多肽融合蛋白GWP在抗立氏立克次體的免疫保護中的應用的制作方法

本發明屬于免疫學領域，涉及多肽融合蛋白gwp在抗立氏立克次體的免疫保護中的應用，特別涉及多肽融合蛋白gwp在抗立氏立克次體(rickettsiarickettsii)所致落基山斑點熱的免疫保護中的應用。

背景技術：

立氏立克次體(rickettsiarickettsii)是一種嚴格胞內寄生的革蘭氏陰性菌，是落基山斑點熱(rockymountainspottedfever，rmsf)的病原體。該菌主要分布在北美洲，其為斑點熱群立克次體(spottedfevergrouprickettsia，sfgr)中毒力最強的一個種，被列為生物戰劑和潛在的生物恐怖劑。

落基山斑點熱是一種嚴重威脅人類健康的人獸共患自然疫源性疾病。rmsf最早發現在美國西北部的愛達荷州和蒙大拿州，1899年maxey報告了第一例rmsf臨床病例。在1906到1909年之間，ricketts首先對該病進行了病原學研究，他證實了安氏革蜱為該病的傳播媒介。

rmsf的早期臨床表現主要有發熱，頭痛和肌痛。后期病情嚴重者可出現血壓下降，未接受治療者可產生肺炎，組織壞死和循環衰竭，并發心和腦后遺癥。在暴發型病例可因心跳突然停止而死亡。雖然抗生素治療對落基山斑點熱有效，但由于立氏立克次體能以氣溶膠的形式傳播，一旦流行難以控制。并且rmsf早期癥狀缺乏特異性，很難與其他疾病相區別，難以做到早發現早治療。因此采用有效的疫苗作為預防接種是防止rmsf發生和流行的最有效手段。

二十世紀中期到末期，rmsf疫苗的研制主要集中在滅活疫苗上。1970年美國陸軍傳染病醫學研究所用雞胚成纖維細胞培養立氏立克次體并通過蔗糖密度梯度離心獲得純化的病原體，將純化立克次體甲醛滅活后制成疫苗，在1983年進行的人體保護性試驗中證明該疫苗可以保護25％的接種者，可減輕患者的發熱反應，并能使四環素的治療效果更快更好。但是該滅活疫苗僅提供有限的保護作用，遠沒有達到有效疫苗保護標準。另外制備立氏立克次體滅活疫苗通常需要雞胚或者細胞大量培養立克次體，但是提取純化立克次體的防護要求高，工藝復雜，成本昂貴，因此難以大量制備和推廣使用。

隨著對rmsf疫苗研究的不斷深入以及蛋白質組學的飛速發展，人們將目光轉向了亞單位。研究發現立氏立克次體外膜蛋白a(ompa)、外膜蛋白b(ompb)以及普氏立克次體外膜蛋白b(ompb)免疫產生的抗體可以中和立克次體對小鼠的致死毒性，給予ompa及ompb的單克隆抗體可以保護豚鼠有效抵抗致死劑量的立氏立克次體的感染并交叉保護小鼠抵抗死劑量的康氏立克次體(r.conorii)的感染。這些外膜蛋白盡管有一定的保護作用，但是其免疫保護效果有限，目前難以代替滅活rmsf疫苗。因此，鑒定立氏立克次體的保護性抗原，研發更加安全、有效、持久的亞單位疫苗對預防rmsf具有重大的意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種多肽融合蛋白gwp在抗立氏立克次體的免疫保護中的應用。

本發明所提供的多肽融合蛋白gwp，含有如下6個片段：

片段1：氨基酸序列為序列表中序列1的第1-15位；片段2：氨基酸序列為序列表中序列1的第20-34位；片段3：氨基酸序列為序列表中序列1的第39-53位；片段4：氨基酸序列為序列表中序列1的第58-72位；片段5：氨基酸序列為序列表中序列1的第77-91位；片段6：氨基酸序列為序列表中序列1的第96-110位。

