本發明涉及制備蛋白酶水解產物的方法，特別涉及一種利用超聲調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
現代生物代謝研究發現：人類攝取的蛋白質經過消化道的多種酶水解后，不像以前認為的那樣僅以氨基酸的形式吸收，更多的是以肽的形式直接吸收，而且，二肽和三肽的吸收速度比相同組成的氨基酸還要快。
肽(peptide)是α－氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，它也是蛋白質水解的中間產物。
一般，根據肽中氨基酸的數量的不同，肽有多種不同的稱呼：由兩個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類推還有三肽、四肽、五肽等。通常由10～100個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫多肽，它們的分子量低于10，000da(dalton，道爾頓)，能透過半透膜，不被三氯乙酸及硫酸銨所沉淀。也有文獻把由2～10個氨基酸組成的肽稱為寡肽(小分子肽)，分子質量小于6000da，能夠直接參與消化、代謝及內分泌的調節，其吸收機制優于蛋白質和氨基酸。10～50個氨基酸組成的肽稱為多肽。
多肽有生物活性多肽和人工合成多肽兩種。多肽的種類：1、細胞因子模擬肽：利用已知細胞因子的受體從肽庫內篩選細胞因子模擬肽，近年成為國內外研究的熱點。國外已篩選到了人促紅細胞生成素，人促血小板生成素，人生長激素、人神經生長因子及白細胞介素等多種生長因子的模擬肽，這些模擬肽的氨基酸序列與其相應的細胞因子的氨基酸序列不同，但具有細胞因子的活性，并且具有分子量小的優點。細胞因子模擬肽處于臨床前或臨床研究階段。2、抗菌性活性肽：當昆蟲受到外界環境刺激時產生大量的具有抗菌活性的陽離子多肽，已篩選出百余種抗菌肽，體內外實驗證實，多個抗菌肽不僅有很強的殺菌能力還能殺死腫瘤細胞。例如，從蠶體內篩選的抗菌肽d表現了很好的應用前景，并能利用基因工程技術生產。蛇毒內也存在多種活性多肽，從蛇毒內分離出一個13個氨基酸(inkaiaalakkll)小肽，其對g+及g-菌均有極強的殺菌能力。3、用于心血管疾病的多肽：很多植物中藥有降血壓、降血脂、溶血栓等作用，不僅可用作藥物，亦可用作保健食品。現已發現很多有效成分是小分子多肽，比如我國科學家以大豆為原料加工分離出的活性多肽，可通過小腸直接吸收，能防治血栓，高血壓和高血脂，還能延緩變老，提高肌體抗腫瘤力。從人參、茶葉、銀杏葉等植物內也分離出很多用于心血管疾病的小肽。4、其它藥用小肽：小肽藥物除在上述幾大方面已取得較大進展外，在其它很多領域也取得一些進展。比如stiernberg等發現一個合成肽(tp508)能促進傷口血管的再生，加速皮膚深度傷口的愈合。pfister等發現一個小肽(rtr)4能防止堿損傷角膜內炎癥細胞的侵潤，抑制炎癥反應。carron等證實其篩選的2個合成肽能抑制破骨細胞對骨質的重吸收。5、診斷用多肽：多肽在診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體，多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強，且易于制備，因此裝配的檢測試劑，其檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低，易于臨床應用。現在用多肽抗原裝配的抗體檢測試劑包括：甲、乙、丙、庚或肝病毒、艾滋病病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒、風疹病毒、梅毒螺旋體、囊蟲、錐蟲、萊姆病及類風濕等。使用的多肽抗原大部分是從相應致病體的天然蛋白內分析篩選獲得，有些是從肽庫內篩選的全新小肽。
