多通道多肽固相合成方法與流程

本發明涉及生物化學實驗領域，尤其涉及一種多肽固相合成方法。

背景技術：

多肽固相合成是將保護氨基酸連接到固態樹脂上，脫去保護基團，然后將下一個保護氨基酸與第一個氨基酸的殘基反應并形成肽鍵，然后脫去第二個氨基酸的保護基團，再連接下一個氨基酸，這樣循環下去使肽鏈增長。多肽固相合成中，固態樹脂是必須使用的反應底物。

多肽固相合成反應中，需要使用抽濾裝置，抽濾裝置包括有抽濾瓶和與抽濾瓶相連接的真空泵。

多肽固相合成中，溶入活化劑的反應液為偶合溶液，溶入脫保護劑的反應液為脫保護溶液。在進行肽固相合成反應時，常常使用多肽固相合成管，在多肽固相合成管中加入樹脂，先將樹脂溶脹，然后交替加入脫保護溶液和偶合溶液進行合成反應。加入脫保護溶液時，樹脂與脫保護溶液進行脫去保護基團的反應；加入偶合溶液時，樹脂與偶合溶液中的帶保護基團的氨基酸進行偶合反應。

在多肽固相合成中，常常需要以一個母肽為基礎，合成多種突變位點不同的衍生肽，如在研發多肽類藥物時，需要以一種母肽為基礎，合成多種突變位點不同的衍生肽，然后從各種衍生肽中尋找藥效最佳的多肽類藥物。

在樹脂上每連接一個氨基酸，都需要使用一種特定的與多肽的氨基酸序列相適應的偶合溶液，連接不同的氨基酸需要使用不同的偶合溶液。因此，在多肽固相合成的過程中，就需要多次更換反應液。在基于一種母肽制備多種衍生肽時，各種衍生肽需要的大部分偶合溶液是相同的，但是目前的多肽固相合成裝置，在制備各衍生肽需要的偶合溶液相同時，也需要在制備不同的衍生肽時分別進行偶合反應，缺少能夠批量進行多肽固相合成反應的裝置以及方法。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種能夠在制備不同的衍生肽時批量進行多肽固相合成反應的方法。

為實現上述目的，本發明的多通道多肽固相合成方法使用多通道多肽固相合成裝置來進行，多通道多肽固相合成裝置包括用于盛裝反應液的反應缸體，反應缸體底部連接有抽濾接管和氮氣接管，氮氣接管連接有氮氣軟管，氮氣軟管用于連接外置高壓氮氣瓶，氮氣接管上設有氮氣閥門，抽濾接管上設有抽濾閥門；

抽濾接管連接有抽真空軟管，抽真空軟管用于連接外置的抽濾裝置；反應缸體頂部設有氣體進出管，

反應缸體頂面連接有若干連接磨口，連接磨口的頂部呈上大下小的空心錐臺形；每一連接磨口內分別插設有一多肽合成管，多肽合成管的底端插入反應缸體的下部且多肽合成管的底端設有砂芯濾芯；多肽合成管的中部設有磨砂連接部，磨砂連接部呈與連接磨口相適配的上大下小的空心錐臺形；

所述各多肽合成管的底端位于同一水平面，反應缸體內于各多肽合成管的下方設有氮氣分氣箱，氮氣分氣箱的頂面與各多肽合成管一一對應設有若干氮氣分氣口，氮氣分氣口處設有由下至上單向導通的單向閥；所述氮氣接管伸入反應缸體內并與氮氣分氣箱相連接；

本發明的多通道多肽固相合成方法按以下步驟來進行：

第一步驟是連接步驟，將氮氣軟管與外置高壓氮氣瓶相連接，將抽真空軟管與外置的抽濾裝置相連接；

第二步驟是樹脂分裝步驟，在多通道多肽固相合成裝置的各多肽合成管中分別裝入精確稱量后的連接有相同或不同氨基酸殘基的樹脂；

第三步驟是進行樹脂溶脹，具體是：

①將溶脹溶劑加入反應缸體；

②將裝有樹脂的每個多肽合成管分別通過連接磨口插入同一反應缸體進行溶脹，多肽合成管支撐在連接磨口上且其底端高于氮氣分氣箱并位于氮氣分氣口的正上方；

③打開高壓氮氣瓶的出氣閥和氮氣閥門，將氮氣送入氮氣分氣箱；氮氣分氣箱內的氮氣通過單向閥后進入反應缸體，氮氣帶動部分反應缸體內的液體通過砂芯濾芯進入多肽合成管，在反應中起到攪拌的作用，使液體與樹脂充分接觸；氮氣同時通過各多肽合成管的頂端開口或者反應缸體上的氣體進出管流出；溶脹30±10 分鐘，待樹脂充分溶脹后，關閉氮氣閥門；

