本發明屬于化學合成領域，更具體的涉及一種25-O-葡萄糖基環黃芪醇的制備方法。
背景技術：
黃芪為補藥之首，屬于豆科黃芪屬植物。近年來隨著現代分離和鑒定技術的發展，從黃芪中分離出了大量三萜皂苷、黃酮類化合物以及多糖類成分。后期的生物生化實驗表明黃芪的藥用功效主要通過黃芪皂苷表現出來。近期研究表明，黃芪皂苷在免疫調節，降糖，改善胰島素抵抗活性，抗腫瘤，對心血管系統調節以及抗病毒，抗氧化活性等方面都表現出了極為可喜的藥用前景。
盡管黃芪皂苷廣泛的應用前景促使人們對其研究不斷深入，但目前用于活性測試的黃芪皂苷多為從黃芪中分離提取所得，由于黃芪中所含皂苷種類繁多，且結構類似，這給分離提純帶來很大困難。還有一些黃芪皂苷為次生皂苷，在黃芪中的含量很低，要得到足夠量以供活性測試之用更是不易，這已成為制約黃芪皂苷活性研究深入的瓶頸，到目前為止幾乎沒有關于黃芪皂苷的化學合成研究報道。
化合物I(見式I)為25-O-葡萄糖基環黃芪醇，是一種黃芪皂苷。有文獻報道，雖然目前尚未從天然來源中分離出化合物I但在黃岑甲苷的微生物代謝物中可分離出化合物I，由此可推斷，化合物I存在于黃岑中，僅是因為含量過低，目前的研究手段無法通過分離得到。
化合物I的皂甙部分為環黃芪醇，由于環黃芪醇(化合物1)的3位，6位，16位及25位含有4個惰性OH，4個惰性OH相互之間的反應活性難以區分，選擇性的糖苷化其中部分羥基非常困難。同時，25位羥基為叔羥基，活性低，糖苷化反應本身就很困難。
環黃芪醇的羥基保護反應進行困難且產物復雜多變，有文獻報道，在過量乙酰化試劑作用下，60℃，長達50天的反應時間下，僅能得到56％收率的全乙酰化的環黃芪醇。縮短反應時間或降低反應溫度導致反應產物十分復雜，為4個羥基中隨機的1或2個羥基被保護的環黃芪醇。
文獻中常用的對大位阻、惰性的羥基保護的方法在環黃芪醇保護中也不起作用，例如路易斯酸催化的乙酰化反應得不到選擇性保護的環黃芪醇。
因此黃芪皂苷合成國內外至今未見成功的報道，25-O-葡萄糖基環黃芪醇的合成也未見報道。人工合成25-O-葡萄糖基環黃芪醇，以獲得足夠量的該化合物，有助于進一步推進對其生物活性，藥理活性的研究，有很高的學術及社會經濟價值。
參考文獻：
a)Mamedova,R.P.；Agzamova,M.A.；Isaev,M.I.Chem.Nat.Compd.2001,37,533-536.b)Isaev,I.M.；Iskenderov,D.A.；Isaev,M.I.Chem.Nat.Compd.2009,45,381-384.c)Isaev,I.M.；Iskenderov,D.A.；Isaev,M.I.Chem.Nat.Compd.2010,46,407-411.d)Procopiou,P.A.；Baugh,S.P.D.；Flack,S.S.；Inglis,G.G.J.Org.Chem.1998,63,2342-2347.d)Kitagawa,I.；Wang,H.-K.；Saito,M.；Yoshikawa,M.Chem.Pharm.Bull.1983,31,709-715.