一些多肽是源于蛋白質的多功能化合物，是多樣化且來源充足的食品原料，具有多種人體代謝和生理調節功能，如易消化吸收、促進免疫、激素調節、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等。多數生物活性肽是以非活性狀態存在于蛋白質的長鏈中，當用適當的蛋白酶水解時，其分子片段與活性被釋放出來。
蛋白酶水解產物分子量的分布與水解進程有關，受酶的種類及酶解程序等影響。鄒險峰等(食品科技，2011，36(4)：9-15)研究發現在20g/l的底物濃度下的最佳條件為酶和底物比10000u/g，溫度55℃，ph7.5，水解時間4h，β-伴大豆球蛋白水解肽主要為130～1000u的短肽，占肽總量的86.3％。馬井喜登(中國釀造，2012，31(14)：135～141)研究在4％大豆分離蛋白，alcalase酶與底物比值為700u/g，60℃、ph9中水解3h，發現大豆蛋白的水解物分布不集中，水解物各成分分子量相差很大，可以通過延長水解時間可以增加小肽的數量。張炎研究(大豆蛋白ace抑制肽的酶法制備及分離純化，安徽：合肥工業大學，2007)發現，經過60℃熱處理10min后，木瓜蛋白酶用量150000u/g、40℃、ph8、大豆分離蛋白濃度3％，水解4h后，分子量分布為小于1000d、1000～3000d、3000～10000d、大于10000d分別為47.3％、9.47％、6.35％、4.32％。吳建中(大豆蛋白的酶法水解及產物抗氧化活性的研究，廣州：華南理工大學，2003)研究發現：經過85℃、20min預處理后，在大豆蛋白濃度4.5～8％、50℃、ph7、木瓜蛋白酶用量8000u/g、水解150～200min后，平均肽鏈長度為16。陳亞房(大豆低聚肽制備及其ace抑制活性和螯合特性的研究，北京：中國農業科學研究院，2009)研究發現：采用煮沸10min的預處理后，大豆蛋白溶液濃度5g/100ml、60℃、ph7.5、木瓜蛋白酶用量35000u/g、水解3h后，酶解產物集中在分子量1000d。
cn1085046a公開了一種燕窩的酶法水解加工方法，其基本工藝是采用多種植物蛋白酶、細菌蛋白酶或試劑型蛋白酶，或者采用兩種或兩種以上的復合酶，原料經浸泡、煮沸、調ph值、加酶水解、再煮沸、過濾、離心、干燥等工藝，制成含水量低于5％的白色或黃色的水溶性燕窩粉末。該工藝過程工藝較為復雜，生產周期長，并涉及到高溫煮沸過程，易對燕窩中的熱不穩定性活性成分造成影響，并未涉及到工藝對分子量分布影響的控制。cn1057674a公開了一種燕窩、白扁豆水不溶物的生化提取方法，其工藝是將經水煮沸提取后的燕窩渣、白扁豆渣加水用木瓜酶進行酶解，將水解后的濾液和水煮提取液合并得燕窩提取物。該工藝雖然工藝得到一定簡化，但也直接涉及到水煮工藝，未考慮水煮條件對熱不穩定性成分活性的影響，未提到工藝和分子量分布間的關系。cn1858225a公開了一種燕窩多肽的制備方法和用途，其基本工藝為燕窩原料經冷凍粉碎、無花果蛋白酶水解、沉淀過濾、冷凍干燥或噴物干燥后得到分子量分布在200～1000d之間的燕窩多肽提取物。雖然該工藝提到了對分子量分布的要求，但得到的燕窩多肽提取物多數為1000d以下的肽類，對于1000d～6000d之間的分子量控制工藝并未提及，也未提到工藝條件和分子量分布之間的關系。
2007年12月12日公開的、專利號為cn200710069423.9、名稱為一種化妝品用燕窩提取物的制備工藝的中國發明專利公開了一種化妝品用燕窩提取物的制備工藝，步驟如下：1)燕窩冷凍粉碎過篩，加入燕窩干重20倍量的水，室溫下超聲水提1小時，過濾；2)濾餅中加入燕窩干重30倍量的水，機械攪拌條件下煮沸60分鐘；3)冷卻至室溫，碳酸鈉溶液調ph值至9.8，加入燕窩干重1.5％的堿性蛋白酶，機械攪拌下55℃水浴水解3h；4)85℃酶滅活20min；5)冷卻至室溫，稀hcl調ph值至中性；6)過濾，濾液與超聲提取液合并，冷凍干燥后得粉狀燕窩提取物。
但是，上述公開的現有技術中，均不同程度地存在酶解水解速度慢、時間長、蛋白酶使用量較大等問題，cn200710069423.9中雖然公開了利用超聲提取結合酶解技術制備化妝品用燕窩提取物的技術方案，但其工藝仍存在時間長、工藝復雜等問題。
