本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及棒狀桿菌組成型表達載體啟動子及其構建方法，本發明還涉及含有所述該啟動子的表達載體及重組菌株。
背景技術：
：棒狀桿菌是一類革蘭氏陽性菌，棒狀桿菌的三個主要代表：谷氨酸棒狀桿菌，黃色短桿菌和乳糖發酵短桿菌，已經被廣泛用于生產氨基酸和核苷酸等多種化學物質(liebl等，1991)。經過物理或化學方法誘變處理得到的棒狀桿菌突變株具有較強的合成目的有用物質的能力，而通過遺傳工程和代謝工程對棒狀桿菌野生菌株或突變株進行改造，可以獲得具有更高生產強度的菌株。代謝工程改造即是在棒桿菌的多種代謝途徑中尋找關鍵的代謝酶，通過基因工程改造調控關鍵代謝酶的基因表達。通常基因都是在啟動子的控制下表達，其表達強度依賴于啟動子元件。來自大腸桿菌、鏈霉菌和枯草芽孢桿菌的啟動子能夠在棒狀桿菌屬細菌中表達，可應用于棒狀桿菌的載體系統構建，如應用來源于大腸桿菌的ptac、ptrc啟動子構建的表達質粒pxmj19，pec-xk99e，基因在laciq的控制下進行誘導表達，但表達量低，且在生產過程中需要添加誘導劑iptg，而iptg相當昂貴，不適于用做大規模生產目的產品的基因表達誘導劑；乳糖能夠用來替代iptg作為誘導物應用于大規模的生產，而對于絕大多數的棒狀桿菌菌株而言，乳糖都不能進入其細胞中(brabetz等,1991)，這也限制了誘導型表達系統在棒狀桿菌中的應用。組成型啟動子不需誘導等特殊條件即可在菌體存活期持續不斷地表達外源基因，從而簡化了操作過程、且具有相對較高的安全性，因此更適合在實際生產中應用。在不同細菌的管家基因中應用pcr擴增dna探針等手段篩選并純化具有強表達性的組成型基因，篩選出組成型的強啟動子，用于重組載體的構建(jensenpretal.,applenvironmicrobiol,1998,64(1):82-87.)。楊柳等利用谷氨酸棒狀桿菌atcc13032的內源強啟動子pgro有效促使外源基因xyla在谷氨酸棒狀桿菌atcc13032中的表達(楊柳等，新能源進展，2014,5(2):353-357)，王小元等通過突變得到轉錄啟動功能的tac-m啟動子，構建組成型表達載體pdxw-10，在棒狀桿菌中，該載體表達外源蛋白的水平適中(cn：200910210962.9)。組成型啟動子表達雖然具有很多優點，但目前篩選方法復雜，且如何選擇合適的啟動子進行調控，以避免因為過量的蛋白表達而導致宿主菌生長停滯或代謝障礙，或使宿主能量耗竭以及質粒丟失是工業化生產亟待解決的問題。目前存在使用如pgro作為啟動子，與目的基因一起構建組成表達型質粒，這類質粒在細菌對數生長期也進行目的基因的表達，導致質粒在穩定期之前丟失嚴重，從而降低了表達效果。本發明的目的就是建立一種方法，尋找細菌對數生長期沉默，細菌生長停滯期高效表達的啟動基因，用它來構建組成型高效表達質粒。在本發明中，我們應用轉錄組測序的分析數據，尋找一類能調控目的基因在對數期表達弱，而穩定期大量表達的啟動子，一般這類啟動子都是可調控型啟動子，我們截取這些啟動子不同的基因片段，構建了一系列棒狀桿菌組成型表達載體，該系列表達載體應用綠色熒光蛋白(egfp)作為標記基因，探測各啟動子片段活性強弱，且考核各探測質粒傳代穩定性，從而篩選出一系列對數期啟動子活力低、穩定期啟動活力高的啟動子，并考核含各啟動子的質粒傳代穩定性，進一步篩選出使質粒穩定的啟動子。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是：目前的組成型啟動子篩選方法復雜，而且篩選的啟動子構建的表達質粒在宿主生長中容易丟失，還會影響宿主的生長與代謝。如何建立一個組成型啟動子的快速篩選方法，且篩選出穩定期啟動活力高的內源啟動子，且啟動子構建的質粒在菌體生長的穩定期能保證質粒的穩定性是我們需要解決的問題。本方面所采用的技術方案是：一種基于轉錄組測序構建棒狀桿菌組成型表達載體啟動子的方法，分析棒狀桿菌在對數期與穩定期各基因的轉錄水平，通過對各基因在兩個時期的轉錄豐度分析，篩選出一類對數期轉錄水平低，而穩定期轉錄水平高的基因，通過啟動子預測軟件分析基因的啟動子區域，使用pcr擴增這類基因的啟動子片段，并將啟動子的dna片段連入表達載體中，插入標記基因，構建啟動子探測載體，電轉化探測載體到宿主細胞中，培養宿主細胞到對數期和穩定期，多功能酶標儀檢測細菌生長的od與熒光蛋白表達情況，同時在無抗性壓力的情況下，進行連續傳代，選擇探測載體對數期熒光值低、穩定期熒光值高且連續傳代50代而質粒不丟失的宿主細胞，其含有的啟動子即為棒狀桿菌組成型表達載體啟動子。一種基于轉錄組測序構建的棒狀桿菌組成型表達載體啟動子，其核苷酸序列如seqidno：1所示。一種棒狀桿菌組成型表達載體，含有以上所述的啟動子。所述的棒狀桿菌組成型表達載體，它是在質粒hy-p19的酶切位點插入以上所述的啟動子和目的基因(gnd基因)構建而成，所述質粒hy-p19的核苷酸序列如seqidno：2所示，所述目的基因的核苷酸序列如seqidno：3所示。所述的表達載體電轉化宿主細胞谷氨酸棒狀桿菌獲得的重組菌株。所述的重組菌株在生產異亮氨酸中的應用。本發明的有益效果：此類啟動子構建的表達載體，對數期目的基因蛋白表達量低，但穩定期目的蛋白表達量相對于對數期大幅度提高，且對宿主菌生長影響低，質粒傳代穩定性高，適合于對數期不需要表達，而穩定期需要高度表達的目的基因的載體構建。尤其適合于氨基酸發酵用工程菌株的構建。本發明構建的啟動子、表達載體和重組菌株在發酵生產異亮氨酸時，可提高產酸量和糖酸轉化率，降低雜酸含量，具有很高的應用前景。