一種具有抗腫瘤作用的毛菌素J及其制備方法與用途與流程

本發明涉及醫藥
技術領域：
，具體涉及一種具有抗腫瘤作用的毛菌素j及其制備方法與用途。
背景技術：
：腫瘤是威脅人類健康的主要的疾病之一，隨著環境惡化加劇等因素的影響，全球惡性腫瘤患病人數抑制呈現增加趨勢。2016年cacancerjclin發表的統計數據表明，基于2009-2011年間72個地方人群的癌癥登記處數據，中國2015年將會有4292000例癌癥新發病例，2814000例癌癥死亡。癌癥的預防與治療將是一項非常艱巨的任務。天然產物一直是藥物的重要來源，目前臨床使用的藥物大多數來源于天然產物結構的改造與優化，部分藥物直接來源于天然產物。據統計，從1981年到2010年的三十年之間，直接或間接來源于天然產物的藥物平均占到每年上市藥物的30-40％之間；2010年，天然產物相關來源的藥物比例達到了空前的50％。植物內生真菌次生代謝產物種類豐富，具有結構新穎、生物活性顯著的特點，越來越多具有顯著活性的次生代謝產物被從中發現，使得植物內生真菌成為了新穎活性藥用化合物的重要來源之一。因此，從內生真菌次生代謝產物中尋找新穎的化合物成為抗腫瘤活性先導化合物發現的重要途徑。技術實現要素：為克服現有技術的不足，本發明的目的就是要提供一種具有抗腫瘤作用的毛菌素j及其制備方法與用途。本發明制備的毛菌素j對5株人源腫瘤細胞(白血病hl-60、肺癌a-549、肝癌smmc-7721、乳腺癌mcf-7、結腸癌sw480)的增殖有顯著的抑制作用，效果優于陽性對照藥物順鉑，具有預期發展成為抗腫瘤藥物的潛力。為實現上述目的，本發明所提供的一種具有抗腫瘤作用的毛菌素j，該毛菌素j的結構式如下式(i)所示。本發明還提供了一種制備所述具有抗腫瘤作用的毛菌素j的方法，包括如下步驟：將chaetomiumsp.yx-1菌種(其中，chaetomiumsp.yx-1菌種于2017年1月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地點為中國武漢大學，其微生物保藏編號為：cctccno：m2017028)培養處理后接種到液體培養基中發酵處理，取發酵液依次過濾、菌絲提取、濾液萃取處理，合并菌絲提取物和濾液萃取物得總提取物，取總提取物經硅膠柱層析利用二氯甲烷/甲醇梯度洗脫，對洗脫后含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征吸收峰部分在lc-ms分析追蹤下經ods柱層析以及sephadexlh-20凝膠柱色譜分離，對含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰部分，經過半制備液相純化得到結構式為i的化合物毛菌素j。進一步地，所述液體培養基按質量百分數計包括酵母提取物0.2-0.5％、蛋白胨0.2-0.5％、葡萄糖0.6-1％，余量為水。進一步地，所述培養處理具體為將chaetomiumsp.yx-1菌種接種于pda培養基上3-7天后，切成0.5cm×0.5cm的碎片；所述發酵處理的溫度為22-32℃，發酵時間為15-45天。進一步地，所述提取處理為采用質量百分數為90％的甲醇對發酵液過濾后的菌絲回流提取1-3次，得到菌絲提取物；所述濾液萃取處理為采用與發酵液過濾后的濾液等體積的乙酸乙酯萃取1-5次后，經減壓回收乙酸乙酯溶劑后得到濾液萃取物。進一步地，所述硅膠柱層析利用二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1。進一步地，所述ods柱層析利用石油醚/乙酸乙酯(pe-etoac)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1。進一步地，所述sephadexlh-20凝膠柱色譜分離利用體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行等度洗脫。進一步地，所述半制備液相純化采用的流動相為質量比為75:25的甲醇和水，液相流速為2.0ml/min。