因此，提供一種方便快捷、工藝簡單、能有效調整水解產物分子量分布的系統和方法就成為該技術領域急需解決的技術難題。
技術實現要素：
本發明的目的之一在于提供一種方便快捷、工藝簡單、能有效調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的系統。
本發明的上述發明目的是通過以下技術方案達到的：
一種超聲輔助酶解系統，其特征在于：包括恒溫水浴，超聲輔助酶解槽和反應罐；其中，所述恒溫水浴與所述超聲輔助酶解槽之間通過管道相連接，所述超聲輔助酶解槽的下部設有超聲波發生器，所述反應罐位于所述超聲輔助酶解裝置的底部。
優選地，所述超聲波發生器的超聲頻率范圍為20～150khz。
優選地，所述超聲波發生器的超聲功率范圍為0.05～0.5w/cm2。
本發明的另一發明目的是提供一種用上述超聲酶解系統進行超聲輔助固定化蛋白酶可控水解產物分子量分布的方法。
本發明的上述發明目的是通過以下技術方案達到的：
一種超聲調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的方法，其步驟如下：
(1)將采用海藻酸鈉或與殼聚糖混合包埋制備的固定化木瓜蛋白酶放入一個盛有大豆分離蛋白溶液的反應罐中；
(2)步驟(1)中所述反應罐置于一個下部設有超聲波發生器的超聲輔助酶解槽中；
(3)步驟(2)所述超聲輔助酶解槽的溫度通過與恒溫水浴中水的不斷循環得以保持恒溫，并進行酶解。
優選地，所述步驟(2)中所述超聲波發生器的頻率范圍為28～135khz。
優選地，所述步驟(2)中所述超聲波發生器的超聲功率范圍為0.05～0.5w/cm2。
優選地，所述步驟(3)中所述恒溫水浴中水的溫度為40～50℃。
優選地，所述步驟(3)中所述酶解的時間t為25<t<35min。
優選地，所述游離木瓜蛋白酶的加入量為1000～1500u/g(大豆分離蛋白)。
優選地，所述大豆分離蛋白溶液的濃度為2％～4％。
優選地，所述大豆分離蛋白溶液ph值為6.0～7.5。
有益效果：
本發明的超聲調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的系統和方法方便快捷、工藝簡單、能有效調整水解產物分子量分布；可以根據對蛋白質水解物分子量分布的要求不同，有針對性地選擇適當頻率的超聲波，為控制蛋白質水解物分子量分布提供了新的途徑。
有益效果：
本發明的超聲調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的系統和方法可以根據對蛋白質水解物分子量分布的要求不同，有針對性地選擇適當頻率的超聲波，為控制蛋白質水解物分子量分布提供了新的途徑。
下面通過附圖和具體實施方式對本發明進行詳細說明。應該理解的是，所述的實施例僅涉及本發明的優選實施方案，在不脫離本發明的精神和范圍情況下，各種成分及含量的變化和改進都是可能的。
附圖說明
圖1是本發明超聲輔助酶解系統的結構示意圖。
主要零部件名稱：
1恒溫水浴2超聲輔助酶解槽
3反應罐4超聲波發生器i
5超聲波發生器ii6超聲波電源i
7超聲波電源ii
具體實施方式
下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限定，該領域的技術工程師可根據發明的內容對本發明做出一些非本質的改進和調整。
在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的內容相同。