附圖說明圖1是啟動子探測載體hy-p19-promoter-egfp的構建流程圖。具體實施方式下面通過實施例對本發明進行詳細地說明。實施例11、轉錄組測序樣本制備與轉錄信息分析：細菌培養：挑一環不帶質粒的生產異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌(h5菌株，從保藏中心獲得，保藏編號為cctccno：m2016609)，在lb培養基中，31℃培養過夜，將菌液取出離心，用等體積的無菌水重懸，以5％的接種量接入lbg新鮮滅菌的培養基中，31℃，200rpm培養至對數期中期與穩定期前期，取出發酵液，迅速與等體積bacteriareagent(qiagen)混合，5000rpm離心10min，稱量100mg濕菌體，迅速放入液氮中保存。rna提取：將液氮中保存的樣品放入用液氮預冷的研缽中，加入適量液氮，保證研缽中的液氮不干，將樣品研磨成粉末狀，然后按照qiagenrneasyplantminikit的實驗步驟進行rna提取。提取后的樣品跑1％的瓊脂糖凝膠檢測，要求無蛋白污染，即瓊脂糖膠的膠孔無明顯亮帶。用nanodropspectrophotometer進行核酸濃度檢測，對數期樣品濃度421ng/ul，穩定期樣品濃度237ng/ul，達到送樣無明顯蛋白污染、核酸濃度>60ng/ul測序要求。2、轉錄組測序：提取rna樣品委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行測序。測序流程如下：樣品檢測合格后，通過ribo-zero試劑盒去除rrna來富集mrna。隨后加入fragmentationbuffer將mrna打斷成短片段，以mrna為模板，用六堿基隨機引物(randomhexamers)合成一鏈cdna，然后加入緩沖液、dntps(dntp中的dttp用dutp取代)和dnapolymerasei和rnaseh合成二鏈cdna，再用ampurexpbeads純化雙鏈cdna，之后用user酶降解含有u的cdna第二鏈。純化的雙鏈cdna先進行末端修復、加a尾并連接測序接頭，再用ampurexpbeads進行片段大小選擇。最后進行pcr擴增，并用ampurexpbeads純化pcr產物，得到最終的文庫。文庫構建完成后，先使用qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至1ng/ul，隨后使用agilent2100對文庫的插入片段長度(insertsize)進行檢測，insertsize符合預期后，使用q-pcr方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度＞2nm)，以保證文庫質量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后進行hiseq/miseq測序。3、生物信息分析流程：測序結果委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行信息分析。獲得原始測序序列(sequencedreads)后，在有相關物種參考序列或參考基因組的情況下，進行生物信息分析。生物信息分析主要流程如下：原始序列數據→測序數據質量評估→參考序列比對分析→基因表達水平分析→rna-seq整體質量評估→基因差異表達分析→差異基因go富集分析、差異基因kegg富集分析。本發明樣本的生物信息分析參考物種為谷氨酸棒桿菌atcc13032(購自上海復祥生物科技有限公司)，參考基因組在ncbi上鏈接為https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_006958.1。根據對最終提供的信息分析數據表，對各基因在對數期與穩定期的表達豐度分析，篩選得到表一的10個基因與轉錄分析信息，這10個基因的一致特點為：對數期轉錄水平低，穩定期轉錄水平高，通過對操縱子預測，基因cgtrna_rs10085、cgtrna_rs10080屬于同一個操縱子，cgtrna_rs07920、cgtrna_rs07925、cgtrna_rs07930屬于同一個操縱子、cgtrna_rs00965、cgtrna_rs00970屬于同一個操縱子，同一個操縱子共用一個啟動子。表一：谷氨酸棒桿菌轉錄組分析s期轉錄豐度高l期豐度低基因基因名稱strandstartendlengths1_fpkml1_fpkmcgtrna_rs10085-21422012143517131727347.52148.9929cgtrna_rs10080-2141798214213633924497.2543.2887cgtrna_rs10840+23205012321934143413058.69838.0642cgtrna_rs07910-167273716731444087453.83637.12523cgtrna_rs07920-167475716755728163383.73915.18759cgtrna_rs07925-1675587167673511492442.0697.789865cgtrna_rs07930-1676732167809013595493.9822.03821cgtrna_rs00965+19524119977345336137.99254.29964cgtrna_rs00970+19977320129315214023.85933.94991cgtrna_rs04670+98820998948012722037.6318.9310684、啟動子區域篩選：通過ncbiblast功能，將預測出來的基因片段與實驗室測序出來的谷氨酸棒狀桿菌基因組進行比對，找到相應的基因序列。