被消化利用，氨基酸組成不平衡，有效利用率較低，其飼料添加量與利用率較低。同時，還存在多種抗營養因子，如胰蛋白酶抑制因子、脲酶等，研究發現，這些抗營養因子影響了畜禽對營養成分的消化、吸收，影響動物的健康及生產性能。而農副產品發酵過程中可產生蛋白酶、非淀粉多糖酶等多種酶活，可消除抗營養因子，把大分子量的餅粕蛋白質分解為多肽、寡肽，甚至小肽，從而增加水溶性，利于動物消化吸收。
米曲霉(aspergillusoryzae)是一種好氣性真菌，易于培養，又不產生黃曲霉素，是一類有較高利用價值的霉菌。米曲霉是美國食品與藥品管理局fda認可的使用安全的菌種之一，其在在食品業、農業、畜牧業、生物技術等方面都得到了廣泛的應用。米曲霉是一類產復合酶的菌株，除產蛋白酶外，還可產淀木聚糖酶、纖維素酶、植酸酶等。在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗蛋白、粗纖維、植酸等難吸收的物質降解，提高營養價值、保健功效和消化率。
目前，多肽的生產方法有酶解法和微生物發酵法。酶解法生產多肽較為簡單，易于操作，且生產效率較高，但所用酶制劑較多且昂貴，生產成本很高；微生物發酵法主要是利用微生物對蛋白物料進行發酵處理，既可以將有毒的成分經微生物代謝去除，又可以通過微生物發酵將植物細胞壁徹底破壞，使得營養物質更易釋放，有利于動物更快更好的吸收，而且發酵對飼料的營養成分破壞很小，不會造成營養價值降低，且成本較低、并可大量操作。但是，生產多肽需先利用微生物發酵產生蛋白酶，再用蛋白酶將難以被動物消化吸收的大分子蛋白部分降解，產生多種小分子活性多肽，其步驟較為復雜，生產效率偏低。
技術實現要素：
1.要解決的技術問題
本發明要解決的技術問題在于提供一種高產飼用復合酶的米曲霉菌株及利用其以液態發酵和酶解復合技術制備富多肽飼料添加劑的方法，其以富蛋白農副產物為材料，以米曲霉為菌種進行發酵，高效生成后續酶解所需的蛋白酶、菊粉酶等多種酶制劑，用產生的液態混合酶制劑制備富多肽飼料添加劑。該發明充分利用了微生物發酵和酶解技術的優點，大大減少了酶制劑的分離純化的生產成本，發酵結束后直接用發酵液處理富蛋白農副產物用，降低了多肽的生產成本，加快了多肽的產業化進程；且制得的飼料添加劑具有較高的營養價值和抗病性能，具有廣闊的應用前景。
2.技術方案
本發明的目的是提供一種用于發酵產酶用于制備多肽飼料的米曲霉菌株及利用該菌株發酵制得的酶來酶解蛋白制備富多肽飼料添加劑的方法。
由背景技術中可知，要制備多肽飼料，蛋白酶必不可少。另外，菊粉作為一種純天然的功能性配料，已被世界20多個國家批準為營養增補劑，廣泛運用于乳制品、飲料、低脂低熱量食品、烘培食品、保健食品。利用菊粉酶分解菊粉生產的低聚果糖低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，有防治便秘、抑制腸內腐敗物質形成、提高機體免疫力、改善脂質代謝、降低膽固醇等作用。故而，本發明所要提供的米曲霉菌株要求能高產蛋白酶和菊粉酶。
本發明采取如下技術方案：
本發明所提供的高產飼用蛋白酶和菊粉酶的米曲霉菌株具體為米曲霉(aspergillusoryzae)dj36，是從江蘇徐州市屠宰場、肉類銷售市場、豆制品廠附近土樣分離得到。具體制備過程如下：
(1)富集培養：吸取2-4ml處理后的土樣渾濁液，加入到裝有30-60ml富集培養基一的容量為250ml的三角瓶中，置于35-40℃、轉速180-200r/min條件下的恒溫搖床中培養5-7d；然后在無菌操作下量取30-50ml富集培養液至離心管中，在轉速4000-5000r/min下離心5-10min，以富集培養基二將離心后的沉淀洗至裝有40-50ml富集培養基二的250ml三角瓶中，置于35-40℃、轉速160-200r/min條件下的恒溫搖床中培養3-4d；