如圖1所示，是本發明超聲輔助酶解系統的結構示意圖，其中，1為恒溫水浴；2為超聲輔助酶解槽(內槽長:寬:高＝1:1:0.6)；3為反應罐；4為超聲波發生器i；5為超聲波發生器ii，6為超聲波電源i，7為超聲波電源ii。本發明的超聲輔助酶解系統用于調整游離木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量的分布，包括恒溫水浴1，超聲輔助酶解槽2，其中，內槽長:寬:高＝1:1:0.6，反應罐3，超聲波發生器i4，超聲波發生器ii5，超聲波電源i6，超聲波電源ii7；其中，恒溫水浴1與超聲輔助酶解槽2之間通過管道相連接，恒溫水在恒溫水浴1與超聲輔助酶解槽2之間循環流動，超聲輔助酶解槽2的下部設有超聲波發生器i4和超聲波發生器ii5，超聲輔助酶解槽2的底部放置有反應罐3，超聲波發生器i4和超聲波發生器ii5分別與超聲波電源i6和超聲波電源ii7相連接。超聲波發生器i4和超聲波發生器ii5可以分別產生超聲波的范圍為28～135khz，超聲功率范圍為0.05～0.5w/cm2。
實施例1
一種超聲調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的方法，其步驟如下：
(1)固定化木瓜蛋白酶的制作：稱取0.57g海藻酸鈉和0.03g殼聚糖溶于20mlph7.0的tris-鹽酸緩沖液中，于50℃磁力攪拌加熱至溶解并攪拌均勻，冷卻至室溫，加入1ml0.005g/ml木瓜蛋白酶液，攪拌均勻。將此混合液緩慢滴入0.6mol/l氯化鈣溶液中形成小球，置于4℃冰箱下30min。用去離子水清洗，濾紙擦干備用；
(2)將步驟(1)所制備的用海藻酸鈉與殼聚糖混合包埋制備的固定化木瓜蛋白酶放入一個盛有大豆分離蛋白(質量濃度2％)溶液的反應罐3中；
(3)步驟(2)中所述反應罐3置于一個下部設有兩個獨立頻率的超聲波發生器(超聲波發生器i4和超聲波發生器ii5)的超聲輔助酶解槽2中，超聲波發生器i4超聲頻率設為28khz；
(3)步驟(2)所述超聲輔助酶解槽2的溫度通過與恒溫水浴1中水的不斷循環得以保持恒溫，打開28khz超聲波發生器i4的電源超聲波電源i6，其超聲功率為0.15w/cm2，恒溫為40℃，酶解的時間t為35min，固定化木瓜蛋白酶的加入量為1400u/g(大豆分離蛋白，下同)，大豆分離蛋白溶液的ph值為6.5。
完成后，用高效液相色譜分析法進行測量，得到結果如下：
小于1000da、1000～5000da、5000～10000da、大于10000da水解物分別為5.6％、4.9％、11.9％、77.6％。
實施例2
一種超聲調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的方法，其步驟如下：
(1)固定化木瓜蛋白酶的制作：稱取0.57g海藻酸鈉和0.03g殼聚糖溶于20mlph7.0的tris-鹽酸緩沖液中，于50℃磁力攪拌加熱至溶解并攪拌均勻，冷卻至室溫，加入1ml0.005g/ml木瓜蛋白酶液，攪拌均勻。將此混合液緩慢滴入0.6mol/l氯化鈣溶液中形成小球，置于4℃冰箱下30min。用去離子水清洗，濾紙擦干備用；
(2)將步驟(1)所制備的用海藻酸鈉與殼聚糖混合包埋制備的固定化木瓜蛋白酶放入一個盛有大豆分離蛋白(質量濃度2.5％)溶液的反應罐3中；
(3)步驟(2)中所述反應罐3置于一個下部設有兩個獨立頻率的超聲波發生器(超聲波發生器i4和超聲波發生器ii5)的超聲輔助酶解槽2中，超聲波發生器i4超聲頻率設為50khz；
(3)步驟(2)所述超聲輔助酶解槽2的溫度通過與恒溫水浴1中水的不斷循環得以保持恒溫，打開50khz超聲波發生器i4的電源超聲波電源i6，其超聲功率為0.05w/cm2，恒溫為45℃，酶解的時間t為30min，固定化木瓜蛋白酶的加入量為1200u/g，大豆分離蛋白溶液的ph值為7.1。
完成后，用高效液相色譜分析法進行測量，得到結果如下：小于1000da、1000～5000da、5000～10000da、大于10000da水解物分別為47.5％、1.7％、3.5％、47.3％。
實施例3
一種超聲調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的方法，其步驟如下：