通過查閱文獻或應用啟動子預測軟件，預測各基因的啟動子區域，每個基因的啟動子區域根據預測的功能區選擇2-3個片段進行啟動子活性檢測。(1)基因cgtrna_rs10085的啟動子區片段：rs10085seq1:ctattgaaattagtttctgtaggtctatagttagagctggttcaaggggtgtcaatcccaaaaggcactccttgaactcatgaaaaagcttgacaaaacttcaacgtcaaaggaggtcatccacgctrs10085seq2:ctattctatagatctattgaaattagtttctgtaggtctatagttagagctggttcaaggggtgtcaatcccaaaaggcactccttgaactcatgaaaaagcttgacaaaacttcaacgtcaaaggaggtcatccacgctrs10085seq3:acttaacaattcattaaattacctgttaaactatagaaaatatccaaaaccctccaaaacctattctatagatctattgaaattagtttctgtaggtctatagttagagctggttcaaggggtgtcaatcccaaaaggcactccttgaactcatgaaaaagcttgacaaaacttcaacgtcaaaggaggtcatccacgct(2)基因cgtrna_rs10840的啟動子區片段rs10840seq1:tcaaaggtcagcaattgtgaacaaagctacaaataaaccgttccacccatgtcaatgaggagtcaccrs10840seq2:gcagtcaaaaggcgttgcttttcgacgtcgcaaagcgcaatttcctacctttaagatcctaatctgttgaggtcagccacaatttttcagaaaagttttgatagatcgacaggtaatgctttatactgacaacgtcgcaaggactacatttgcagccaagtctactacttgatcttcaaaggtcagcaattgtgaacaaagctacaaataaaccgttccacccatgtcaatgaggagtcacc(3)基因cgtrna_rs07910的啟動子區片段rs07910seq1:acttggttcctgcccaacaacccagtggacttccagccggaaaatctgccatgcttcatccgtgaccgtgrs07910seq2:gcgatcacgtagtcatccaagcaggcgaagaaaccacaatcgtggaccgcgttatcgtcaccaccggcagctggacaagcgagctcgtgccctccatcgcgccactgcttgaagtgcgacgcctagtgctcacttggttcctgcccaacaacccagtggacttccagccggaaaatctgccatgcttcatccgtgaccgtg(4)基因cgtrna_rs07930的啟動子區片段rs07930seq1:cggaatagaaaatactccgctcgacagcatcacttagctgaaaggcctttaacrs07930seq2:gaaactggactaggtttatctatagcggaatagaaaatactccgctcgacagcatcacttagctgaaaggcctttaacrs07930seq3:gcaggttaaaacgctgccataggggatttttcggctggggagacgtggtgtaagtgcgggttaaaaacgtgaccttcgttataaaaacagaaatctatagaacgataggtagaaactggactaggtttatctatagcggaatagaaaatactccgctcgacagcatcacttagctgaaaggcctttaac(5)基因cgtrna_rs00965的啟動子區片段rs00965seq1:cttgcgttgcaggtagtgcgcctgattttcttattatcgaacgattgatagaaacaggattaaagtgaggtatcccgcrs00965seq2:ttttatcttctttcacggggtggataggcgaacatcttctaccatatcctgtgatgtgtaacacaggagcgtaatctgacctcccgttttcctatagattgatcgaaagtaacccttttgttacttgcgttgcaggtagtgcgcctgattttcttattatcgaacgattgatagaaacaggattaaagtgaggtatcccgc(6)基因cgtrna_rs04670的啟動子區片段rs04670seq1:aggctgacagaaactctaaaaactatagagctatagaaaccttaacttcggaggtatccrs04670seq2:gtgggcgctgggccatagtcgccccagctcagcgaagttgtacgccggcgttgcctgcttgtcgacgttttttgccacttcccttaattcgggggtggctgaaatgtaagacacgtcactacatttaagctcaaaaacaactacctataggctgacagaaactctaaaaactatagagctatagaaaccttaacttcggaggtatcc5、啟動子探測載體構建及熒光檢測：(1)引物合成：通過snapgene軟件對引物進行設計，委托武漢天一輝遠進行引物合成。