技術領域：
：：本發明屬于生物學領域，涉及一種單核細胞增生李斯特氏菌，具體來說是一種sigb基因缺失的單核細胞增生李斯特氏菌及構建方法。
背景技術：
：：：單核細胞增生性李斯特菌(listeriamonocytogenes,lm)是一種非芽孢的革蘭氏陽性菌，它是一種可以引發李斯特病的食源性致病，廣泛寄生于土壤、污水、人和動物的糞便、飼料及肉類、蛋類、禽類等食品中。單核增生性李斯特菌在感染過程中可以穿透腸道屏障，胎盤屏障和血腦屏障，從而導致人體產生腸胃炎，脊髓炎，腦膜炎等一系列疾病。在其侵襲宿主的過程中，很多毒力基因及毒力蛋白發揮著重要的作用。llo(listeriolysiono)是一種多功能的毒力因子，在形成穿孔毒素及宿主細胞黏膜外滲方面起著重要的作用；由acta基因編碼的膜蛋白acta與lm的肌動性運動有關，inla和inlb是內化素蛋白家族中最重要的內化素蛋白，是最早被發現的介導lm入侵宿主細胞的內化素。plca和plcb有助于lm逃離吞噬小體，prfa主要調控lm的侵襲相關毒力因子，如inla和inlb等。這些毒力基因互相影響，共同促成了lm對宿主的侵襲和感染。越來越多的證據表明lm可以抵抗來自外界的多種壓力，包括加熱，冷凍，氯化鈉，滲透壓，ph，氧化物以及紫外線(uv)輻射等，使得lm在各種乳制品、肉制品等各類食品加工過程及冷鏈運輸過程中存活并引發李斯特病。因此，深入了解lm的抗性系統將會對控制這種致病菌的傳播起到重要的作用。有研究表明sigb基因在lm抵抗外界壓力方面起著關鍵作用，sigb基因的編碼產物sigmab因子是對環境脅迫產生應答反應的主要調控因子，rsbv和rsbw兩個關鍵蛋白是sigmab因子活性調控中最重要的兩個關鍵蛋白，當細菌出路非壓力環境下，rsbw蛋白能使rsnv磷酸化，從而使得sigmab活性受到抑制；當外界壓力信號傳遞到細胞內時，rsbv去磷酸化并結合rsbw蛋白上，促使其釋放出sigmab因子，激活的sigmab因子進而裝載到rna核心酶上，從而誘導依賴sigmab的基因轉錄，來抵抗來自外界的壓力。sigb基因通過直接或間接對lm重要毒力基因的調控起到了其在lm侵襲宿主時毒力因子的作用，在受sigma因子調控的54個被鑒定的基因中，至少有3個基因屬于毒力相關基因，如編碼膽堿水解酶的bsh、編碼與rna結合的調控蛋白的hfq、以及編碼滲透轉運蛋白的opuc。在以一定程度上，毒力基因inla和毒力基因調控蛋白prfa的編碼基因prfa也受其調控。另一方面，菌膜被認為是lm抵御外界壓力所形成的一種保護膜，sigb基因與lm菌膜的形成有著非常重要的關聯。通過聯系抵御環境壓力及調節其他毒力基因這兩方面，sigb基因在lm在自然界的存活及侵襲宿主方面都有著非常重要的作用。技術實現要素：：針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種sigb基因缺失的單核細胞增生李斯特氏菌及構建方法，所述的這種sigb基因缺失的單核細胞增生李斯特氏菌及構建方法要解決現有技術中沒有合適的單核細胞增生李斯特氏菌用于減毒疫苗的技術問題。本發明提供了一種基因敲除減毒單核細胞增生李斯特氏菌，所述的這種基因敲除減毒單核細胞增生李斯特氏菌缺失sigb基因。進一步的，所述的基因敲除減毒單核細胞增生李斯特氏菌的保藏編號為：cctccm2016522。本發明還提供了一種疫苗，含有上述的一種基因敲除減毒單核細胞增生李斯特氏菌。本發明還提供了一種抗體，由上述的一種基因敲除減毒單核細胞增生李斯特氏菌免疫產生。本發明還提供了上述的一種基因敲除減毒單核細胞增生李斯特氏菌的制備方法，包括如下步驟：1)挑取egd-e單菌落過夜搖床培養，采用細菌基因組提取試劑盒獲得egd-e基因組；2)使用設計的引物sigb5’f/sigb5’r、sigb3’f/sigb3’r，以egde基因組dna為模板進行pcr擴增，得到sigb基因的上游片段p1/p2和下游片段p3/p4，上游片段p1/p2的序列如seqidno.7所示、下游片段p3/p4的序列如seqidno.8所示，使用限制性內切酶xbai酶切得到的上下游片段，使用t4dna連接酶連接，連接完成后連接t載體并導入jm109感受態細胞中；3)將陽性克隆的菌液轉接擴大培養并抽提質粒；4)通過smai和sali兩種內切酶分別對連有同源臂的t載體和穿梭質粒pksv7進行雙酶切，并用t4連接酶連接兩種產物并導入jm109感受態細胞中；5)將陽性克隆的質粒抽提后進行smai和sali兩種內切酶雙酶切，得到sigb基因缺失的單核細胞增生李斯特氏菌。本發明在構建單核細胞增生李斯特氏菌減毒菌株菌株的過程中，首先利用同源重組技術對標準菌株egd-e進行減毒得到李斯特減毒菌株egd-e△sigb。