(2)菌株初篩：將富集后的培養液逐級稀釋到10-3、10-4、10-5、10-6，取各級稀釋的培養液0.2ml分別涂布于霉菌篩選培養基上，培養皿晾至表面沒有流動液體時，用保鮮膜將培養皿口封好，并置于35-40℃恒溫培養箱中倒置培養2-3d，然后將平板置于25-28℃恒溫培養箱中繼續倒置培養1-2d；將平板上長出的菌落點種到兩個初篩選擇培養基的相同位置，兩個初篩培養基分別為蛋白酶初篩培養基和菊粉酶初篩培養基；接種好的培養皿置于35-40℃恒溫培養箱中倒置培養2-4d；待有明顯菌落形成，觀察蛋白酶初篩培養基上有無明顯透明圈出現；將菊粉酶初篩平板上加入一定量0.1％的剛果紅染液，染色2-8min；觀察菌落周圍剛果紅顏色是否明顯變淺；將在兩種初篩平板上均出現明顯相應變化的菌株從蛋白酶初篩平板上接種出來，待進行復篩；
(3)菌株復篩：將初篩得到的菌株于復篩發酵培養基平板上劃線，置于30-37℃恒溫培養箱中培養2-3d，重復劃線培養，如連續多次觀察到菌落形態一致則認為菌株已純化；將純化后的菌株接種到固體種子培養基上，選取活性較高的菌株進行劃線傳代培養，最終得到一株產酶穩定的菌株，即得高產飼用復合酶的米曲霉。
上述高產飼用酶復合酶(蛋白酶和菊粉)的米曲霉具有以下微生物學特征：
(1)形態學特征
本發明所述菌株，菌落在pda平板上呈輻射狀快速生長，菌絲發達，初期菌絲表面疏松、平坦，菌落正面白色，接著因產生分生孢子菌落中間部位而呈現黃綠色，以后逐漸增多，呈褐色或淡綠褐色，菌落背面有褶皺，無色。菌落無滲出液，無特殊氣味。在放大400倍的光學顯微鏡下觀察，菌絲發達，有隔膜，菌絲頂端直接產生孢子梗，分生孢子成鏈狀生于小梗上，分生孢子頭呈球形。
(2)分子鑒定
以菌株基因組為模板，pcr擴增到18srdna特異性片段，經過測序，所得序列通過blast與genebank中核酸數據進行分析比對，鑒定為米曲霉(aspergillusoryzae)。
上述菌株已于2017年2月10日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編：100101)，保藏號為cgmccno.13575，分類命名為米曲霉dj36(aspergillusoryzaedj36)。
本發明還提供了一種上述高產飼用復合酶的米曲霉菌株應用于以液態發酵和酶解復合技術制備富多肽飼料添加劑的方法，包括如下步驟：
步驟1、制備米曲霉菌的單孢子菌懸液：
將米曲霉菌菌種活化后，用含有0.01％v/v吐溫80的0.75％無菌生理鹽水將孢子洗下，放到裝有50ml無菌生理鹽水和無菌玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩20-30min，待孢子充分打散后，調節孢子懸液中孢子的含量為1.0×108cfu/ml，即得單孢子菌懸液；
步驟2、液體菌種制備：
按照5％-10％v/v的接種量，將步驟1中所得的單孢子菌懸液接種在裝有30-50ml已滅菌的種子培養基的250ml三角燒瓶中，培養基中加入20粒已滅菌的玻璃珠，瓶口以6-8層紗布封口，置于空氣搖床中擴大培養，設定轉速為180-220r/min，溫度為26-34℃，培養2-4d，得到二級種子培養液；
步驟3、液態發酵：