進一步，所述多肽融合蛋白gwp，具體為如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。

編碼所述多肽融合蛋白gwp的基因也屬于本發明的保護范圍。

所述基因中編碼所述片段1的dna序列可為如下(a1)-(a3)中任一：

(a1)序列表中序列2的第1-45位所示dna序列；

(a2)在嚴格條件下能與(a1)限定的dna序列雜交且編碼所述片段1的dna序列；

(a3)與(a1)或(a2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼所述片段1的dna序列；

所述基因中編碼所述片段2的dna序列可為如下(b1)-(b3)中任一：

(b1)序列表中序列2的第58-102位所示dna序列；

(b2)在嚴格條件下能與(b1)限定的dna序列雜交且編碼所述片段2的dna序列；

(b3)與(b1)或(b2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼所述片段2的dna序列；

所述基因中編碼所述片段3的dna序列可為如下(c1)-(c3)中任一：

(c1)序列表中序列2的第115-159位所示dna序列；

(c2)在嚴格條件下能與(c1)限定的dna序列雜交且編碼所述片段3的dna序列；

(c3)與(c1)或(c2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼所述片段3的dna序列；

所述基因中編碼所述片段4的dna序列可為如下(d1)-(d3)中任一：

(d1)序列表中序列2的第172-216位所示dna序列；

(d2)在嚴格條件下能與(d1)限定的dna序列雜交且編碼所述片段4的dna序列；

(d3)與(d1)或(d2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼所述片段4的dna序列；

所述基因中編碼所述片段5的dna序列可為如下(e1)-(e3)中任一：

(e1)序列表中序列2的第229-273位所示dna序列；

(e2)在嚴格條件下能與(e1)限定的dna序列雜交且編碼所述片段5的dna序列；

(e3)與(e1)或(e2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼所述片段5的dna序列；

所述基因中編碼所述片段6的dna序列可為如下(f1)-(f3)中任一：

(f1)序列表中序列2的第286-330位所示dna序列；

(f2)在嚴格條件下能與(f1)限定的dna序列雜交且編碼所述片段6的dna序列；

(f3)與(f1)或(f2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼所述片段6的dna序列。

更加具體的，所述基因為如下1)或2)或3)的dna分子：

1)序列表中序列2所示的dna分子；

2)在嚴格條件下與1)限定的dna分子雜交且編碼所述蛋白質的dna分子；

3)與1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼所述蛋白質的dna分子。

上述嚴格條件可為用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

含有所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。

在本發明的一個實施例中，所述重組載體具體為在pet-32a(+)載體的bamhi和xhoi酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈dna分子后得到的重組質粒，命名為pet-32a(+)-gwp。

重組載體pet-32a(+)-gwp中，序列2所示的雙鏈dna分子與載體骨架上的his標簽形成融合基因，表達融合蛋白，從而可用ni-nta進行純化。即本發明實施例中的所述多肽融合蛋白gwp具體為重組載體pet-32a(+)-gwp所表達的融合蛋白。

所述蛋白質或所述基因或所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在如下任一中的應用也屬于本發明的保護范圍：