各合成引物序列見下表二。表二：構建探測載體的各引物序列(2)基因組提取：挑取一環谷氨酸棒桿菌h5，接種于lb培養基中，31℃培養過夜，離心去上清，菌體基因組提取使用天根基因組提取試劑盒的步驟進行提取，提取后的基因組使用nanodropspectrophotometer進行核酸濃度檢測，控制進行pcr擴增的核酸濃度在100-200ng/ul之間。(3)pcr擴增：將各合成引物加水稀釋到終濃度10um，，使用transstartfastpfuflydnapolymerase進行擴增，pcr體系為：基因組模板1ul，正向引物(10um)1ul，反向引物(10um)1ul，5*transstartfastpfuflybuffer10ul，2.5mmdntps4ul，transstartfastpfuflydnapolymerase1ul，ddh2o32ul。pcr擴增過程為95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃10s-1min，72℃5min，循環數為32個，得到擴增dna片段分別為帶重組接頭的rs10085seq1、rs10085seq2、rs10085seq3、rs10840seq1、rs10840seq2、rs07910seq1、rs07910seq2、rs07930seq1、rs07930seq2、rs07930seq3、rs00965seq1、rs00965seq2、rs04670seq1、rs04670seq2、egfp。(4)質粒酶切與dna合成：使用原始質粒是pxmj19，用neb限制性內切酶nari與hindiii進行雙酶切，去掉原始的laciq和啟動子ptac，酶切體系為50ul體系：質粒5-10ul，nari1ul，hindiii1ul，cutsmart5ul，ddh2o33-38ul。委托武漢天一輝遠合成dna序列：hy-dna1gcatccggggctgatccccggcgcctaactaactaactcgagcttaagaggcctaagcttgcatgcctgcaggtcgact(5)dna瓊脂糖電泳回收：將pcr產物與酶切產物加入10*loadingbuffer，點樣50ul于1.5％瓊脂糖凝膠，以takara2000dldnamarker為對照，在70v電壓下電泳40min。根據marker條帶回收pcr擴增條帶。回收使用takaradna回收試劑盒進行回收，dna片段分別為帶重組接頭的rs10085seq1(167bp)、rs10085seq2(180bp)、rs10085seq3(240bp)、rs10840seq1(107bp)、rs10840seq2(282bp)、rs07910seq1(110bp)、rs07910seq2(241bp)、rs07930seq1(93bp)、rs07930seq2(118bp)、rs07930seq3(229bp)、rs00965seq1(118bp)、rs00965seq2(241bp)、rs04670seq1(99bp)、rs04670seq2(247bp)、egfp(760bp)。(6)體外重組：使用vazymeonestepcloningkit試劑盒將酶切產物與合成的dna片段hydna1進行體外重組，重組產物直接轉化大腸桿菌。(7)大腸桿菌感受態制備：大腸桿菌感受態dh5α制備使用碧云天細菌超級感受態試劑盒進行感受態制備，制備后感受態保存于-80℃冰箱備用。(8)轉化：在冰上緩慢融解感受態細胞dh5α，將體外重組產物加入感受態細胞內，輕輕用手指彈動離心管，以混勻細菌和重組產物，冰浴或冰水浴放置30分鐘，42℃水浴，熱休克2分鐘。熱休克后立即置于冰水浴中，2分鐘。加入900微升lb，37℃200rpm培養1小時。離心去上清，將菌體涂布于含氯霉素25ug/ml的lb固體平板中，37℃培養過夜。(9)轉化子驗證與質粒提取：將轉化后在抗性平板上長出來的轉化子，送武漢天一輝遠進行測序分析，序列正確的轉化子轉接5mllb試管中加入終濃度25ug/ml的氯霉素，37℃搖床，200rpm培養過夜，使用takaraplasmidkit試劑盒進行質粒提取，使提取的質粒濃度在200-400ng/ul之間，構建的質粒命名為hy-p19，序列為seqidno：2。將hy-p19使用neb限制性內切酶xbai和ecori，在37℃水浴鍋內進行雙酶切1h，酶切質粒量為1ug，酶切體系為50ul體系:質粒5-10ul,xbai1ul，ecori1ul，cutsmart5ul，ddh2o33-38ul。回收hy-p19的酶切產物，使用vazymeonestepcloningkit試劑盒將酶切產物與各啟動子片段與egfp片段進行體外重組，其他實驗步驟同上(7)-(9)。綠色熒光蛋白egfp的片段dnaseq：720bpatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa構建出一系列含有不同啟動子的探測載體的質粒hy-p19-promoter-egfp(流程圖見附圖1)，含各啟動子片段的探測載體分別命名為prs10085seq1、prs10085seq2、prs10085seq3、prs10840seq1、prs10840seq2、prs07910seq1、prs07910seq2、prs07930seq1、prs07930seq2、prs07930seq3、prs00965seq1、prs00965seq2、prs04670seq1、prs04670seq2。