然后從生長速度、毒力基因表達水平及細胞侵襲生物學方面等方面研究sigb基因缺失菌株的生物特性，為食源性致病菌lm致病機理研究提供基礎。上述構建的基因敲除減毒單核細胞增生李斯特氏菌的保藏編號為：cctccno:m2016522；菌株名稱為：單核細胞增生李斯特氏菌egd-e(sigb基因缺失)listeriamonocytogenesegd-e(sigb基因缺失)，保藏日期：2016年9月26日，保藏單位：中國典型培養物保藏中心(cctcc)，地址為：中國武漢武漢大學，郵編：430072。本發明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發明構建的sigb基因缺失菌株在基因缺失后菌體生長趨勢在12h內與野生株egde基本完全一致，于8h左右到達飽和。實驗表明，sigb基因對于lm的毒力方面有著較大的影響，根據初步結果分析，inla和inlb是負責單核細胞增生李斯特氏菌侵襲的主要毒力因子，其表達程度的明顯下降會對細胞的侵襲造成較大影響，但是其acta、hly、plca等基因卻顯著上調，則說明這對lm在細胞之間的傳播、寄生等能力有可能會上調。實驗表明，egde-△sigb菌株的侵襲能力確實較低，綜合分析其毒力基因的表達情況，主要為inla和inlb在sigb基因敲除后，表達明顯下降，這造成了侵襲能力大大下降。附圖說明圖1顯示了egde-δsigb的構建原理。圖2顯示了上下游同源臂擴增。圖3顯示了連有同源臂的t載體鑒定結果。圖4顯示了重組質粒鑒定。圖5顯示了含有重組質粒的轉化子鑒定。圖6顯示了sigb基因缺失菌株的篩選。圖7顯示了egde與egde-△sigb生長曲線。圖8顯示了egde-δsigb毒力基因表達水平。圖9顯示了egde與egde-δsigb細胞侵襲結果。具體實施方式各個實驗采用的試劑盒用量如下：反轉錄反應1.基因組dna的去除2.反轉錄反應realtime-pcr反應實施例1挑取egd-e(atccbaa-679)單菌落過夜搖床培養，使用天根生化科技(北京)有限公司細菌基因組提取試劑盒(no：dp302-02)獲得egd-e基因組，使用設計的引物sigb5’f/sigb5’r、sigb3’f/sigb3’r，以egde基因組dna為模板進行pcr擴增，產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在120v電壓下電泳35min，電泳液為1×tae。電泳后使用凝膠成像儀成像，并割膠回收；得到sigb基因的上游片段p1/p2(如seqidno.7所示)、下游片段p3/p4(如seqidno.8所示)。使用限制性內切酶xbai酶切得到的上下游片段，進行瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收，割膠回收后的產物使用t4dna連接酶16℃過夜連接，連接完成后連接t載體并導入jm109感受態細胞中，平板上長出單菌落后進行pcr鑒定，將陽性克隆的部分菌液轉接擴大培養并抽提質粒；通過smai和sali兩種內切酶分別對連有同源臂的t載體和穿梭質粒pksv7進行雙酶切，并用t4連接酶連接兩種產物并導入jm109感受態細胞中，將陽性克隆的質粒抽提后進行雙酶切鑒定并測序，測序由華大基因完成，測序后將序列比對正確的質粒保存；將重組質粒電轉化egde感受態細胞中，電轉化后將感受態細胞涂布于bhi平板(含10μg/mlcam)上30℃培養，挑取菌落進行鑒定，將陽性克隆的菌液凍存。使用溫度及氯霉素雙重抗性的篩選，利用表1中sigbf和sigbr引物進行鑒定，鑒定的陽性菌株送由華大基因測序。測序成功后凍存，將sigb基因缺失菌株命名為egde-△sigb。基因缺失株egde-△sigb的構建如圖1所示。表1引物序列table1primersequences將上述的菌株進行保藏，菌株的名稱：單核細胞增生性李斯特菌sigb基因缺失菌株(listeriamonocytogenes)egde-δsigb，保藏日期為2016年9月26日，保藏單位為：中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號：cctccno:m2016522。實施例2本發明對菌株的鑒定方法包括如下步驟：使用sigb5’f/sigb3’r引物pcr鑒定上下游連接片段與質粒pksv7的連接；使用smai和sali對擴增得到的重組質粒進行雙酶切鑒定，鑒定為陽性的克隆由上海華大基因科技有限公司測序；電轉化后利用引物sigb5’f/sigb3’r、sigbf/sigbr(表1)及涂布無抗性平板對突變株進行鑒定，鑒定結果為陽性的菌株命名為egde-△sigb。