④進行抽濾操作，抽濾操作具體是打開抽濾閥門，使用塞子封閉氣體進出管，啟動抽濾裝置，對反應缸體進行抽濾，將反應缸體內的液體從反應缸體內抽出；抽濾結束后關閉抽濾閥門；

第四步驟是進行脫保護反應，具體是：

①將脫保護溶液加入反應缸體；

②打開氮氣閥門，進行氮氣攪拌，使反應缸體內的脫保護溶液與樹脂充分接觸；氮氣通過各多肽合成管的頂端開口或者反應缸體上的氣體進出管流出，本步驟持續進行30-40分鐘，關閉氮氣閥門，進行所述抽濾操作；

第五步驟是洗滌樹脂步驟，本步驟是將溶劑（如DMF溶劑，甲醇溶劑或二氯化碳溶劑； DMF溶劑即N，N-二甲基甲酰胺溶劑）加入反應缸體中對樹脂進行洗滌，打開氮氣閥門，進行氮氣攪拌，使反應缸體內的液體與樹脂充分接觸；氮氣通過各多肽合成管的頂端開口或者反應缸體上的氣體進出管流出，本步驟持續進行1分鐘，關閉氮氣閥門，進行所述抽濾操作；

本步驟重復進行六次；

第六步驟是檢測脫保護反應是否完成的步驟，具體是：

通過茚三酮顯色法檢測各多肽合成管中的樹脂的脫保護反應是否完成，對于未完成脫保護反應的樹脂，重復第四和第五步驟；

對于已完成脫保護反應的樹脂，若固相合成反應未全部結束，則進行下一步驟；若固相合成反應已全部結束，則將樹脂從各多肽合成管中取出，停止反應；本步驟是多肽固相合成方法的結束步驟。

第七步驟是進行偶合反應，具體是：

①對各多肽合成管進行區分，根據進行下一步反應所需要的偶合溶液對各多肽合成管進行分組，將需要的偶合溶液相同的多肽合成管歸為同一組；

②對于同一組裝有樹脂的多肽合成管，將該組中的每個多肽合成管分別通過連接磨口插入同一反應缸體，將偶合溶液加入反應缸體；

③打開氮氣閥門，進行氮氣攪拌，使反應缸體內的液體與樹脂充分接觸；氮氣通過各多肽合成管的頂端開口或者反應缸體上的氣體進出管流出，本步驟持續進行2-3小時；關閉氮氣閥門，進行所述抽濾操作；然后進行第五步驟即洗滌樹脂步驟，然后進行第八步驟；

第八步驟是檢測偶合反應是否完成的步驟，具體是：

通過茚三酮顯色法檢測各多肽合成管中的樹脂的偶合反應是否完成；對于未完成偶合反應的樹脂，重復第七步驟以重新進行偶合反應；對于已完成偶合反應的樹脂，則進行第四至第六步驟。

所述溶脹溶劑為N，N-二甲基甲酰胺溶劑；所述樹脂采用Wang樹脂或Rink樹脂。

所述氣體進出管設有兩個，一個連接在反應缸體頂面中心處，另一個連接在反應缸體側壁頂部。

本發明設計了一種多通道多肽固相合成方法及專用的裝置，進行多肽固相合成反應非常方便，而且通過將不同的多肽合成管同時插入同一反應缸體來進行批量反應，與以往相比大大提高了多肽固相合成的效率，節約了相應研究的時間。在以一種母肽為基礎，合成多種突變位點不同的衍生肽時，與以往的合成裝置及合成方法相比，具有突出的高效率優點，能夠快速合成多種衍生肽，從而提高尋找效果（如藥效）最佳的多肽類物質的效率。