(10)谷氨酸棒狀桿菌電轉感受態細胞的制備：①從新鮮的lb(大約培養12h)平板上面挑取一個單菌落，接入到裝有5mllbg液體的試管中，30℃，220rpm過夜振蕩培養。②取2ml菌體培養液接入到裝有100mlepo(酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，甘氨酸25g/l，吐溫1g/l)培養基的1l三角瓶中，30℃振蕩培養至od為1.0-1.5之間(約為4-5h)。③無菌條件下把培養液全部轉移到4℃預冷的50ml離心管中，在冰上放置2分鐘。④4℃，7000rpm冷凍離心20分鐘。去除上清液之后，倒置離心管于無菌的濾紙上面吸收殘留的epo培養基。⑤用40ml4℃預冷的10％甘油溶液重懸菌體并輕輕搖勻，7000rpm冷凍離心10分鐘。倒去上清液。⑥重復第5步2次。⑦移液器吸取1ml預冷的10％甘油溶液，加入到離心管中并輕輕吹打重懸菌體。⑧最后將感受態細胞用1.5ml的無菌ep管分裝，每管0.1ml。放入超低溫冰箱中-80℃保存。(11)谷氨酸棒桿菌的電轉化：①取出一支-80℃保存的谷氨酸棒桿菌感受態細胞，插在冰上直到融化。②加入樣品質粒dna到融化的感受態細胞中，用手指輕彈ep管，確保dna和感受態細胞混合均勻。③用移液器將含有dna質粒的感受態細胞吸入到預冷的電擊杯(孔徑2mm)中，用衛生紙迅速擦干。④將電擊杯放置到電轉儀中，1800v電穿孔5毫秒。⑤迅速將細胞液吸入到46℃預熱的裝有5mllbhis的ep管中，精確計時熱擊6分鐘。⑥ep管于30℃，200rpm振蕩培養，細胞復蘇60分鐘。⑦7000rpm室溫離心2分鐘，棄去大部分上清液，用剩余培養基重懸菌體，用玻璃棒涂布在添加10ug/ml氯霉素的lbhis固體培養基上。⑧室溫放置1小時左右待表面液體被充分吸收后，倒置平板于30℃恒溫培養箱培養36h，長出來的轉化子即為含各探測載體的菌株。(12)谷棒轉化子熒光檢測將含有不同啟動子片段的谷棒轉化子，轉接5mllbg試管培養基中，30℃培養至od600分別為2.0(對數期)、3.2(穩定期)。取出菌體，離心去上清后，用pbs溶液洗滌兩次，用同體積的pbs進行重懸，重懸后的菌體，吸取200ul加入黑底96孔板中，使用多功能酶標儀tecanm1000進行熒光值檢測。各探測質粒在宿主菌中對數期與穩定期檢測熒光值見表三。從表中我們可以得出；同一個基因啟動子，選取不同的啟動子片段進行熒光值檢測，得到不同的啟動子活力數據，這與基因啟動子區域的調控有關，我們需要篩選的即為對數期熒光值低、穩定期熒光值高的啟動子片段。啟動子片段rs10085seq2、rs10085seq3、rs10840seq2、rs07910seq2、rs07930seq3、rs00965seq2、rs04670seq2在探測載體的表達中，表現出我們所需的篩選特征。表三：各探測質粒在宿主菌中兩個時期熒光檢測情況與質粒傳代統計表注：傳代穩定性指質粒有90％以上菌體含有質粒，傳代50次，指傳50次，質粒還穩定90％以上。6、各啟動子探測載體的質粒傳代穩定性將含有各啟動子探測載體的重組菌，接入lbg培養基中，在無抗性壓力的條件下，30℃旋轉搖床，190rpm培養24h為一代；傳代的接種量為5％，連續進行傳代培養，每代培養的細菌進行稀釋涂平板，稀釋相同的濃度分別涂布于含氯霉素和不含氯霉素的平板中，質粒丟失率＝(不含氯霉素的平板菌體個數-含氯霉素的平板菌體個數)/不含氯霉素的平板菌體個數×100％,質粒丟失率≤10％，我們定義為此傳代質粒穩定，當質粒丟失率>10％則認為此代質粒已不穩定。含各探測質粒的菌體的穩定傳代代數見表三。從表三我們可以得出質粒prs10085seq2、prs10085seq3、prs10840seq2、prs07910seq2、prs07930seq3、prs00965seq2、prs04670seq2傳到50代，質粒丟失率≤10％，表現出良好的穩定性。實施例2應用啟動子片段rs04670seq2構建的表達載體及其應用在菌體代謝生產異亮氨酸的過程中，1mol異亮氨酸需要消耗4mol輔因子nadph，nadph主要來源于磷酸戊糖途徑，生物體內nadph通過此條途徑供應需要消耗其他代謝產物，改變代謝途徑的碳流量，可能會影響目的代謝物的積累，而通過轉錄組分析，產異亮氨酸的谷氨酸棒桿菌在穩定期，磷酸戊糖途徑中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶轉錄下調，所以為了保證穩定期代謝過程中輔因子nadph的供應，又不對產物的積累造成影響，我們將6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因gnd(序列如seqidno：3所示)與一個啟動子相連，啟動此基因的表達。1、表達載體hy-p19-rs04670seq2-gnd的構建使用篩選出來的啟動子片段rs04670seq2作為啟動子，gnd為目的基因，構建表達載體hy-p19-rs04670seq2-gnd.dna片段擴增：使用質粒prs04670seq1為模板，上下游引物為：rs04670seq2fp:tgcctgcaggtcgactctagaaggctgacagaaactctaaaaacrs04670seq2rp:ggatacctccgaagttaagg擴增dna片段rs04670seq1，使用transstartfastpfuflydnapolymerase進行擴增，pcr體系為：prs04670seq1模板1ul，正向引物(10um)1ul，反向引物(10um)1ul，5*transstartfastpfuflybuffer10ul，2.5mmdntps4ul，transstartfastpfuflydnapolymerase1ul，ddh2o32ul。