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是：開發一種合成25-O-葡萄糖基環黃芪醇的方法，以獲得足夠量的該化合物，進一步推進對其生物活性，藥理活性的研究。
為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案是：
一種合成25-O-葡萄糖基環黃芪醇的方法，包括以下步驟：
(1)環黃芪醇的選擇性羥基保護：0℃以下，將環黃芪醇和PPy溶于第一溶劑中，再加入酸酐和DIPEA，將反應溫度緩慢升至室溫后再加熱到100～120℃，繼續反應直到TLC跟蹤顯示環黃芪醇反應完全，得到化合物2；
(2)糖苷化反應：室溫下，將步驟(1)中得到的化合物2和糖基給體化合物3溶于第二溶劑中，加入干燥劑，攪拌后，加入催化劑，繼續在室溫下反應直到TLC跟蹤顯示化合物2反應完全，得到化合物4；
(3)最終脫保護反應：將步驟(2)中得到的化合物4的所有保護基脫除即可；
其中R1選自取代或非取代的C2-C6烷酰基；R2選自取代或非取代C1-C6芳酰基；X選自取代或非取代的炔苯甲酰氧基。
優選的，所述R1選自乙酰基、丙酰基、丁酰基、異丙酰基；R2選自苯甲酰基、對甲基苯甲酰基、鄰甲基苯甲酰基；X任選自以下基團之一：
最優選的，R1為乙酰基，R2為苯甲酰基，X為
步驟(1)中，所述酸酐選自取代或非取代的C2-C6脂肪酸的酸酐，優選為乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、異丙酸酐；最優選為乙酸酐。
步驟(1)中，優選的，反應溫度為105～120℃。
步驟(1)中，所述化合物1、PPy、酸酐和DIPEA的摩爾比為1:1.5:8:12～1:2:15:20，優選為1:2:10:15～1:2:15:20。
步驟(1)中，所述第一溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、DMF、甲苯、吡啶、四氫呋喃中的一種或多種，優選為甲苯或1,2-二氯乙烷；所述化合物1在所述第一溶劑中的濃度為0.001～0.1mol/L，優選為0.0185～0.037mol/L。
步驟(2)中，所述第二溶劑選自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、DMF、甲苯、四氫呋喃、丙酮、DMSO或乙醚中的一種或多種，優選為二氯甲烷；所述化合物2在第二溶劑中的濃度為0.001～1mol/L，優選為0.01～0.05mol/L。
步驟(2)中，所述催化劑選自一價金的絡合物，優選為PPh3AuNTf2或PPh3AuOTf；所述干燥劑選自分子篩，優選的為分子篩或酸洗的分子篩，更優選的為4A分子篩，所述分子篩相對化合物2的加入量為100～300g/mol。
步驟(2)中，化合物2、糖基給體化合物3和所述催化劑的摩爾比為1:1:0.1～1:5:0.8，優選為1:1:0.1～1:2.5:0.5。
所述保護基脫除的反應包括以下步驟：將化合物4溶于第三溶劑中，再加入堿，室溫下反應直到TLC跟蹤顯示化合物4反應完全。
步驟(3)中，所述堿選自甲醇鈉、氫氧化鈉、碳酸鉀、氫氧化鉀；所述化合物4和所述堿的摩爾比為1:1～20，優選為1:7～10。
所述第三溶劑選自DMF、二氧六環、吡啶、四氫呋喃、甲醇、乙醇、DMSO或乙醚中的一種或多種，優選為甲醇；所述化合物4在第三溶劑中的濃度為0.001～1mol/L，優選為0.001～0.0085mol/L。
步驟(1)～(3)中任一步，優選的，在惰性氣體氣氛中反應，所述惰性氣體選自氮氣、氬氣或氦氣。
優選的，步驟(1～(3)中任一步，優選的，使用的溶劑，使用前先干燥除水。
本發明中，R的上標表示基團的序號，下標表示有幾個基團，例如R12表示兩個R1基團。
化合物I的皂甙部分為環黃芪醇，其3位，6位，16位及25位含有4個惰性OH，相互之間的反應活性難以區分，本發明通過合理的保護基策略以及特殊的反應條件，有效區分了25位OH和其他位置羥基的反應活性，填補了現有技術的空白。
皂苷的糖苷化反應是本領域一大難題，收底物結構，糖化反應給受體的活性不同，不同結構的甙元的糖苷化反應結果差別巨大，反應收率和反應選擇性差別巨大，環黃芪醇25位OH為惰性羥基，通常情況下，難以反應。本發明篩選出有效的糖基給體，高收率高選自性的實現環黃芪醇25位OH的糖苷化，填補了現有技術的空白。
有益效果：本發明高效高立體選擇性高收率的制備了25-O-葡萄糖基環黃芪醇，填補現有技術的空白，將大大推進黃芪皂苷類化合物的活性機理研究及其藥物開發的進程。
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
本發明中PPy表示4-吡咯烷基吡啶(英文名：4-(1-pyrrolidino)-pyridine))，DIPEA表示N,N-二異丙基乙胺；以下每步反應得到的產物純度較高，在400兆核磁共振氫譜中見不到雜質峰。
Bz保護的葡萄糖化合物5按照本領域常規方法合成，參考文獻Chem.Sci.2013,4,3899-3905.，從化合物5合成化合物3。
化合物3的合成方法如下：
在氮氣保護，將異頭位羥基裸露的全Bz葡萄糖(100mg,0.17mmol)溶于干燥的二氯甲烷(4mL)中，再向體系中加入鄰炔基苯甲酸(37.4mg,0.2mmol),DMAP(28.1mg,0.23mmol),EDCI(43.9mg,0.23mmol),DIPEA(74μL，0.45mmol)，室溫下攪拌過夜直到TLC跟蹤顯示原料反應完全，將反應體系用二氯甲烷萃取，并依次用1mol/l HCl、飽和碳酸氫鈉、飽和NaCl洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓濃縮粗產品，然后柱層析得到化合物3(121mg,93％，白色固體)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.07(d,J＝7.5Hz,2H),7.92-7.87(m,6H),7.44-7.28(m,17H),6.94(d,J＝3.3Hz,1H),6.38(dd,J＝9.6,9.9Hz,1H),5.94(dd,J＝9.9,10.2Hz,1H),5.76(dd,J＝3.3,9.9Hz,1H),4.80-4.66(m,2H),4.54(dd,J＝3.3,6.0Hz,1H),1.56(m,1H),0.84(d,J＝6.6Hz,4H).
