一種具有良好熱穩定性的脂肪酶微乳液凝膠的制備方法與流程

本發明涉及一種脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，屬于生物酶技術領域。

背景技術：

脂肪酶(lipase)存在于大多數生物體內，它能夠催化甘油酯類化合物水解，因而密切關系到生物體內脂類的消化，運輸和加工。此外脂肪酶還具有界面活性，能在油水界面催化疏水性底物的水解。當前生物酶技術快速發展，脂肪酶的應用范圍和實施方法不斷被拓寬，頻頻出現于食品、日用化工、油脂化工等領域。然而很多脂肪酶相關的生產過程是在高溫下進行的，甚至在一些儲存和運輸途中也難以保持低溫，但由于脂肪酶的熱穩定性較差，經歷高溫后其活性難以復原，這主要是因為脂肪酶的分子鏈在高溫時展開，疏水位點暴露在外，導致了脂肪酶分子之間發生聚集。這種聚集體一旦產生，即使回到適宜溫度下仍難以解離。所以只要經歷過高溫，脂肪酶分子就難以恢復其天然結構，將會失去其催化活性。因此具有良好熱穩定性的脂肪酶有著重要的應用價值和大量的實際需求。

目前，提高脂肪酶的熱穩定性的方法主要是將脂肪酶固定在各種載體(例如多孔硅，凝膠等)上。這種方法一般需要對載體進行預處理，操作較復雜，而且固定化效率有限。微乳液凝膠的發現為酶固定化領域注入了新的活力。微乳液凝膠固定化酶是在油包水含酶微乳液的基礎上發展而來，它既擁有含酶微乳液的優點，也克服了含酶微乳液體系在酶促反應過程之中所面臨的主要問題，即酶的重復利用和產物分離。因而更適用于規模較大的工業生產。

技術實現要素：

本發明針對現有提高脂肪酶熱穩定性的方法存在的不足，提供一種具有良好熱穩定性的脂肪酶微乳液凝膠的制備方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種具有良好熱穩定性的脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)將脂肪酶與均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺溶解在磷酸鹽緩沖溶液中制得混合溶液作為水相；

2)將表面活性劑加入到不溶于水的非極性或弱極性有機溶劑中，溶解后作為油相；

3)將水相在攪拌條件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液，控制水相與油相的體積比為1：10-1：100，且微乳液中w0值為10；

4)將明膠與水混合，明膠與水的質量比為1：1-1：4，將混合物加熱并不斷攪拌，直至得到均勻的糊狀物；

5)將預熱后的步驟3)中所得的微乳液加入到步驟4)所得的糊狀物中，攪拌均勻后停止加熱，冷卻，即得固態的脂肪酶微乳液凝膠。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述步驟1)中控制水相中脂肪酶與均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺的質量之比為1：1-1：10,脂肪酶的濃度為0.1-10mg/ml。

進一步，步驟1)中所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10mm，ph＝7.50。

進一步，步驟2)中所述的表面活性劑為二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉、聚乙二醇對異辛基苯基醚,十六烷基三甲基溴化銨中的一種。

進一步，步驟2)中所述的有機溶劑為正己烷，環己烷，異辛烷，甲苯，石油醚中的一種。

進一步，步驟4)中混合物加熱的溫度為45-55℃。

進一步，步驟5)中控制糊狀物與微乳液的質量比為1：1-1：10。

進一步，所述均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺的分子量為1000-8000da(道爾頓)。

本發明的有益效果為：

1)本發明提供的脂肪酶微乳液凝膠熱穩定性好，經高溫加熱后，仍能保留很高的酶活性，相對脂肪酶微乳液來說，能保留更高的酶活性；

2)本發明的含酶微乳液凝膠在催化酶促反應之后可方便地分離出來，并且可重復利用。

本發明的脂肪酶微乳液凝膠熱穩定性好的作用機理如下：

在脂肪酶微乳液凝膠中，脂肪酶分子分散于納米級的水相液滴中，同時這些液滴又被固態的凝膠結構彼此隔離，難以靠近。另外，溫敏性聚合物pnipaam也對提高脂肪酶的熱穩定性至關重要。溫敏性聚合物pnipaam高溫時疏水，低溫時親水。因而可隨環境溫度的升高，自發地與展開的脂肪酶分子鏈發生疏水相互作用，從而防止與其它脂肪酶分子發生聚集，并在高溫撤離后自動釋放脂肪酶，幫助其恢復天然結構。這與微乳液中僅依靠液態的油相所產生的隔離效果相比，其阻斷脂肪酶分子間相互作用的效果要更勝一籌。這兩種途徑協同發揮作用，有效提高了脂肪酶的熱穩定性。

附圖說明

圖1為實施例1、實施例2和對比例1所得的產品經失活復性后相對酶活性的比較示意圖；

圖2為實施例1、3所得的微乳液與微乳液凝膠產品經失活復性后相對酶活性的比較示意圖；

具體實施方式

以下結合實例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

本發明所使用的均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺(pnipaam)是采用原子轉移自由基聚合(atrp)的方法合成的。

實施例1：

一種脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)以濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，配制2mg/ml的脂肪酶溶液和5mg/ml的分子量為1470da的均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺溶液；

2)將1.2ml的脂肪酶溶液和2.4ml的聚n-異丙基丙烯酰胺溶液混合制得混合溶液作為水相，將8.9g的表面活性劑二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉加入到100ml的異辛烷中，溶解后作為油相；