進一步地，所述具有抗腫瘤作用的毛菌素j的方法，具體包括如下步驟：1)將chaetomiumsp.yx-1菌種接種于pda培養基上3-7天后切成0.5cm×0.5cm的碎片，再接種到液體培養基中，在溫度為22-32℃的條件下發酵15-45天，取得發酵液；2)將步驟1)所得的發酵液過濾后，采用質量百分數為90％的甲醇對發酵液過濾后的菌絲回流提取1-3次得到菌絲提取物，采用與發酵液過濾后的濾液等體積的乙酸乙酯萃取1-5次，經減壓回收乙酸乙酯溶劑后得到濾液萃取物，合并菌絲提取物和濾液萃取物得到總提取物；3)將步驟2)所得的總提取物經硅膠柱層析，利用二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1，洗脫液經過薄層色譜檢識后合并得到3～5個支部分，各支部分經過lc-ms分析，僅其中一個支部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰；4)將步驟3)含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰的一個支部分在lc-ms分析追蹤下經ods柱層析，利用石油醚/乙酸乙酯(pe-etoac)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1，洗脫液經過薄層色譜檢識后合并得到5～7個支部分，各支部分經過lc-ms分析，僅其中一個支部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰；5)選取步驟4)含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰的一個支部分在lc-ms分析追蹤下經sephadexlh-20凝膠柱色譜分離，利用體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行等度洗脫，洗脫液經過薄層色譜檢識后合并得到2～3個支部分，各支部分經過lc-ms分析，僅其中一個支部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰；6)將步驟5)含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征吸收峰的一個支部分經過半制備液相純化得到結構式為i的化合物毛菌素j。本發明所述具有抗腫瘤作用的毛菌素j的用途，在制備用于治療白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌藥物中的應用。與現有技術相比，本發明的優點：其一，本發明采用的菌株chaetomiumsp.yx-1的培養條件容易控制且可重復發酵，可通過發酵途徑有效富集得到足夠的量化合物毛菌素j(chaetocochinj)，從而解決了由于化合物毛菌素j結構復雜，難以人工合成的問題。其二，本發明化合物毛菌素j的制備方法中依次采用菌絲提取、濾液萃取、硅膠柱層析、ods柱層析以及sephadexlh-20凝膠柱色譜分離成功制備了化合物毛菌素j，設備要求簡單易行，純化步驟簡潔高效。其三，本發明制備的化合物毛菌素j對5株人源腫瘤細胞(白血病hl-60、肺癌a-549、肝癌smmc-7721、乳腺癌mcf-7、結腸癌sw480)的增殖有顯著的抑制作用，效果優于陽性對照藥物順鉑，具有預期發展成為抗腫瘤藥物的潛力。其四，本發明制備的化合物毛菌素j細胞水平抗腫瘤作用優于陽性對照順鉑，應用于抗腫瘤藥物制備中具有，具有潛在的經濟效益。附圖說明圖1為實施例1所制備的毛菌素j的高分辨液質色譜圖；圖2為實施例1所制備的毛菌素j的高分辨液質質譜圖；圖3為實施例1所制備的毛菌素j的紫外光譜圖；圖4為實施例1所制備的毛菌素j的紅外光譜圖；圖5為實施例1所制備的毛菌素j的核磁1hnmr；圖6為實施例1所制備的毛菌素j的核磁13cnmr譜圖。具體實施方式以下結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明：本說明書未作詳細描述的內容屬于本領域專業技術人員公知的現有技術。實施例1：毛菌素j的制備方法：將chaetomiumsp.yx-1(毛殼霉yx-1)菌種接種于pda培養基上3天后切成0.5cm×0.5cm的碎片，接種到液體培養基中(酵母提取物3g，蛋白胨3g，葡萄糖8g加水1000ml，高溫高壓滅菌后冷卻至室溫)22℃培養15天，取得發酵液。將發酵液過濾，菌絲體采用質量百分數為90％的甲醇回流提取3次，濾液經與濾液體積的乙酸乙酯萃取5次，甲醇和乙酸乙酯提取液經減壓回收溶劑后合并得到總提取物。總提取物經硅膠柱層析，利用二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各200ml，洗脫液經過薄層色譜檢識后合并得到三個部分(fr.1–fr.3)。經過lc-ms分析發現fr.2部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物。選取fr.2部分在lc-ms分析追蹤下經ods柱層析利用石油醚/乙酸乙酯(pe-etoac)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各100ml，得到5個部分(fr.2.1-fr.2.5)。