實施例1：環黃芪醇的選擇性羥基保護：得到化合物2；
在氮氣保護，0℃條件下，環黃芪醇(180mg,0.37mmol)，PPy(108mg,0.74mmol)溶于干燥的甲苯(10mL)中，再向體系中加入乙酸酐(348μL,3.67mmol)，DIPEA(912μL,5.55mmol)，體系緩慢升至室溫然后在加熱到105℃，攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應完全，將反應體系用乙酸乙酯萃取，并依次用1mol/l HCl、飽和碳酸氫鈉、飽和NaCl洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓濃縮粗產品，然后柱層析得到白色固體化合物2(184mg,81.3％)：[α]D25＝73.5(c＝1,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44-5.39(m,1H),4.75(td,J＝4.4,9.2Hz,1H),4.60(dd,J＝4.4,11.2Hz,1H),3.72(dd,J＝6.8,8.4Hz,1H),2.50(d,J＝8.4Hz,1H),2.38(td,J＝5.2,11.6Hz,1H),2.17(dd,J＝8.0,13.6Hz,1H),2.05(s,3H),2.02(s,3H),1.99(s,3H),1.30(s,3H),1.29(s,3H),1.20(s,3H),1.09(s,3H),0.99(s,3H),0.98(s,3H),0.85(s,3H),0.61(d,J＝4.8Hz,1H),0.38(d,J＝4.8Hz,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.8,170.6,170.4,85.6,81.9,79.5,75.6,70.9,70.2,57.1,49.7,46.2,46.1,45.3,45.0,40.1,36.5,32.9,32.5,31.4,29.7,29.2,28.4,27.8,27.7,26.6,26.0(2C),24.5,21.8,21.6,21.2,20.7,20.4,20.0,16.2；HRMS(ESI)calcd for C36H57O8[M+H]+617.4048,found 617.4049.
實施例2：糖苷化反應，得到化合物4；
在氮氣保護下，將化合物2(12mg,0.02mmol)和葡萄糖炔酯給體3(31mg,0.05mmol)溶于干燥的二氯甲烷(2mL)中，并加入4A分子篩(2mg)，在室溫下攪拌半個小時再加入催化劑Ph3PAuNTf2(0.002mmol)，繼續在室溫下攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應完全，減壓濃縮粗產品，然后柱層析得到白色固體化合物4(22mg,94.42％)：[α]D25＝72.6(c＝1,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00-7.95(m,4H),7.91(dd,J＝1.2,8.4Hz,2H),7.85(dd,J＝1.2,8.0Hz,2H),7.56-7.48(m,3H),7.44-7.33(m,7H),7.30-7.27(m,2H),5.92(t,J＝9.6Hz,1H),5.58(t,J＝10.0Hz,1H),5.50(dd,J＝8.0,10.0Hz,1H),5.29-5.26(m,1H),5.20(d,J＝8.0Hz,1H),4.74(td,J＝4.0,9.2Hz,1H),4.60-4.56(m,2H),4.47(dd,J＝6.8,12.0Hz,1H),4.16-4.11(m,1H),3.70(t,J＝7.2Hz,1H),2.41(d,J＝8.0Hz,1H),2.18(dd,J＝8.0,14.0Hz,1H),2.05(s,3H),2.00(s,3H),1.97(s,3H),1.30(s,3H),1.22(s,3H),1.16(s,3H),1.12(s,3H),0.98(s,3H),0.97(s,3H),0.86(s,3H),0.60(d,J＝4.8Hz,1H),0.38(d,J＝4.8Hz,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.8,170.4,170.2,166.0,165.9,165.3,164.9,133.4,133.2,133.1,129.8(2C),129.7(2C),129.6,128.9(2C),128.4(2C),128.3,96.1,85.8,82.7,80.0,79.6,76.0,73.2,72.1,72.0,70.5,70.3,63.8,57.6,49.8,46.4,46.3,45.6,45.4,40.1,37.4,33.2,32.2,31.4,29.8,29.7,28.6,26.7,26.6(2C),25.9,23.2,22.2,21.8,21.5,21.2,20.6,20.4,20.1,16.3；HRMS(ESI)calcd for C70H82O17Na[M+Na]+1217.5444,found 1217.5447.