(a)制備用于預防和/或治療由立氏立克次體(rickettsiarickettsii)引起的疾病的產品；

(b)制備用于降低被立氏立克次體(rickettsiarickettsii)感染的動物的臟器組織內立氏立克次體數量的產品；

(c)制備針對立氏立克次體(rickettsiarickettsii)的保護性抗原。

其中，所述保護性抗原是指立氏立克次體能刺激機體發生保護性免疫應答的抗原成分。

另外，活性成分包括所述多肽融合蛋白gwp，且具有如下(a)或(b)所示功能的產品也屬于本發明的保護范圍：

(a)預防和/或治療由立氏立克次體(rickettsiarickettsii)引起的疾病；

(b)降低被立氏立克次體(rickettsiarickettsii)感染的動物的臟器組織內立氏立克次體數量。

進一步，所述產品的活性成分可由所述多肽融合蛋白gwp和佐劑組成。

所述佐劑可為弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑、明礬佐劑、脂質體佐劑等。

所述弗氏佐劑具體可為弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。

在本發明中，所述疾病具體可為落基山斑點熱。所述臟器具體可為肺臟、脾臟和/或肝臟。所述產品具體可為疫苗。

本發明的發明人發現立氏立克次體的多肽融合蛋白gwp可以作為一種抗原蛋白，能夠刺激機體產生免疫應答對抗立氏立克次體毒株攻擊，為具有落基山斑點熱疫苗功能的保護性抗原。多肽融合蛋白gwp可通過基因工程制備，用多肽融合蛋白gwp作為疫苗，與菌體蛋白疫苗相比，具有制備方法簡單、成本低、產量高、更安全等優點。本發明對于落基山斑點熱的防疫和治療具有重大價值。

附圖說明

圖1為elispot法篩選陽性th1表位肽。

圖2為為多肽融合蛋白gwp的組成表位肽、重組質粒構建及誘導表達示意圖。

圖3為重組質粒的dna電泳檢測結果。

圖4為目標dna測序結果。

圖5為多肽融合蛋白溶液的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。

圖6為實時熒光定量pcr檢測免疫小鼠肝臟、脾臟、肺臟組織中內立氏立克次體拷貝數評價蛋白抗原gwp的免疫保護效果。其中，a為肝臟結果；b為脾臟結果；c為肺臟結果。實驗數據以立氏立克次體ompb基因拷貝數與小鼠actin基因拷貝數之比表示，各組數據以mean+sem表示。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中所用試劑如無特殊說明，均購自國藥集團化學試劑公司。

下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

下述實施例中利用儀器nanodrop1000分光光度計(購自thermoscientific公司)進行蛋白濃度的測定；利用儀器7300realtimepcrsystem(購自appliedbiosystems公司)進行立氏立克次體拷貝數的測定。

載體pet-32a(+)：novagen公司產品，產品目錄號為69015。

大腸桿菌bl21：novagen公司產品，產品目錄號為69450。

c3h/hen小鼠(6-7周齡，雄性)：北京維通利華公司產品。

弗氏完全佐劑：sigma公司產品，產品目錄號為f-5881。

弗氏不完全佐劑：sigma公司產品，產品目錄號為f-5506。

鎳-nta瓊脂糖凝膠(ni-nta)試劑盒：qiagen公司產品，產品目錄號為30230。

dna提取試劑盒：qiagen公司產品，產品目錄號為69506。

辣根過氧化物酶標記羊抗鼠igg：中科瑞泰公司產品，產品目錄號為zb-2305。

所有限制性內切酶：大連takara公司產品。

實施例中所用的立氏立克次體(rickettsiarickettsii)均為立氏立克次體sheilasmith株(rickettsiarickettsii，sheilasmithstrain)，在文獻“ellisondw，clarktr，sturdevantde，virtanevak，porcellasf，hackstadtt.genomiccomparisonofvirulentrickettsiarickettsiisheilasmithandavirulentrickettsiarickettsiiiowa.infectimmun.2008feb；76(2)：542-50.epub2007nov19.”中已報道，在符合生物安全操作規范的情況下，公眾可從申請人處獲得，僅可用于重復本發明實驗使用。