pcr擴增過程為95℃2min,95℃20s，55℃20s，72℃10smin，72℃5min，循環數為32個。以h5基因組為模板，上下游引物為：gnd-fp：ttaacttcggaggtatccatgaagctagattccattgattggnd-rp：ccaaaacagccaagctgaattcttaagcttccacctcggagcg擴增dna片段gnd，使用transstartfastpfuflydnapolymerase進行擴增，pcr體系為：基因組模板1ul，正向引物(10um)1ul，反向引物(10um)1ul，5*transstartfastpfuflybuffer10ul，2.5mmdntps4ul，transstartfastpfuflydnapolymerase1ul，ddh2o32ul。pcr擴增過程為95℃2min，95℃20s，56℃20s，72℃1min，72℃5min，循環數為32個。質粒酶切：使用的質粒是pxmj19去掉原始的laciq和promoter改造后的hy-p19。將hy-p19使用neb限制性內切酶xbai和ecori，在37℃水浴鍋內進行雙酶切1h，酶切質粒量為1ug，酶切體系為50ul體系：質粒5ul，xbai1ul,ecori1ul，cutsmart5ul，ddh2o38ul。dna瓊脂糖電泳回收：將pcr產物與酶切產物加入10*loadingbuffer，點樣50ul于3％、1％瓊脂糖凝膠，以takara2000dldnamarker為對照，在70v電壓下電泳40min。根據marker條帶回收pcr擴增77bp、1481bp條帶。回收使用takaradna回收試劑盒進行回收。體外重組：使用vazymeonestepcloningkit試劑盒進行體外重組，重組產物直接轉化大腸桿菌。大腸桿菌感受態制備:同啟動子探測載體構建。轉化：在冰上緩慢融解感受態細菌，將10ul體外重組產物加入100ul感受態細胞內，輕輕用手指彈動離心管，以混勻細菌和重組產物。冰浴或冰水浴放置30分鐘。42℃水浴，熱休克2分鐘。熱休克后立即置于冰水浴中，2分鐘。加入900微升lb，37℃200rpm培養1小時。離心去上清，將菌體涂布于含氯霉素25ug/ml的lb固體平板中，37℃培養過夜。轉化子驗證與質粒提取：將轉化后在抗性平板上長出來的轉化子，送武漢天一輝遠進行測序分析，挑取序列正確的轉化子轉接5mllb試管中加入終濃度25ug/ml的氯霉素，37℃搖床，200rpm培養過夜，使用takaraplasmidkit試劑盒進行質粒提取，表達質粒hy-p19-rs04670seq2-gnd濃度為288ng/ul。2、含表達載體hy-p19-rs04670seq2-gnd的菌株的構建谷氨酸棒桿菌電轉感受態細胞的制備：同啟動子探測載體構建。表達質粒hy-p19-rs04670seq2-gnd電轉化宿主細胞谷氨酸棒桿菌：同啟動子探測載體構建。將電轉后的菌液離心濃縮，用玻璃棒涂布在添加10ug/ml氯霉素的lbhis固體培養基上，30℃培養箱中培養36h，長出來的轉化子即為帶質粒hy-p19-rs04670seq2-gnd的菌株，菌株命名為h5-rs04670seq2-gnd。3、菌株h5-rs04670seq2-gnd與h5在5l發酵罐發酵產酸5l發酵罐發酵培養基：玉米漿15ml/l，葡萄糖140g/l(分消，0.075mpa濕熱滅菌15min)，硫酸銨5g/l，磷酸二氫鉀0.4g/l，七水硫酸鎂0.6g/l，生物素0.1mg/l，vb10.1mg/l，玉米油1ml/l，安琪酵母粉1g/l，消泡劑1ml/l,121℃0.01mpa濕熱滅菌25min；滅菌后加入初糖，用氨水調ph為7.0。培養方法：將菌種接入種子培養基(種子培養基配方：葡萄糖17g/l，玉米漿10ml/l，尿素1g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸氫二鉀1g/l，酵母膏0.1g/l，生物素0.1mg/l，維生素b10.1mg/l，玉米油0.1g/100ml，碳酸鈣1g/100ml；用naoh調ph7.0)，31℃旋轉搖床，200rpm,培養16h后，以10％接種量接入含有發酵培養基的5l自動控制發酵罐中，通入適當空氣，調節適當攪拌轉速，采用分階段供氧模式控制溶氧：0-8h為30-，8-24h為25％，24-56h為12％，通過自動流加15％的氨水控制ph在7.0，通過流加適量泡敵消泡，并通過流加濃度為800g/l的葡萄糖溶液將殘糖控制在3％左右，發酵56h結束。放罐時，發酵液通過hplc檢測(依力特c18色譜柱，5μm，4.6*250mm，流動相為0.015mol/l的磷酸氫二銨及0.005mol/lph7.20的混合水溶液。流速為0.5ml/min。柱溫為23℃。檢測器為紫外檢測器，波長199nm)對照菌h5發酵產酸22.0g/l，雜酸含量6.3g/l，糖酸轉化率12.83％，工程菌h5-rs04670seq2-gnd，發酵產酸33.4g/l，雜酸含量7.08g/l，糖酸轉化率達15.31％。4、菌株h5-rs04670seq2-gnd5l發酵罐發酵質粒穩定性將56h放罐菌進行稀釋涂平板，稀釋10-6、10-7、10-8、10-9的梯度濃度，每個濃度梯度分別吸取50ul菌液，涂布于含氯霉素和不含氯霉素的平板中，放置于31℃培養箱中培養36h，根據無抗性平板和抗性平板上長出的菌落數計算質粒丟失率，質粒丟失率＝(不含氯霉素的平板菌體個數-含氯霉素的平板菌體個數)/不含氯霉素的平板菌體個數×100％。