以往的多肽固相反應中，樹脂和反應液均加入同一多肽固相反應管，砂芯濾芯則位于多固相反應管的中部。這種結構也限制了批量反應的可能性。

本發明在使用時根據進行下一步反應所需要的偶合溶液對各多肽合成管進行分組，將需要的偶合溶液相同的多肽合成管歸為同一組，從而為實現批量反應提供基礎；本發明進一步設置出若干多肽合成管對應同一反應缸體的技術方案。

這種分組的辦法，以及多管對應同一缸體的結構，是發明人在經過長期低效重復反應實驗后，經過創造性思考所提出來的，是實現批量反應、提高反應效率的關鍵。

氮氣分氣箱的設置是發明人的另一創新之處，每一多肽合成管的底端（砂芯濾芯）均對應一個氮氣分氣口，使得氮氣在通過氮氣分氣口后，非常容易地帶動一部分反應缸體內的液體向上通過砂芯濾芯進入多肽合成管，大大提高了攪拌力度，明顯提高了反應或洗滌的效率。所述氣體進出管設有兩個，一個連接在反應缸體頂面中心處，另一個連接在反應缸體側壁頂部。在加大氮氣攪拌的力度（加大氮氣壓力可以加大氮氣攪拌力度）時，能夠使氮氣順暢地流出反應缸體。

附圖說明

圖1是本發明的多通道多肽固相合成裝置去掉多肽合成管后的結構示意圖；

圖2是圖1的俯視圖；

圖3是氮氣分氣箱與氮氣接管相連接的示意圖；

圖4是本發明的多通道多肽固相合成裝置的結構示意圖。

具體實施方式

如圖1至圖4所示，本發明的多通道多肽固相合成方法使用多通道多肽固相合成裝置來進行。多通道多肽固相合成裝置包括用于盛裝反應液（脫保護溶液或偶合溶液）的反應缸體1，反應缸體1底部連接有抽濾接管2和氮氣接管3，氮氣接管3連接有氮氣軟管4，氮氣軟管4用于連接外置高壓氮氣瓶，氮氣接管3上設有氮氣閥門5，抽濾接管2上設有抽濾閥門6；

抽濾接管2連接有抽真空軟管7，抽真空軟管7用于連接外置的抽濾裝置；反應缸體1頂部設有氣體進出管8，

反應缸體1頂面連接有若干連接磨口9，連接磨口9的頂部呈上大下小的空心錐臺形；每一連接磨口9內分別插設有一多肽合成管10，多肽合成管10的底端插入反應缸體1的下部且多肽合成管10的底端設有砂芯濾芯11；進行反應時，樹脂放置在砂芯濾芯11上，液體能夠通過砂芯濾芯11，但是固態的樹脂不會通過砂芯濾芯11。多肽合成管10的中部設有磨砂連接部，磨砂連接部呈與連接磨口9相適配的上大下小的空心錐臺形。使用時，多肽合成管10依靠磨砂連接部支撐在連接磨口9上并與連接磨口9之間形成密封。磨砂連接部在圖4中被連接磨口9所遮擋，因此圖中未給出標號。

所述各多肽合成管10的底端位于同一水平面，反應缸體1內于各多肽合成管10的下方設有氮氣分氣箱12，氮氣分氣箱12的頂面與各多肽合成管10一一對應設有若干氮氣分氣口13，氮氣分氣口13處設有由下至上單向導通的單向閥；所述氮氣接管3伸入反應缸體1內并與氮氣分氣箱12相連接。單向閥可以防止液體由反應缸體1流入氮氣分氣箱12。單向閥為常規技術，圖未示。