實施例3：最終脫保護反應：得到25-O-葡萄糖基環黃芪醇I；
在氮氣保護下，將化合物4(20mg,0.017mmol)溶于干燥的甲醇(2mL)中，再加入甲醇鈉(0.17mmol)，室溫下攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應完全，先用酸性樹脂中和PH至中性偏酸性，抽濾，減壓濃縮粗產品，然后柱層析得到白色固體化合物25-O-葡萄糖基環黃芪醇I(9.2mg,84％)：[α]D25＝21.4(c＝1,CHCl3)；1H NMR(400MHz,C5D5N)δ5.10(d,J＝8.0Hz,1H),4.95-4.88(m,2H),4.47(dd,J＝2.8,11.6Hz,1H),4.34(dd,J＝4.8,11.6Hz,1H),4.25-4.16(m,2H),4.09(dd,J＝9.2,16.0Hz,1H),3.93-3.89(m,2H),3.83-3.77(td,J＝4.4,10.0Hz,1H),3.70(dd,J＝4.4,11.2Hz,1H),2.87-2.80(m,1H),2.47(d,J＝7.6Hz,1H),1.92(s,3H),1.68(s,3H),1.43(s,3H),1.38(s,6H),1.30(s,3H),0.96(s,3H),0.62(d,J＝4.8Hz,1H),0.34(d,J＝3.6Hz,1H)；13C NMR(100MHz,C5D5N)δ98.6,87.0,81.8,78.3,78.0,77.8,75.0,73.3,71.1,68.0,62.5,57.9,53.7,46.8,45.9,45.8,
44.9,42.2,38.5,34.8,33.2,32.5,31.2,30.7,29.6,29.2,27.6,26.0,25.7,25.4,22.8,21.4,20.6,19.9,15.9；HRMS(ESI)calcd for C36H61O10[M+H]+653.4259,found 653.4260.
實施例4：環黃芪醇的選擇性羥基保護：得到化合物2；
在氮氣保護，0℃條件下，環黃芪醇(180mg,0.37mmol)，PPy(108mg,0.74mmol)溶于干燥的甲苯(20mL)中，再向體系中加入乙酸酐(522μL,5.5mmol)，DIPEA(1216μL,7.4mmol)，體系緩慢升至室溫然后在加熱到120℃，攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應完全，將反應體系用乙酸乙酯萃取，并依次用1mol/l HCl、飽和碳酸氫鈉、飽和NaCl洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓濃縮粗產品，然后柱層析得到白色固體化合物2(181mg,80％)。
實施例5：糖苷化反應，得到化合物4；
在氮氣保護下，將化合物2(12mg,0.02mmol)和葡萄糖炔酯給體3(12.4mg,0.02mmol)溶于干燥的二氯甲烷(0.4mL)中，并加入4A分子篩(6mg)，在室溫下攪拌半個小時再加入催化劑Ph3PAuNTf2(0.01mmol)，繼續在室溫下攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應完全，減壓濃縮粗產品，然后柱層析得到白色固體化合物4(20mg,85％).
實施例6：最終脫保護反應：得到25-O-葡萄糖基環黃芪醇I；
在氮氣保護下，將化合物4(20mg,0.017mmol)溶于干燥的甲醇(17mL)中，再加入甲醇鈉(0.119mmol)，室溫下攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應完全，先用酸性樹脂中和PH至中性偏酸性，抽濾，減壓濃縮粗產品，然后柱層析得到白色固體化合物25-O-葡萄糖基環黃芪醇I(8.8mg,80％)。.
對比例1：環黃芪醇的選擇性羥基保護，反應步驟同實施例1，所不同的是化合物2的投料量為300mg，溶劑為為5ml，即化合物2的反應濃度為0.122mol/L主要生成四個羥基都被乙酰基保護的化合物，說明濃度對反應的影響很大。
對比例2：環黃芪醇的選擇性羥基保護，反應步驟同實施例1，所不同的是向體系中加入的不是乙酸酐和DIPEA而是苯甲酰氯和吡啶，得到環黃芪醇的3、6位羥基被苯甲酰基保護的產物。
對比例3，環黃芪醇的選擇性羥基保護，反應步驟同實施例1，以乙酸酐、TMSOTF、DCM作為反應條件體系很亂，沒有明顯的主點。
對比例4：環黃芪醇的選擇性羥基保護，反應步驟同實施例1，用乙酰氯、DBU、DCM作為反應條件體系也較亂，沒有得到理想的產物。