本發明菌株的鑒定結果如下：1.sigb基因上下游同源臂的擴增以egde基因組為模板擴增sigb基因的上下游同源臂，擴增產物進行瓊脂糖電泳的結果見圖2，圖2中m為dl1000bpmarker，1號泳道為上游同源臂618bp，2號泳道為下游同源臂558bp，擴增的片段與預期的片段大小相符且特異性良好無雜帶，同時確定引物進行pcr反應時的退火溫度為56℃。2.上下游同源臂的連接和導入jm109感受態細胞將上下游同源臂使用相應限制性內切酶處理并用t4dna連接酶過夜連接，連接產物與t載體連接并導入感受態細胞，平板上長出的菌落pcr鑒定結果見圖3。圖3中m為500bpdnaladdermarker，1號泳道為陰性對照，2-6號泳道為鑒定樣本。sigb基因的上下游同源臂連接后為1164bp，由電泳圖可知，2、5、6號樣本為陽性克隆，目的基因上下游同源臂均連接成功，并與t載體連接成功。3.pksv7重組質粒的構建將連有同源臂的t載體與pksv7質粒使用相應的限制性內切酶進行雙酶切，再使用t4dna連接酶16℃過夜連接并將重組質粒導入感受態細胞中，平板上長出的菌落鑒定結果見圖4，圖4中m為500bpdnaladdermarker，1號泳道為陰性對照，2-6號泳道為鑒定樣本。電泳圖顯示4、5號樣本為陽性克隆，即重組質粒構建成功。雙酶切鑒定與測序結果表明，重組質粒上連接的目的基因同源臂序列與ncbi報導的相關基因序列匹配度達到99％以上，無大量突變和錯配情況存在，可以用于后續實驗。4.重組質粒電轉化egde感受態細胞挑取bhi平板(含10μg/mlcam)上菌落進行鑒定，鑒定結果見圖5，圖5中m為500bpdnaladdermarker，1號泳道為陰性對照，2-6號泳道為鑒定樣本，電泳圖顯示2、4、5、6號樣本為含有重組質粒的陽性轉化子，將陽性樣本凍存用于后續實驗。5.sigb基因缺失突變株的篩選與鑒定含有重組質粒的陽性轉化子在特定條件下連續培養一定時間后，對劃線接種末代培養物的bhi平板上的菌落進行鑒定，鑒定結果見圖6。圖6中m為dl1000bpmarker，1號泳道為陰性對照，2號泳道為以egde基因組dna作為模板的陽性對照，3-6號泳道為鑒定樣本。電泳結果顯示，4號泳道的樣本使用sigb基因鑒定引物則未擴增出任何產物，說明樣本的sigb基因很可能已經缺失，將疑似突變菌株分別涂布抗性和非抗性平板，并對相應基因序列進行測序。測序結果表明樣本中的sigb基因已經缺失，而抗性鑒定顯示，基因缺失菌株的完全失去氯霉素抗性，sigb基因缺失的egde菌株構建完成，命名為egde-△sigb。實施例3本發明將egde與egde-△sigb接種到bhi液題培養基中，于37℃，200r/min下培養12h，每個小時使用酶標儀測定egde與egde-△sigb在od600下的生長曲線，比較sigb基因缺失后的菌株與egde的活力是否存在明顯的不同，結果為圖7所示。測定結果如下：egde-△sigb在基因缺失后菌體生長趨勢在12h內與野生株egde基本完全一致，于8h左右到達飽和。實施例4本發明將egde與egde-△sigb的rna提取反轉錄成cdna，進行rt-pcr反應，選擇了11個lm中較為重要的毒力基因作為研究對象，并考察了負責ros生成的nox基因的表達情況，結果為圖8所示。檢測結果為：結果顯示sigb基因已無表達，inla和inlb與srta基因表達水平也下降的非常明顯，inla約下降十二倍左右，inlb下降約三倍，srta約下降2.5倍。但是其余的重要的毒力基因卻有上升的趨勢，plca尤為明顯，約上調五倍左右。可見sigb基因對于lm的毒力方面有著較大的影響，根據初步結果分析，inla和inlb是負責單核細胞增生李斯特氏菌侵襲的主要毒力因子，其表達程度的明顯下降會對細胞的侵襲造成較大影響，但是其acta、hly、plca等基因卻顯著上調，則說明這對lm在細胞之間的的傳播、寄生等能力有可能會上調。實施例5本發明將egde與egde-△sigb兩株菌株侵襲人結腸癌腺細胞caco-2，統計成功侵入caco-2細胞的細菌總數，計算出各自侵襲比率，比較egde-△sigb的侵襲能力是否發生變化。對細菌和細胞進行計數，調整濃度使得細菌和細胞分別為107cfu/ml和100個/ml，調整比例為細菌數/細胞數＝100/1后進行細菌侵襲細胞實驗。為排除胎牛血清對侵襲實驗結果的影響，在侵襲之前將12孔細胞培養板中換成不含血清的不完全培養基；放入細胞培養箱侵襲4h后每孔加入0.5ml700μg/ml的慶大霉素，放置于細胞培養箱處理30min充分滅活胞外細菌；使用pbs清洗慶大霉素后每孔加入0.5ml1％triton-x-100，室溫處理30min，充分破碎細胞后稀釋涂布bhi平板，37℃培養進行平板計數，結果為圖9所示。結果顯示：egde侵襲4h后，成功進入caco-2細胞的比例約為1％左右，但是egde-△sigb成功侵襲的比例平均約為0.2％左右，下降了五倍左右。