在發酵容器中裝入發酵培養基，121℃滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，取步驟2所得的二級種子培養液接種于發酵容器中，初始發酵控制條件為：溫度28-32℃，發酵培養基初始ph5.5-6.5；發酵2-4d，發酵溫度降為25-28℃；發酵至3d開始補料每隔12h補料一次，共補料2-3次；發酵6d時，將發酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調節發酵液ph值；發酵6d時，添加滅過菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液；繼續發酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發酵液ph調節至7.0-7.5，維持4h，結束發酵；
步驟4、發酵液酶解雜蛋白：
發酵結束后，發酵液導入酶解罐中，向發酵液中添加麩皮、谷糠、豆粕粉、谷朊粉，使發酵液變成濃稠狀，調節其ph值為5.5，控制溫度為50℃，維持4-6h，中間攪拌2-3次；調節ph到4.0-7.0，控制溫度為50℃，維持4-6h，得到發酵酶解料；
步驟5、干燥、粉碎、包裝：
酶解結束后，采取55-65℃低溫烘干的方法對以上發酵酶解料進行干燥處理，粉碎后過150-200目篩，成品包裝得到富多肽飼料添加劑。
進一步地，所述步驟3中當所需發酵的二級種子培養液較少時，所述發酵容器為三角瓶，具體步驟為：將裝有發酵培養基200-300ml的1000ml三角瓶置于121℃下滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，將步驟2所得的二級種子培養液按照5-10％的接種量接種，置于搖床上震蕩發酵；初始發酵溫度28-32℃，發酵培養基初始ph5.5-6.5，搖床震蕩頻率180-200r/min；發酵2d-4d，發酵溫度降為25-28℃，搖床震蕩頻率不變；發酵至3d開始補料，每次補料20-30ml，每隔12h補料一次，共補料2-3次；發酵6d時，將發酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調節發酵液ph值為5.0-6.5，搖床轉速降至160-180r/min；發酵6d時，添加滅過菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液20-30ml；繼續發酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發酵液ph調節至7.0-7.5，維持4h，結束發酵。
進一步地，所述步驟3中當所需發酵的二級種子培養液較多時，所述發酵容器為發酵罐，具體步驟為：在15l的發酵罐中裝入發酵培養基8-10l，發酵罐夾套升溫至95℃，再將蒸汽直接通入發酵培養基中，121℃滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，取步驟2所得的二級種子培養液400-1000ml以火焰法接種于發酵罐中，發酵罐壓為0.05mpa；初始發酵控制條件為：溫度28-32℃，發酵培養基初始ph5.5-6.5，無菌空氣通風比1:0.6-0.8(v/v)，攪拌轉速260-300r/min，保持溶氧20-30％；發酵過程觀察泡沫情況，并流加以消泡劑泡敵，消除培養過程中產生的過多泡沫；發酵2-4d，發酵溫度降為25-28℃，無菌空氣通風比1:0.4-0.6(v/v)，通過自動流加氨水調節ph，控制ph于6.0-6.5；發酵至3d開始補料，每次補料500-1000ml，每隔12h補料一次，共補料2-3次；發酵6d時，將發酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調節發酵液ph值為6.0-7.0，降低無菌空氣通風比1：0.4-0.6(v/v)，攪拌轉速降至200-240r/min；發酵6d時，添加滅過菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液1-2l；繼續發酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發酵液ph調節至7.0-7.5，維持4h，結束發酵。