主要試劑的配制

1、pcr反應用2×mix的配制(1ml)：

加去離子水定容至1ml。

2、lb液體培養基的配制(1000ml)：

加去離子水定容至1000ml，121℃，15min高壓滅菌。

3、lb固體培養基的配制(1000ml)：

加去離子水定容至1000ml，121℃，15min高壓滅菌。

4、可溶性表達形式目的蛋白純化所需緩沖液的配制：

(1)可溶性蛋白裂解緩沖液ph8.0(1000ml)：

用去離子水溶解并定容到1000ml，naoh調節ph至8.0。

(2)包涵體表達形式目的蛋白純化所需緩沖液的配制：

①包涵體蛋白裂解緩沖液ph8.0(1000ml)：

用去離子水溶解并定容到1000ml，naoh調節ph至8.0。

②包涵體蛋白洗滌緩沖液ph6.3(1000ml)：

用去離子水溶解并定容到1000ml，naoh調節ph至6.3。

③包涵體蛋白洗脫緩沖液ph4.5(1000ml)：

用去離子水溶解并定容到1000ml，naoh調節ph至4.5。

實施例1、elispot技術篩選陽性表位肽

1、從ncbi數據庫中獲取adr2(a1g_07050)、ompb(a1g_06030)和ybgf(a1g_01780)保護性抗原的蛋白序列，將蛋白序列輸入iedb服務器預測出各自限制型mhcii類分子結合位點。

2、將上述數據庫預測出的表位肽通過排序打分，優先選擇在各個數據庫中得分較高的15肽序列并合成th1表位。

3、將純化后的立氏立克次體經65℃滅活30分鐘，既得立氏立克次體全菌抗原(wca)。按照5×10⁶pfu(空斑形成單位)/只的劑量用wca免疫c3h/hen小鼠10只，另外用pbs免疫c3h/hen小鼠5只用作抗原提呈細胞(apc)的制備。免疫后第15天處死小鼠，解剖取脾，利用cd4⁺t淋巴細胞分選試劑盒(德國miltenyi公司)分離出致敏的cd4⁺t淋巴細胞。利用細胞計數器，測定上述分選的t淋巴細胞和apc數目，分別按照2∶1的數目混合后100μl/孔鋪板，使得各自終濃度分別為2×10⁵和1×10⁵。實驗組按照2μg/孔的量加入步驟2中合成的表位肽，另一組不加入表位肽，僅含有細胞及培養基，用作空白對照組。將96孔elispot板置于含5％co2的37℃細胞培養箱孵育18-24h。孵育結束后，最后通過elispot技術檢測上述96孔板中cd4⁺t淋巴細胞分泌ifn-γ的水平，待斑點達到要求后讀板，掃描，計數各孔中斑點的數量。根據si值篩選陽性表位肽。si值表示抗原刺激指數，定義為表位肽刺激組(實驗組，含有表位肽、細胞和培養基)斑點數與空白對照組(不加入表位肽，僅有細胞和培養基)斑點數之比，當si＞2時則認為陽性。

4、通過上述方法，共篩選出6條陽性表位肽，其si值分別為：ybgf57-71：4.80，ompb152-166：2.29，ompb399-413：11.13，ompb563-577：3.60，ompb698-712：3.85和ompb1411-1425：2.42(圖1)。

5、每個thl陽性表位含有15個氨基酸，分別為：

ybgf57-71：lqhkidlltqnsnis

ompb152-166：qnvvvqfnngaaidn

ompb399413：ntdfgnlaaqikvpn

ompb563-577：tidlqanggtiklts

ompb698-712：tnplaeinfgskgvn

ompb1411-1425：nlmigaaigitktdi

實施例2、重組質粒構建及多肽融合蛋白表達

1、將實施例1中所述6個陽性表位以gggs接頭相連接組成多肽融合蛋白gwp的氨基酸序列，具體如序列表中序列1所示。將如圖2所示的6條表位相對應的基因序列由gggs相對應的基因序列前后連接成完整的基因，具體如序列表的序列2所示(基因命名為gwp)，隨后送上海生工進行目的基因的合成，合成產物含有“ggatcc+序列2+ctcgag”所示dna片段。