在10-8稀釋梯度的平板上，含氯霉素平板長出118個菌落，無氯霉素平板長出121個菌落，質粒丟失率僅為2.48％，質粒在發酵中穩定。序列表<110>武漢遠大弘元股份有限公司<120>一種棒狀桿菌組成型表達載體啟動子、含有該啟動子及gnd基因的表達載體<160>3<210>1<211>207<212>dna<213>rs04670seq2啟動子<400>1gtgggcgctgggccatagtcgccccagctcagcgaagttgtacgccggcgttgcctgcttgtcgacgttttttgccacttcccttaattcgggggtggctgaaatgtaagacacgtcactacatttaagctcaaaaacaactacctataggctgacagaaactctaaaaactatagagctatagaaaccttaacttcggaggtatcc<210>2<211>5257<212>dna<213>質粒hy-p19<400>2ggcgcctaactaactaactcgagcttaagaggcctaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccattcggggtcgttcactggttcccctttctgatttctggcatagaagaacccccgtgaactgtgtggttccgggggttgctgatttttgcgagacttctcgcgcaattccctagcttaggtgaaaacaccatgaaacactagggaaacacccatgaaacacccattagggcagtagggcggcttcttcgtctagggcttgcatttgggcggtgatctggtctttagcgtgtgaaagtgtgtcgtaggtggcgtgctcaatgcactcgaacgtcacgtcatttaccgggtcacggtgggcaaagagaactagtgggttagacattgttttcctcgttgtcggtggtggtgagcttttctagccgctcggtaaacgcggcgatcatgaactcttggaggttttcaccgttctgcatgcctgcgcgcttcatgtcctcacgtagtgccaaaggaacgcgtgcggtgaccacgacgggcttagcctttgcctgcgcttctagtgcttcgatggtggcttgtgcctgcgcttgctgcgcctgtagtgcctgttgagcttcttgtagttgctgttctagctgtgccttggttgccatgctttaagactctagtagctttcctgcgatatgtcatgcgcatgcgtagcaaacattgtcctgcaactcattcattatgtgcagtgctcctgttactagtcgtacatactcatatttacctagtctgcatgcagtgcatgcacatgcagtcatgtcgtgctaatgtgtaaaacatgtacatgcagattgctgggggtgcagggggcggagccaccctgtccatgcggggtgtggggcttgccccgccggtacagacagtgagcaccggggcacctagtcgcggataccccccctaggtatcggacacgtaaccctcccatgtcgatgcaaatctttaacattgagtacgggtaagctggcacgcatagccaagctaggcggccaccaaacaccactaaaaattaatagtccctagacaagacaaacccccgtgcgagctaccaactcatatgcacgggggccacataacccgaaggggtttcaattgacaaccatagcactagctaagacaacgggcacaacacccgcacaaactcgcactgcgcaaccccgcacaacatcgggtctaggtaacactgagtaacactgaaatagaagtgaacacctctaaggaaccgcaggtcaatgagggttctaaggtcactcgcgctagggcgtggcgtaggcaaaacgtcatgtacaagatcaccaatagtaaggctctggcggggtgccataggtggcgcagggacgaagctgttgcggtgtcctggtcgtctaacggtgcttcgcagtttgagggtctgcaaaactctcactctcgctgggggtcacctctggctgaattggaagtcatgggcgaacgccgcattgagctggctattgctactaagaatcacttggcggcgggtggcgcgctcatgatgtttgtgggcactgttcgacacaaccgctcacagtcatttgcgcaggttgaagcgggtattaagactgcgtactcttcgatggtgaaaacatctcagtggaagaaagaacgtgcacggtacggggtggagcacacctatagtgactatgaggtcacagactcttgggcgaacggttggcacttgcaccgcaacatgctgttgttcttggatcgtccactgtctgacgatgaactcaaggcgtttgaggattccatgttttcccgctggtctgctggtgtggttaaggccggtatggacgcgccactgcgtgagcacggggtcaaacttgatcaggtgtctacctggggtggagacgctgcgaaaatggcaacctacctcgctaagggcatgtctcaggaactgactggctccgctactaaaaccgcgtctaaggggtcgtacacgccgtttcagatgttggatatgttggccgatcaaagcgacgccggcgaggatatggacgctgttttggtggctcggtggcgtgagtatgaggttggttctaaaaacctgcgttcgtcctggtcacgtggggctaagcgtgctttgggcattgattacatagacgctgatgtacgtcgtgaaatggaagaagaactgtacaagctcgccggtctggaagcaccggaacgggtcgaatcaacccgcgttgctgttgctttggtgaagcccgatgattggaaactgattcagtctgatttcgcggttaggcagtacgttctcgattgcgtggataaggctaaggacgtggccgctgcgcaacgtgtcgctaatgaggtgctggcaagtctgggtgtggattccaccccgtgcatgatcgttatggatgatgtggacttggacgcggttctgcctactcatggggacgctactaagcgtgatctgaatgcggcggtgttcgcgggtaatgagcagactattcttcgcacccactaaaagcggcataaaccccgttcgatattttgtgcgatgaatttatggtcaatgtcgcgggggcaaactatgatgggtcttgttgttggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaactccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgtcgaagctcggcggatttgtcctactcaagctgatccgacaaaatccacacattatcccaggtgtccggatcggtcaaatacgctgccagctcatagaccgtatccaaagcatccggggctgatcccc<210>3<211>1455<212>dna<213>目的基因gnd<400>3atgactaatggagataatctcgcacagatcggcgttgtaggcctagcagtaatgcgctcaaacctcgcccgcaacttcgcccgcaacggcaacactgtcgctgtctacaaccgcagcactgacaaaaccgacaagctcatcgccgatcacggctccgaaggcaccttcatcccttccgcaaccgtcgaagagttcgtagcatccctggaaaagccacgccgcgccatcatcatggttcaggctggtaacgccaccgacgcagtcatcaaccagctagcagatgccatggacgaaggcgacatcatcatcgacggcggcaacgtcctctacaccgacaccattcgtcgcgagaaggaaatctacgcacgcggtctccacttcgtcggtgctggtatctccggcggccaagaaggcgcactcaacggcccatccatcatgcctggtggcccagcaaagtcctacgagtccctcggaccactgcttgaatccatcgctgccaacgttgacggcacatcatgtgtcacccacatcggaacagacggcgccggccacttcgtcaagatggtccacaacggcatcgagtacgcggacatgcaggtcatcggcgaggcataccaccttctccgctacgcagcaggcatgcagccagctgaaatcgctgaggaattcaaggaatggaacgcaggcgacctggattcctacctcatcgaaatcaccgcagaggttctctcccaggtggatgctggaaccggcaagccactgatcgacgtcatcgttgacgctgcaggccagaagggcaccggacgttggaccgtcaaggctgctcttgatctgggtattgctaccaccggcatcggcgaagctgttttcgcacgtgcactctccggcgcaaccagccagcgcgctgcagcacagggcaacctacctgcaggtgtcctcaccgatctggaagcacttggcatggacaaggcacagttcgtcgaagacgttcgttgtgcactgtacgcatccaagcttgttgcttacgcacagggcttcgacgagatcaaggctggctccgacgagaacaactgggacgttgaccctcgcgacctcgctaccatctggcgcggcggctgcatcattcgcgctaagttcctcaaccgcatcgtcgaagcatacgatgcaaacgctgaacttgagtccctgctgctcgatccttacttcaagagcgagctcggcgacctcatcgattcatggcgtcgcgtgattgtcaccgccacccagcttggcctgccaatcccagtgttcgcttcctccctgtcctactacgacagcctgcgtgcagagcgtctgccagcagccctgatccagggacagcgcgacttcttcggtgcgcacacctacaagcgcatcgacaaggatggctccttccacaccgagtggtccggcgaccgctccgaggtggtagcttaa當前第1頁12