具體地，步驟2中所述種子培養基的制備方法為：分別取蛋白胨5-10g，黃豆粕粉5-10g，谷朊粉10-20g，麩皮粉5-10g，葡萄糖10-15g，淀粉10-20g，(nh4)2so41g，吐溫-800.5ml，無機鹽營養液10ml，充分混合后，調節ph5.0-6.5，補充去離子水至1000ml，再置于121℃下滅菌15min。
具體地，步驟3中所述發酵培養基中含有菊粉；所述發酵培養基的制備方法為：分別取黃豆粕粉10-20g，谷朊粉10-20g，菊粉5-10g，麩皮粉5-10g，淀粉10-20g，(nh4)2so41g，吐溫-800.5ml，玉米漿15-30g，無機鹽營養液10ml，充分混合后，補充去離子水至1000ml，再置于121℃下滅菌15min。
3.有益效果
(1)本發明采用米曲霉作為菌種，充分利用了微生物發酵的優點，且米曲霉菌易于培養，使用安全，又不產生黃曲霉素。本發明具體采用高產伺用復合酶米曲霉，其制得的復合酶酶活力高，且復合酶中的蛋白酶具有較高的熱穩定性和廣泛的耐酸范圍，在加工過程中不易失活，適合在飼料中使用；且米曲霉發酵產生的復合酶中還含有菊粉酶，在其發酵培養基中添加菊粉，菊粉酶分解菊粉產生低聚果糖，添加在飼料中，有利于增強飼料的營養價值和抗病性能。
(2)本發明采用米曲霉菌和富蛋白農副產品共同發酵產生大量蛋白酶、菊粉酶等多種酶活，為后期酶解過程提供主要作用酶，實現兩種技術的有效關聯。
(3)本發明結合液態發酵技術和酶解技術，先采用液態發酵技術發酵米曲霉菌種和農副產品，產生大量蛋白酶、菊粉酶等多種酶活；再采用酶解技術，利用上述多種酶活將富含粗蛋白的農副產品分解，消除抗營養因子，把大分子量的餅粕蛋白質分解為多肽、寡肽，甚至小肽，從而增加水溶性，利于動物消化吸收。可以節約大量的酶制劑，降低多肽的生產成本，加快多肽的產業化進程。
本發明以富蛋白農副產物為材料，米曲霉為菌種進行發酵，高效生成后續酶解所需的蛋白酶、菊粉酶等多種酶制劑，用產生的液態混合酶制劑制備富多肽飼料添加劑。充分利用了微生物發酵和酶解技術的優點，大大減少了酶制劑的使用，減少了酶制劑的分離純化的生產成本，降低了多肽的生產成本，加快了多肽的產業化進程；且制得的飼料添加劑具有較高的營養價值和抗病性能，具有廣闊的應用前景。
附圖說明
圖1為實施例中復篩后得到的純化的米曲霉菌株；
圖2為實施例1中米曲霉所產蛋白酶在不同溫度下的活性測定折線圖；
圖3為實施例1中米曲霉蛋白酶于50℃在不同ph條件下的活性測定折線圖；
圖4為實施例1中米曲霉蛋白酶于酸性(ph5.0)的條件下在不同溫度下的熱穩定性測定折線圖；
圖5為實施例1中米曲霉蛋白酶在于30℃在不同ph條件下的ph穩定性測定折線圖。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。
實施例1
1.高產伺用復合酶蛋白酶與菊粉酶菌株的制備
(1)采樣及樣品處理：
從江蘇省徐州市屠宰場、肉類銷售市場、豆制品加工廠、菊芋種植地等富含蛋白質及菊芋的地方取土樣20份。稱取固體土樣5g，放入裝有玻璃珠及100ml已滅菌的生理鹽水的三角瓶中，以180r/min的轉速室溫振蕩20-30min，制成懸液備用。
(2)富集培養：
吸取2-4ml處理后的土樣渾濁液，加入至裝有30-60ml富集培養基一的容量為250ml的三角瓶中，置于35-40℃、轉速180-200r/min下恒溫搖床中培養5-7d；然后無菌操作下量取30-50ml富集培養液至離心管中，4000-5000r/min離心5-10min，倒掉上清液，以富集培養基二將離心后的沉淀洗至裝有40-50ml富集培養基二的250ml三角瓶中，再次置于35-40℃、轉速160-200r/min的恒溫搖床中培養3-4d。