(1)固定化木瓜蛋白酶的制作：稱取0.57g海藻酸鈉和0.03g殼聚糖溶于20mlph7.0的tris-鹽酸緩沖液中，于50℃磁力攪拌加熱至溶解并攪拌均勻，冷卻至室溫，加入1ml0.005g/ml木瓜蛋白酶液，攪拌均勻。將此混合液緩慢滴入0.6mol/l氯化鈣溶液中形成小球，置于4℃冰箱下30min。用去離子水清洗，濾紙擦干備用。
(2)將步驟(1)所制備的用海藻酸鈉與殼聚糖混合包埋制備的固定化木瓜蛋白酶放入一個盛有大豆分離蛋白(質量濃度3.5％)溶液的反應罐3中；
(3)步驟(2)中所述反應罐3置于一個下部設有兩個獨立頻率的超聲波發生器(超聲波發生器i4和超聲波發生器ii5)的超聲輔助酶解槽2中，超聲波發生器ii5超聲頻率設為135khz；
(3)步驟(2)所述超聲輔助酶解槽2的溫度通過與恒溫水浴1中水的不斷循環得以保持恒溫，打開135khz超聲波發生器i5的電源超聲波電源i7，其超聲功率為0.35w/cm2，恒溫為43℃，酶解的時間t為30min，固定化木瓜蛋白酶的加入量為1500u/g，大豆分離蛋白溶液的ph值為6.0。
完成后，用高效液相色譜分析法進行測量，得到結果如下：小于1000da、1000～5000da、5000～10000da、大于10000da水解物分別為61.1％、4.2％、7.4％、27.3％。
實施例4
一種超聲調整木瓜固定化蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的方法，其步驟如下：
(1)固定化木瓜蛋白酶的制作：稱取0.57g海藻酸鈉和0.03g殼聚糖溶于20mlph7.0的tris-鹽酸緩沖液中，于50℃磁力攪拌加熱至溶解并攪拌均勻，冷卻至室溫，加入1ml0.005g/ml木瓜蛋白酶液，攪拌均勻。將此混合液緩慢滴入0.6mol/l氯化鈣溶液中形成小球，置于4℃冰箱下30min。用去離子水清洗，濾紙擦干備用。
(2)將步驟(1)所制備的用海藻酸鈉與殼聚糖混合包埋制備的固定化木瓜蛋白酶放入一個盛有大豆分離蛋白(質量濃度4.0％)溶液的反應罐3中；
(3)步驟(2)中所述反應罐3置于一個下部設有兩個獨立頻率的超聲波發生器(超聲波發生器i4和超聲波發生器ii5)的超聲輔助酶解槽2中，超聲波發生器i4超聲頻率設為40khz；
(3)步驟(2)所述超聲輔助酶解槽2的溫度通過與恒溫水浴1中水的不斷循環得以保持恒溫，打開40khz超聲波發生器i4的電源超聲波電源i6，其超聲功率為0.35w/cm2，恒溫為50℃，酶解的時間t為25min，固定化木瓜蛋白酶的加入量為1000u/g，大豆分離蛋白溶液的ph值為7.5。
完成后，用高效液相色譜分析法進行測量，得到結果如下：小于1000da、1000～5000da、5000～10000da、大于10000da水解物分別為18.6％、26.2％、19.2％、36.0％。
本發明的超聲調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布的系統和方法在28～135khz范圍內選擇一個頻率的超聲波，一個頻率超聲波單獨作用，超聲波的強度0.05～0.5w/cm2，固定化木瓜蛋白酶用量為1000～1500u/g(大豆分離蛋白即大豆蛋白)，大豆分離蛋白溶液濃度為2％-4％，酶解溫度為40～50℃下處理不超過30min。
本發明人發現，超聲波可以用于調整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白產物分子量分布，超聲波是一種縱波，在介質中傳播時，會產生熱效應、機械效應和空化效應，引起介質的一些特性變化，可能因為上述特性，超聲波技術對有效成分的提取、高分子的降解等都有較好的促進作用。本發明的超聲波酶促反應具有高效、廉價、無污染、操作簡單、技術易推廣應用等特點，通過強化傳質等可提高酶促反應速度和有效成分的產率。
本發明的超聲調整固定化蛋白酶水解產物分子量分布的方法可以根據期望的蛋白質水解物分子量分布有針對性地選擇適當頻率的超聲波、超聲功率和處理時間，為多肽的工業化生產提供了新的途徑。