各支部分經過lc-ms分析，僅其中fr.2.3部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征吸收峰；選取fr.2.3部分在lc-ms分析追蹤下經sephadexlh-20凝膠柱色譜分離利用體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行等度洗脫，得到2個部分(fr.2.3.1-fr.2.3.2)，各支部分經過lc-ms分析，僅其中fr.2.3.2部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征吸收峰；選取fr.2.3.2再經過半制備液相純化(流動相為meoh/h2o，75:25，液相流速為2.0ml/min)得到了化合物毛菌素j(chaetocochinj)。實施例2：毛菌素j的制備方法：將chaetomiumsp.yx-1(毛殼霉yx-1)菌種接種于pda培養基上7天后切成0.5cm×0.5cm的碎片，接種到液體培養基中(酵母提取物3g，蛋白胨3g，葡萄糖8g加水1000ml，高溫高壓滅菌后冷卻至室溫)32℃培養45天，取得發酵液。將發酵液過濾，菌絲體采用質量百分數為90％的甲醇回流提取1次，濾液經與濾液體積的乙酸乙酯萃取1次，甲醇和乙酸乙酯提取液經減壓回收溶劑后合并得到總提取物。總提取物經硅膠柱層析，利用二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各200ml，洗脫液經過薄層色譜檢識后合并得到5個部分(fr.1–fr.5)。經過lc-ms分析發現fr.2部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物。選取fr.2部分在lc-ms分析追蹤下經ods柱層析利用石油醚/乙酸乙酯(pe-etoac)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各100ml，得到7個部分(fr.2.1-fr.2.7)。各支部分經過lc-ms分析，僅其中fr.2.3部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰；選取fr.2.3部分在lc-ms分析追蹤下經sephadexlh-20凝膠柱色譜分離利用體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行等度洗脫，得到3個部分(fr.2.3.1-fr.2.3.3)，各支部分經過lc-ms分析，僅其中fr.2.3.2部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰；選取fr.2.3.2再經過半制備液相純化(流動相為meoh/h2o，75:25，流速為2.0ml/min)得到了化合物毛菌素j(chaetocochinj)。實施例3：毛菌素j的制備方法：將chaetomiumsp.yx-1(毛殼霉yx-1)菌種接種于pda培養基上5天后切成0.5cm×0.5cm的碎片，接種到液體培養基中(酵母提取物2g，蛋白胨5g，葡萄糖1g加水1000ml，高溫高壓滅菌后冷卻至室溫)32℃培養30天，取得發酵液。將發酵液過濾，菌絲體采用質量百分數為90％的甲醇回流提取2次，濾液經與濾液體積的乙酸乙酯萃取3次，甲醇和乙酸乙酯提取液經減壓回收溶劑后合并得到總提取物。總提取物經硅膠柱層析，利用二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各200ml，洗脫液經過薄層色譜檢識后合并得到4個部分(fr.1–fr.4)。經過lc-ms分析發現fr.2部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物。選取fr.2部分在lc-ms分析追蹤下經ods柱層析利用石油醚/乙酸乙酯(pe-etoac)進行洗脫，洗脫比例為50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各100ml，得到6個部分(fr.2.1-fr.2.6)。各支部分經過lc-ms分析，僅其中fr.2.3部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰；選取fr.2.3部分在lc-ms分析追蹤下經sephadexlh-20凝膠柱色譜分離利用體積比為1:1的二氯甲烷/甲醇(chcl2/meoh)進行等度洗脫，得到2個部分(fr.2.3.1-fr.2.3.2)，各支部分經過lc-ms分析，僅其中fr.2.3.2部分含有多硫代二酮哌嗪類化合物特征峰；選取fr.2.3.2再經過半制備液相純化(流動相為meoh/h2o，75:25，流速為2.0ml/min)得到了化合物毛菌素j(chaetocochinj)。