上述富集培養基一的制備方法為：分別取豆粕粉1g、谷朊粉0.5g，無機鹽營養液1ml，混合均勻后補充水至100ml，調節ph值為4.5；在121℃溫度下滅菌15min，自然冷卻后，加入過濾除菌的氨芐青霉素至溶液最終濃度為50mg/l。
上述富集培養基二的制備方法為：分別取菊芋粉2g、無機鹽營養液1ml，混合均勻后補充水至100ml，調節ph值為4.5；在121℃溫度下滅菌15min，自然冷卻后，加入過濾除菌的氨芐青霉素至溶液最終濃度為50mg/l。
上述制備方法中無機鹽營養液的制備方法為：分別取(nh4)2so45g，nano32.0g，尿素2g，k2hpo41.5g，cacl21.5g，mgso40.1g，feso4·7h2o0.01g，mns04·h201.6mg，zns04·h2o0.05g，cocl20.5mg，去離子水1000ml，混合均勻。
(3)初篩：
將富集后的培養液逐級稀釋到10-3、10-4、10-5、10-6，取各級稀釋的培養液0.2ml分別涂布于霉菌篩選培養基上，培養皿晾至表面沒有流動液體時，用保鮮膜將培養皿口封好，并置于35-40℃恒溫培養箱中倒置培養2-3d，然后將平板置于25-28℃恒溫培養箱中繼續倒置培養1-2d。
將平板上長出的菌落點種到兩個初篩選擇培養基的相同位置，兩個初篩培養基分別為蛋白酶初篩培養基和菊粉酶初篩培養基。接種好的培養皿置于35-40℃恒溫培養箱中倒置培養2-4d。待有明顯菌落形成，觀察蛋白酶初篩培養基上有無明顯透明圈出現。將菊粉酶初篩平板上加入一定量0.1％的剛果紅染液，染色2-8min，倒掉染色液。觀察菌落周圍剛果紅顏色是否明顯變淺。將在兩種初篩平板上均出現水解圈的菌株從蛋白酶初篩平板上接種出來，待進行復篩。
上述霉菌篩選培養基的制備方法為：分別取pda培養基800ml，無機鹽營養液10ml，混合均勻后，補水至1000ml，再加入瓊脂粉15g并充分混合；在121℃溫度下滅菌15min后加入孟加拉紅0.01-0.02g，氯霉素0.1-0.2g，混合均勻。
所述pda培養基包括馬鈴薯浸出液和蔗糖，具體的制備方法為：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個小時，再用紗布過濾取濾液，補充水至1000ml，然后加入20g蔗糖并混合均勻。
上述蛋白酶初篩培養基的制備方法為：分別取pda培養基100ml，干酪素1-2g，無機鹽營養液1ml，瓊脂粉1.5g，混合均勻后，調節ph值為5.0-5.5；培養基在121℃溫度下滅菌20min后，充分搖勻，隨著搖動，在60-70℃下倒入平板中。
上述菊粉酶初篩培養基的制備方法為：分別取菊粉1-2g，酵母粉0.1-0.2g，無機鹽營養液1ml，瓊脂1.5g，混合均勻后，加蒸餾水定容至100ml，調節ph值為4.5；在121℃溫度下滅菌15min。
(3)復篩
初篩得到的菌株于復篩發酵培養基平板上劃線，置于30-37℃恒溫培養箱中培養2-3d，重復劃線培養三次以上，如連續多次觀察到菌落形態一致則認為菌株已純化。本發明所述菌株如圖1所示，編號為dj36。
將初篩得到的菌株純化后，接種到固體種子培養基上，35-40℃下培養3-5d，切取1平方厘米的菌苔接種到裝有30-50ml液體種子培養基的250ml三角瓶中，在160-180r/min轉速下37-40℃進行液體震蕩培養。培養3-4d后，按照6-10％(v/v)的接種量，將液體種子接種到液體發酵培養中，在160-180r/min轉速下30-37℃進行液體震蕩發酵培養。發酵培養3-5d，將發酵液在8000r/min轉速下離心10min后，收集上清液并測定蛋白酶活性和菊粉酶活性，結果如表1所示。選取活性較高的菌株(dj36)進行劃線傳代培養，最終得到一株產酶穩定且有較高酶活的蛋白酶、菊粉酶高產菌株。純化的菌株接種于pda斜面培養基上，在4℃條件下保藏。