2、用限制性內切酶bamhi和xhoi雙酶切步驟1中人工合成的目的基因“ggatcc+序列2+ctcgag”，回收酶切產物。

3、用限制性內切酶bamhi和xhoi雙酶切載體pet-32a(+)，回收載體骨架。

4、將步驟2所得的酶切產物與步驟3所得的載體骨架進行連接，得到重組質粒。

5、重組質粒經dna電泳發現大小約為6242bp，與預期大小相符(圖3)。并進一步對重組質粒進行測序驗證(圖4)。

重組質粒結構描述如下：在載體pet-32a(+)的bamhi和xhoi酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈dna分子(所述雙鏈dna分子與載體骨架上的his標簽形成融合基因，表達融合蛋白，從而可用ni-nta進行純化)。將該重組質粒命名為pet-32a(+)-gwp。

6、將重組質粒pet-32a(+)-gwp導入大腸桿菌bl21，得到重組菌。重組菌的驗證方法：將菌株接入lb固體培養基平板(含200mg/l氨芐青霉素)，挑取單克隆并轉接入lb液體培養基，37℃培養并提取質粒進行測序，如果提取的質粒為重組質粒pet-32a(+)-gwp，即為目的重組菌。

7、多肽融合蛋白的表達

將重組菌接入lb液體培養基(含200mg/l氨芐青霉素)，37℃、200r/min培養過夜。次日按照1％(體積百分含量)的接種量轉接入相同抗生素濃度的lb液體培養基中，在37℃、200r/min條件下培養至od600值≈0.6時，加入iptg誘導劑(0.1mm)后在25℃、200r/min條件下繼續進行誘導表達8h，得到發酵液。

8、多肽融合蛋白的純化

(1)取步驟7的發酵液100ml，5000rpm離心10min，收集菌體沉淀。

(2)用30ml可溶性蛋白裂解緩沖液重懸步驟(1)中得到的菌體，吹打混勻后冰浴條件下進行超聲，超聲條件為：工作4.5sec，間隔9sec，共超聲60min，功率為125w。將超聲裂解物以12,000×g離心20min，棄去上清，將10ml包涵體蛋白裂解液加入沉淀部分，并且充分吹打混勻，室溫放置過夜。

(3)翌日，將步驟(2)中得到的過夜混合物與2mlni-nta混合，室溫200rpm振蕩混勻4h，使得目的蛋白(多肽融合蛋白)與ni-nta充分結合，然后將混合物移入純化柱內，用包涵體蛋白洗滌緩沖液洗滌3次，每次10ml(流速控制為3ml/min)。然后用包涵體蛋白洗脫緩沖液洗脫5次，每次500ul(流速控制為3ml/min)，合并收集的洗脫液并測蛋白濃度，得到目的蛋白溶液(多肽融合蛋白溶液)。

9、多肽融合蛋白的鑒定

將多肽融合蛋白溶液進行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果見圖5。多肽融合蛋白溶液只顯示一條約31kda的條帶，與預期相符合。

實施例3、多肽融合蛋白gwp的保護性評價

一、小鼠免疫及立氏立克次體拷貝數檢測

1、小鼠免疫

(1)分層抽樣：將6-7周齡的雄性c3h/hen小鼠20只按照體重分為兩大組，每大組小鼠體重接近，然后分別將兩大組等量地分配到4個實驗組中，每組5只c3h/hen小鼠。

(2)對照組設置：多肽融合蛋白gwp為實驗組，pbs組為陰性對照組，全菌蛋白wca(6×10⁶個/只c3h/hen小鼠)組為陽性對照組，表位肽ompb399(即ompb399413：ntdfgnlaaqikvpn)為表位肽對照組。

(3)免疫方案：

其中，cfa表示完全弗氏佐劑；ifa表示不完全弗氏佐劑。每次免疫佐劑和蛋白各100μl。

2、立氏立克次體攻擊重組蛋白免疫的c3h小鼠

(1)用立氏立克次體通過腹腔注射感染上述重組蛋白免疫的c3h/hen小鼠，劑量為6×10⁶個/只。

(2)攻毒5天后，將各組小鼠處死，摘取脾臟、肺臟、肝臟。

3、rt-pcr檢測各臟器中立氏立克次體拷貝數

(1)將小鼠臟器放入1.5mlep管中，加入700μlpbs后研磨臟器，加入pbs將研磨液總體積補充到1.5ml(由于肺臟體積較小，因此將研磨液總體積定為800μl)。從ep管中吸取100μl研磨液按照組織dna提取試劑盒的說明進行dna提取。