實施例4：對實施例1所制備的如式(1)所示化合物毛菌素j(chaetocochinj)結構鑒定。所得的chaetocochinj為白色粉末，對實施例1所得chaetocochinj化合物進行hr-ms、uv、ir、nmr測試分析，從而確定該化合物的結構。如圖1和圖2所示為實施例1所制備的chaetocochinj的高分辨液質色譜圖和高分辨液質質譜圖，從圖2中可以看出，可見質荷比為711.1180的[m+h+]峰，說明分子式為c31h30n6o6s4。如圖3實施例1所制備的chaetocochinj的紫外光譜圖，從圖2中可見uv(ch2cl2)λmax(logε)228(4.30)，296(3.47)nm，為吲哚環的特征吸收，說明結構中有吲哚環片段。如圖4為實施例1所制備的chaetocochinj的紅外光譜圖，從圖3中可見ir(kbr)νmax3373，2956，2926，1725，1674，1646，1610，1455，1366，1255，1065、743cm-1；其中1725，1674，1646，1610cm-1為結構中哌嗪環羰基的特征吸收峰，1455cm-1為吲哚環的特征吸收峰，說明結構中有苯環以及羰基等基團。如圖5和圖6分別為實施例1所制備的chaetocochinj的核磁1hnmr和核磁13cnmr譜圖，表(1)為核磁1hnmr和核磁13cnmr數據。從表(1)中可見1hnmr(dmso-d6，600mhz)和13cnmr(dmso-d6，150mhz)；hresimsm/z733.1180，[m+h]+(calcdforc31h31n6o6s4，711.1182)。cd(c1.31×10-3minch2cl2)λmax(δε)302(+0.54)，291(-0.38)，241(+20.74)；表(1).chaetocochinj的核磁1hnmr和核磁13cnmr數據a600mhzfor1hand150mhzfor13c.實施例5：采用實施例1所制備的chaetocochinj對5株人源癌細胞增殖的抑制活性(白血病hl-60、肺癌a-549、肝癌smmc-7721、乳腺癌mcf-7、結腸癌sw480)。實驗方法如下：1、接種細胞：用含10％胎牛血清的培養液(dmem或者rmpi1640)配成單個細胞懸液，以每孔3000-15000個細胞接種到96孔板，每孔體積100μl，貼壁細胞提前12-24小時接種培養。2、加入待測化合物溶液：chaetocochinj用dmso(二甲基亞砜)溶解，chaetocochinj以40μm、8μm、1.6μm、0.32μm、0.064μm濃度復篩，每孔終體積200μl，每種處理均設3個復孔。3、顯色：37攝氏度培養48小時后，貼壁細胞棄孔內培養液，每孔加mts溶液20μl和培養液100μl；懸浮細胞棄100μl培養上清液，每孔加20μl的mts溶液；設3個空白復孔(mts溶液20μl和培養液100μl的混合液)，繼續孵育2-4小時，使反應充分進行后測定光吸收值。4、比色：選擇492nm波長，多功能酶標儀(multiskanfc)讀取各孔光吸收值，記錄結果，數據處理后以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，應用兩點法(reedandmuench法)計算化合物的ic50值。5、陽性對照化合物：每次實驗均設順鉑(ddp)和紫杉醇(taxol)兩個陽性化合物，以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，應用兩點法(reedandmuench法)計算化合物的ic50值。chaetocochinj對5株腫瘤細胞的ic50值(μm)表(2)所示。表(2).chaetocochinj對5種腫瘤細胞的ic50值白血病hl-60肺癌a-549肝癌smmc-7721乳腺癌mcf-7結腸癌sw480毛菌素j0.643.050.840.880.41順鉑2.7719.0810.6223.6410.15紫杉醇<0.008<0.008<0.008<0.008<0.008實驗結論：從表(2)中可以看出，chaetocochinj對5株人源癌細胞(白血病hl-60、肺癌a-549、肝癌smmc-7721、乳腺癌mcf-7、結腸癌sw480)的增殖有顯著的抑制作用，效果優于陽性對照藥物順鉑，具有開發成為抗腫瘤藥物的潛力。應當理解的是，以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本領域的技術人員在本發明所揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12