上述復篩發酵培養基的制備方法為：分別取菊粉2-3g，無機鹽營養液1ml，蛋白胨1g，大豆蛋白1-2g，麩皮粉2-3g，吐溫-800.5ml，無機鹽營養液1ml，混合均勻后，補充去離子水至100ml；在121℃溫度下滅菌15min。
上述固體種子培養基的制備方法為：分別取pda培養基99ml，無機鹽營養液1ml，瓊脂粉1.5g，混合均勻后，調節ph值為5.0；在121℃溫度下滅菌15min。
上述液體種子培養基的制備方法為：分別取菊粉2-3g，大豆蛋白1g，蛋白胨1g，無機鹽營養液1ml，混合均勻后，補充去離子水至100ml；在121℃溫度下滅菌15min。
上述菊粉酶活力的測定步驟為：發酵結束后，過濾，得到的濾液在8000r/min的轉速下離心20min；收集濾液作為粗酶液，取適當稀釋的粗酶液0.2ml與0.8ml2％菊糖(用0.1mol/l，ph4.5醋酸緩沖液配制)在60℃條件下反應20min后，于100℃加熱5min終止酶反應，然后取1ml的反應液用dns顯色法測定產物中還原糖的量。在相同的條件下，用100℃滅活的粗酶液作為對照。菊粉酶酶活力定義為：在ph4.5，60℃的環境中反應20min，每分鐘轉化成1μmol還原糖的酶量為一個酶活單位。
上述發酵液中蛋白酶活的測定步驟為：采用folin-酚法測定，以酪蛋白(2％)為底物，1ml酶液在ph5.0、40℃下，一個蛋白酶活力單位(u)定義為每分鐘釋放出1μg酪氨酸所需的酶量。
表1各菌株粗酶液酶活
2.菌株的鑒定
上述高產飼用復合酶(蛋白酶和菊粉酶)的米曲霉dj36具有以下微生物學特征：
(1)形態學特征
本發明所述菌株dj36，菌落在pda平板上呈輻射狀快速生長，菌絲發達，初期菌絲表面疏松、平坦，菌落正面白色，接著因產生分生孢子菌落中間部位而呈現黃綠色，以后逐漸增多，呈褐色或淡綠褐色，菌落背面有褶皺，無色。菌落無滲出液，無特殊氣味。在放大400倍的光學顯微鏡下觀察，菌絲發達，有隔膜，菌絲頂端直接產生孢子梗，分生孢子成鏈狀生于小梗上，分生孢子頭呈球形。
(2)分子鑒定
以上形態特征與《真菌鑒定手冊》中米曲霉的形態特征相符合；根據其分子生物學特征，以菌株dj36基因組為模板，pcr擴增到18srdna特異性片段，經過測序，所得序列通過blast與genebank中核酸數據進行分析比對，鑒定為米曲霉(aspergillusoryzae)。米曲霉具有豐富的蛋白酶系，是美國食品與藥物管理局和美國飼料公司協會公布的安全微生物菌株之一，也是國內醬油等發酵食品生產的主要菌株。因此，米曲霉用于發酵制備富多肽蛋白飼料是非常安全的。
3.米曲霉產酶中蛋白酶的特性研究
(1)米曲霉蛋白酶的最適作用溫度
最適溫度的測定：在0.02mol/l，ph4.5的醋酸緩沖液中，不同溫度(30-65℃)下進行酶促反應。酶在不同溫度下的測定結果如圖2所示。在溫度30-50℃之間，酶活性隨溫度上升大幅增加，但當溫度高于50℃時，酶活性逐漸降低。故酶最適作用溫度為50℃。在較高的溫度下酶保持高活性，在蛋白酶的應用中具有重要意義；溫度高可以加快酶促反應；另一方面，較高的溫度可以有效防止腐敗微生物大量繁殖，有效防止腐敗變質。
(2)米曲霉蛋白酶最適作用ph
配制一系列ph范圍為3.0-11.0的緩沖溶液，將米曲霉蛋白酶適當稀釋后，于50℃下測定其在不同ph條件下的活性，結果見圖3。由圖3可以看出，米曲霉蛋白酶系在ph4.0-7.0廣泛范圍內都具有較高的活力，該范圍內酶活力均在90％以上；因此該酶適合在飼料中應用。