這表明egde-△sigb菌株的侵襲能力確實較低，綜合分析其毒力基因的表達情況，主要為inla和inlb在sigb基因敲除后，表達明顯下降，這造成了侵襲能力大大下降。實施例6主要毒力基因的表達和細胞侵襲情況表明了sigb基因敲除株的毒力與野生株相比顯著下降。將減毒的sigb基因敲除株靜脈注射進小鼠體內，發現ifn-γ量增加，cd8+t細胞數量大量增加，說明小鼠體內的細胞免疫被激發。之后對小鼠進行野生株egd-e感染，發現小鼠死亡率下降，說明egd-e△sigb可以用于毒性lm引發的小鼠感染，對lm具有抗性。基于egd-e△sigb的保護性免疫，可開發egd-e△sigb用于疫苗載體。序列表<110>上海理工大學<120>sigb基因缺失的單核細胞增生李斯特氏菌及構建方法<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>28<212>dna<213>sigb5'f引物<400>1attcccgggattaggcgtatttgtagga28<210>2<211>28<212>dna<213>sigb5'r引物<400>2atttctagatctcctccacctgcttttc28<210>3<211>28<212>dna<213>sigb3'f引物<400>3atttctagaccataacaccttttaaact28<210>4<211>28<212>dna<213>sigb3'r引物<400>4attgtcgacttttaaaaattcccattag28<210>5<211>20<212>dna<213>sigbf引物<400>5ggtgtcacggaagaagaagt20<210>6<211>20<212>dna<213>sigbr<400>6ccgcagtattgttgtaatgc20<210>7<211>562<212>dna<213>p1/p2<400>7gctttcaaaagcttacgtcaacgccaaagtgaacttgtcttgtttggtttaagcgaccga60cttttccgattgtttgaaatcacaggattgtcagatatcatcgaaatcaaaaatgtagag120ggtgaaatgaatggcaacaatgcatgacaaaattacattacaacttcctgccaagcctga180atatgtaagtttaggtagactttcattatcaggaattgcaagtcgcgcaggattttctta240tgaagcaattgaagatttgaaaatagctgtaagtgaagccatcactaattccgtaaagca300tgcatttaaaggggaagaagatggcgaaatcacagtcgaatatcttatttatgaagataa360gctagaagttcgtgtttccgataacggcacaagcttcgacttagaaacccgtaaacaaga420aattggcccatatgatgtgggcgaggatgcggagatgatgcgtatcggtgggctaggttt480atttttaattgaaacattaatggatgacgtgaaactttattatgatgaaggggtttctgt540cgtaatgaccaaatatattaat562<210>8<211>502<212>dna<213>p3/p4<400>8agcgatggtttgaaaggtgtttttttcagattgggtgtgagaacaggggctatttatggt60atattagaatagagcgctagttttttatacttaatcatgtgataattgtcacttagtaag120cgtgaagccaaattgctttgcgtttttttcgcgcggattaaaatacaaataagagagaag180gagcaaattgaagaaagttttgttgaatagtgtaaaaggttatacgtgggcgaggtttag240gaaagacttgcttgcgggtattatcgtgggcattattgctttaccactagcgatgtcatt300tgcgattgcatcaggtgtaagtccggaatatgggatttattcaagttttgtagcgggaat360aattgtttctatttttggtggttcgaaatttcaaattgctggaccgactggtgcatttat420tccagttttactaggaatcgtattaacttatggttaccaagatttacttgttgccggaat480gatggcaggggttttactttgc502當前第1頁12當前第1頁12