(2)利用rt-pcr檢測各臟器中立氏立克次體的載量，進行統計分析，比較和評價各目標蛋白的保護性。

實時熒光定量pcr所用的引物及探針序列如下表1所示：

表1立氏立克次體實時熒光定量探針及引物序列

取立氏立克次體拷貝數分別為1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³的標準品各1μl，以立氏立克次體ompb上下游引物和taqmanmgb探針進行實時熒光定量pcr，得到與脾組織或肝組織或肺組織進行同一批次實時熒光定量pcr的標準曲線方程。該標準曲線方程在臟器中與同批次的小鼠actin拷貝數共用。同時，取1μl各組小鼠脾組織或肝組織或肺組織提取的dna作為模板、以立氏立克次體ompb或小鼠actin上下游引物及各自taqmanmgb探針進行同一批次的實時熒光定量pcr。通過標準曲線將各組小鼠臟器組織的實時熒光定量pcr結果換算為立氏立克次體的拷貝數與小鼠actin內參拷貝數，并計算兩者之比。

與脾組織進行同一批次實時熒光定量pcr的標準曲線方程為ct＝-3.22×logco+37.13。與肝組織進行同一批次實時熒光定量pcr的標準曲線方程為ct＝-3.32×logco+37.99。與肺組織進行同一批次實時熒光定量pcr的標準曲線方程為ct＝-3.21×logco+37.89。三個標準曲線方程中，co均代表拷貝數。三個標準曲線方程的r²值均大于98％。

實驗結果數據以立克次體拷貝數與小鼠actin內參之比表示(圖6)，其大小表示立克次體相對量的多少。對定量pcr結果運用sas9.1軟件進行單因素多水平方差分析及snk法進行兩兩之間的比較(相同字母表示之間沒有顯著性差異)。

肝組織中立氏立克次體拷貝數結果見表2和圖6中a。

脾組織中立氏立克次體拷貝數結果見表3和圖6中b。

肺組織中立氏立克次體拷貝數結果見表4和圖6中c。

表2肝臟組織檢測結果

表3脾臟組織檢測結果

表4肺臟組織檢測結果

統計學分析顯示，在肝臟的檢測中，多肽融合蛋白gwp組和ompb399組與pbs陰性對照組之間沒有顯著性差異，wca組與pbs組之間有顯著性差異(p＝0.0430)。

在脾臟的檢測中，多肽融合蛋白gwp組和wca組與pbs陰性對照組之間有顯著性差異(p＝0.0248)，而ompb399組與pbs陰性對照組之間沒有顯著性差異。

在肺臟的檢測中，多肽融合蛋白gwp組和wca組與pbs陰性對照組之間有顯著性差異(p＝0.0014)，而ompb399組與pbs陰性對照組之間沒有顯著性差異。

與陰性對照組相比，實驗組可減少立式立克次體在肝組織、脾組織及肺組織中數量的16.4％、39.7％和75.3％，陽性對照組可減少立克次體菌體在肝組織、脾組織及肺組織中增值的54.0％、70.1％和89.8％，由此可知，肝臟中多肽融合蛋白gwp的免疫保護性占全菌蛋白免疫保護性的比例為：16.4％/54.0％＝30.4％；脾臟中多肽融合蛋白gwp的免疫保護性占全菌蛋白免疫保護性的比例為：39.7％/70.1％＝56.6％；肺臟中多肽融合蛋白gwp的免疫保護性占全菌蛋白免疫保護性的比例為：75.3％/89.8％＝83.9％。由于肺臟是立氏立克次體最主要的靶器官，因此可以認為多肽融合蛋白gwp的免疫保護性可達到全菌蛋白免疫保護性的83.9％以上。