(3)溫度對米曲霉蛋白酶活性的影響
分別在30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃下測定米曲霉蛋白酶在酸性(ph5.0)的熱穩定性。結果圖4所示，蛋白酶在60℃以下比較穩定，經過60min的孵育后，殘余酶活性都在80％以上。故該蛋白酶屬于耐熱性酶，在加工過程中，高溫環境下不易失活，適合在飼料中使用。
(4)酸堿性對米曲霉蛋白酶活性的影響
米曲霉蛋白酶ph穩定性測定是將酶液加入到20ml的不同ph值緩沖液中，于30℃下保溫1h，按照標準方法測定酶活性。所用緩沖液：ph6.0-7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，ph8.0-8.5的tris-hcl緩沖液，ph9.0-10.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，ph11.0-12.0的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液。結果如圖5所示，從圖看出蛋白酶在有廣泛的酸性范圍內都保持高活性，在ph2.0-8.0之間，酶活保持在80％以上。
實施例2
用三角瓶發酵制備富多肽飼料添加劑(適用于所需發酵的二級種子培養液較少的情況)，包括如下步驟：
步驟1、菌種活化
從保存的米曲霉dj36菌種斜面上刮取1環米曲霉孢子，接種于菌種的活化固體種子培養基上，在28-32℃的生化培養箱中靜止培養，培養3-5d，讓菌種活化，孢子充分成熟后，結束培養。
步驟2、制備米曲霉菌的單孢子菌懸液
用含有0.01％v/v吐溫80的0.75％無菌生理鹽水將步驟1培養好的孢子洗下，放到裝有50ml無菌生理鹽水和無菌玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩20-30min。待孢子充分打散后，制備孢子含量為1.0×108cfu/ml的孢子懸液，即得單孢子菌懸液。
步驟3、液體菌種制備
按照5％-10％v/v的接種量，將上述單孢子菌懸液接種在裝有30-50ml已滅菌的種子培養基的250ml三角燒瓶中，培養基中加20粒滅菌的玻璃珠，以6-8層紗布封口，置于空氣搖床中擴大培養，設定轉速為180-220r/min，于26-34℃下培養2-4d。
上述種子培養基的制備方法為：分別取蛋白胨5-10g，黃豆粕粉5-10g，谷朊粉10-20g，麩皮粉5-10g，葡萄糖10-15g，淀粉10-20g，(nh4)2so41g，吐溫-800.5ml，無機鹽營養液10ml，混合均勻后，調節ph至5.0-6.5，補充去離子水至1000ml；在121℃溫度下滅菌15min。
步驟4、液態發酵制備復合酶
將裝有發酵培養基200-300ml的1000ml三角瓶置于121℃下滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，將步驟2所得的二級種子培養液按照5-10％的接種量接種，置于搖床上震蕩發酵；初始發酵溫度28-32℃，發酵培養基初始ph5.5-6.5，搖床震蕩頻率180-200r/min；發酵2d-4d，發酵溫度降為25-28℃，搖床震蕩頻率不變；發酵至3d開始補料，每次補料20-30ml，每隔12h補料一次，共補料2-3次；發酵6d時，將發酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調節發酵液ph值為5.0-6.5，搖床轉速降至160-180r/min；發酵6d時，添加滅過菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液20-30ml；繼續發酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發酵液ph調節至7.0-7.5，維持4h，結束發酵。測定發酵液蛋白酶活力達到6800-7000u/ml，菊粉酶活力達到：712-786u/ml。