3)將水相在攪拌條件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液a1；

4)將23g明膠與30ml水混合，加熱至45℃并不斷攪拌，直至得到均勻的糊狀物；

5)將預熱至45℃的步驟3)中所得的微乳液加入到步驟4)所得的糊狀物中，攪拌均勻后停止加熱，冷卻，即得固態的脂肪酶微乳液凝膠e1。

對比例1：

與實施例1的制備方法區別之處在于，微乳液的水相中以同體積的磷酸鹽緩沖溶液代替聚n-異丙基丙烯酰胺溶液，其余步驟完全相同，制得脂肪酶凝膠b1。

實施例2：

一種脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)以濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，配制0.4mg/ml的脂肪酶溶液和6.7mg/ml的分子量為4300da的均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺溶液；

2)將1.8ml的脂肪酶溶液和5.4ml的聚n-異丙基丙烯酰胺溶液混合制得混合溶液作為水相，將25.8g的表面活性劑聚乙二醇對異辛基苯基醚(tritonx-100)加入到540ml的環己烷中，溶解后作為油相；

3)將水相在攪拌條件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液a2；

4)將30g明膠與60ml水混合，加熱至55℃并不斷攪拌，直至得到均勻的糊狀物；

5)將預熱至55℃的步驟3)中所得的微乳液加入到步驟4)所得的糊狀物中，攪拌均勻后停止加熱，冷卻，即得固態的脂肪酶微乳液凝膠e2。

實施例3：

一種脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)以濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，向7.2ml的磷酸鹽緩沖溶液中加入72mg的脂肪酶和72mg分子量為6800da的均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺配制成混合溶液作為水相；

2)將14.6g的表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(ctab)加入到72ml的石油醚中，溶解后作為油相；

3)將水相在攪拌條件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液a3；

4)將10g明膠與40ml水混合，加熱至50℃并不斷攪拌，直至得到均勻的糊狀物；

5)將預熱至50℃的步驟3)中所得的微乳液加入到步驟4)所得的糊狀物中，攪拌均勻后停止加熱，冷卻，即得固態的脂肪酶微乳液凝膠e3。

實驗數據證明過程：

一、為了驗證本發明的脂肪酶微乳液凝膠的熱穩定性，我們將實施例1、實施例2和對比例1所得的微乳液凝膠e1、e2和b1進行了熱穩定性測試，具體測試方法如下：

1)將微乳液凝膠樣品e1、e2、b1分別置于65℃、75℃和85℃的恒溫水浴中加熱30min，使其失活，后冷藏保存24h，使其復性；

2)室溫下將復性后的微乳液凝膠0.5g、濃度為25mm的4-硝基苯基棕櫚酸酯的異丙醇溶液100μl，以及濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液2ml快速混合后，立即通過紫外分光光度計檢測反應液在400nm處的吸光度變化，將該吸光度與未經加熱的微乳液凝膠在同樣的反應條件下經同樣的測試所得的吸光度進行比較，得到相對酶活性，結果如圖1所示。

由圖1中的數據可知，在微乳液凝膠中無聚合物pnipaam與有聚合物pnipaam這兩種條件下，其中的脂肪酶殘余活性有較大差別，無聚合物的微乳液凝膠中其相對活性低于40％，而含有聚合物的微乳液凝膠比不含聚合物的微乳液凝膠的相對活性能至少提高一倍。這說明聚合物pnipaam的加入可以有效防止微凝膠中脂肪酶在高溫條件下的大量失活，使其仍保留較高的酶活性。

二、為了驗證本發明提供的脂肪酶微乳液凝膠相對脂肪酶微乳液而言，其脂肪酶在高溫失活經復性后的反應活性，我們進行了如下測試：

1)將實施例1、3所得的微乳液凝膠e1、e3與微乳液a1、a3經75℃高溫加熱30min失活，后冷藏保存24h，使其復性；

2)室溫下將復性后的微乳液凝膠0.5g、濃度為25mm的4-硝基苯基棕櫚酸酯的異丙醇溶液100μl，以及濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液2ml快速混合后，立即通過紫外分光光度計檢測反應液在400nm處的吸光度變化，將該吸光度與未經加熱的微乳液凝膠在同樣的反應條件下經同樣的測試所得的吸光度進行比較，得到相對酶活性，結果如圖2所示。

3)室溫下將復性后的微乳液2ml與濃度為25mm的4-硝基苯基棕櫚酸酯的異丙醇溶液100μl快速混合后，立即通過紫外可見分光光度計檢測反應液在333nm處的吸光度變化。將該吸光度與未加熱的微乳液在同樣的反應條件下經同樣的測試所得的吸光度進行比較，得到其相對酶活性，結果如圖2所示。由圖2中的數據對比可知，脂肪酶的微乳液凝膠相對脂肪酶的微乳液形式來說，在高溫失活復性后能夠更好地保持脂肪酶的活性，提高脂肪酶的使用效率。

三、為了驗證本發明提供的脂肪酶微乳液凝膠的可重復利用性，我們在利用本發明的實施例1、實施例2所得的脂肪酶微乳液凝膠催化4-硝基苯基棕櫚酸酯水解的反應結束之后，將所用微乳液凝膠從反應體系中分離回收，并投入到同等條件的另一組底物溶液中，以進行下一次酶促反應。測試每次反應中的酶活性，分別將每組微乳液凝膠樣品的首次酶活性設為100％，比較回收且多次使用后的酶活性。結果如表1所示。

表1中的數據表明，隨著重復利用次數的增多，微乳液凝膠中的酶活性有所下降，但仍能保持較高的催化性能，重復使用的效率較高。

表1：重復使用不同次數后脂肪酶微乳液凝膠的相對酶活性

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。