上述發酵培養基的制備方法為：分別取黃豆粕粉10-20g，谷朊粉10-20g，菊粉5-10g，麩皮粉5-10g，淀粉10-20g，(nh4)2so41g，吐溫-800.5ml，玉米漿15-30g，無機鹽營養液10ml，混合均勻后，補充去離子水至1000ml；在121℃溫度下滅菌15min。
步驟5、發酵液酶解雜蛋白
發酵結束后，發酵液導入酶解罐中，進一步向發酵液中添加麩皮、谷糠、豆粕粉、谷朊粉，使發酵液變成濃稠狀，調節其ph值為5.5，控制溫度為50℃，維持4-6h，中間攪拌2-3次；再次調節ph到4.0-7.0，控制溫度為50℃，維持4-6h；得到發酵酶解料。
步驟6、干燥、粉碎、包裝
酶解結束后，采取55-65℃低溫烘干的方法對以上發酵酶解料干燥處理，然后粉碎過150-200目篩，成品包裝得到富多肽富蛋白酶飼料添加劑。
實施例3
用發酵罐發酵制備富多肽飼料添加劑(適用于所需發酵的二級種子培養液較多的情況)，其制備步驟與實施例2中的不同之處在于，步驟4中液態發酵制備復合酶的具體操作為：
在15l的發酵罐中裝入發酵培養基8-10l，發酵罐夾套升溫至95℃，再將蒸汽直接通入發酵培養基中，121℃滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，取步驟2所得的二級種子培養液400-1000ml以火焰法接種于發酵罐中，發酵罐壓為0.05mpa；初始發酵控制條件為：溫度28-32℃，發酵培養基初始ph5.5-6.5，無菌空氣通風比1:0.6-0.8(v/v)，攪拌轉速260-300r/min，保持溶氧20-30％；發酵過程觀察泡沫情況，并流加以消泡劑泡敵，消除培養過程中產生的過多泡沫；發酵2-4d，發酵溫度降為25-28℃，無菌空氣通風比1:0.4-0.6(v/v)，通過自動流加氨水調節ph，控制ph于6.0-6.5；發酵至3d開始補料，每次補料500-1000ml，每隔12h補料一次，共補料2-3次；發酵6d時，將發酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調節發酵液ph值為6.0-7.0，降低無菌空氣通風比1：0.4-0.6(v/v)，攪拌轉速降至200-240r/min；發酵6d時，添加滅過菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液1-2l；繼續發酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發酵液ph調節至7.0-7.5，維持4h，結束發酵。測定發酵液蛋白酶活力達到6800-7000u/ml，菊粉酶活力達到：712-786u/ml。
其他步驟同實施例2。
產品分析
通過以上發酵工藝和發酵液酶解工藝最終大豆粕蛋白和谷朊粉中總蛋白轉化為多肽的得率高達65％。對制備的多肽粉進行分析確定，分子量小于6kda的多肽占總肽量的72.1％，其中分子量介于2-6kda之間的多肽占總肽量的34.5％，有5.62％的多肽分子量在6-20kda之間。
本技術領域中的普通技術人員應當認識到，以上的實施例僅是用來說明本發明，而并非用作為對本發明的限定，只要在本發明的實質精神范圍內，對以上所述實施例的變化、變型都將落在本發明的權利要求范圍內。