在使用上述多通道多肽固相合成裝置實現多通道多肽固相合成方法時按以下步驟來進行：

第一步驟是連接步驟，將氮氣軟管4與外置高壓氮氣瓶相連接，將抽真空軟管7與外置的抽濾裝置相連接；

第二步驟是樹脂分裝步驟，在多通道多肽固相合成裝置的各多肽合成管中分別裝入精確稱量后的連接有相同或不同氨基酸殘基的樹脂；

第三步驟是進行樹脂溶脹，具體是：

①將溶脹溶劑加入反應缸體1；

②將裝有樹脂的每個多肽合成管分別通過連接磨口9插入同一反應缸體1進行溶脹，多肽合成管支撐在連接磨口9上且其底端高于氮氣分氣箱12并位于氮氣分氣口13的正上方；

③打開高壓氮氣瓶的出氣閥和氮氣閥門5，將氮氣送入氮氣分氣箱12；氮氣分氣箱12內的氮氣通過單向閥后進入反應缸體1，氮氣帶動部分反應缸體1內的液體通過砂芯濾芯11進入多肽合成管，在反應中起到攪拌的作用，使液體與樹脂充分接觸；氮氣同時通過各多肽合成管的頂端開口或者反應缸體1上的氣體進出管8流出；溶脹30±10 分鐘，待樹脂充分溶脹后，關閉氮氣閥門5；由于單向閥的存在，反應缸體1內的液體不會通過單向閥進入氮氣分氣箱12。

④進行抽濾操作，抽濾操作具體是打開抽濾閥門6，封閉氣體進出管8，啟動抽濾裝置（如真空泵），對反應缸體1進行抽濾，將反應缸體1內的液體從反應缸體1內抽出；抽濾結束后關閉抽濾閥門6；

第四步驟是進行脫保護反應，具體是：

①將脫保護溶液通過連接磨口9或多肽合成管加入反應缸體1；

②打開氮氣閥門5，進行氮氣攪拌，使反應缸體1內的脫保護溶液與樹脂充分接觸；氮氣通過各多肽合成管的頂端開口或者反應缸體1上的氣體進出管8流出，本步驟持續進行30-40分鐘，關閉氮氣閥門5，進行所述抽濾操作；

第五步驟是洗滌樹脂步驟，本步驟是將溶劑（如DMF溶劑，甲醇溶劑或二氯化碳溶劑； DMF溶劑即N，N-二甲基甲酰胺溶劑）加入反應缸體中對樹脂進行洗滌，打開氮氣閥門5，進行氮氣攪拌，使反應缸體1內的液體與樹脂充分接觸；氮氣通過各多肽合成管的頂端開口或者反應缸體1上的氣體進出管8流出，本步驟持續進行1分鐘，關閉氮氣閥門5，進行所述抽濾操作；

本步驟重復進行六次；

第六步驟是檢測脫保護反應是否完成的步驟，具體是：

通過茚三酮顯色法檢測各多肽合成管中的樹脂的脫保護反應是否完成，對于未完成脫保護反應的樹脂，重復第四和第五步驟；

對于已完成脫保護反應的樹脂，若固相合成反應未全部結束，則進行下一步驟；若固相合成反應已全部結束，則將樹脂從各多肽合成管中取出，停止反應；

第七步驟是進行偶合反應，具體是：

①對各多肽合成管進行區分，根據進行下一步反應所需要的偶合溶液對各多肽合成管進行分組，將需要的偶合溶液相同的多肽合成管歸為同一組；下一步反應需要的偶合溶液類型是根據下一步需要偶合的氨基酸來確定的。

②對于同一組裝有樹脂的多肽合成管，將該組中的每個多肽合成管分別通過連接磨口9插入同一反應缸體1，將偶合溶液加入反應缸體1；

③打開氮氣閥門5，進行氮氣攪拌，使反應缸體1內的液體與樹脂充分接觸；氮氣通過各多肽合成管的頂端開口或者反應缸體1上的氣體進出管8流出，本步驟持續進行2-3小時；關閉氮氣閥門5，進行所述抽濾操作；然后進行第五步驟即洗滌樹脂步驟，然后進行第八步驟；

第八步驟是檢測偶合反應是否完成的步驟，具體是：

通過茚三酮顯色法檢測各多肽合成管中的樹脂的偶合反應是否完成；對于未完成偶合反應的樹脂，重復第七步驟以重新進行偶合反應；對于已完成偶合反應的樹脂，則進行第四至第六步驟。

所述溶脹溶劑為N，N-二甲基甲酰胺溶劑；所述樹脂采用Wang樹脂或Rink樹脂。所述氣體進出管8設有兩個，一個連接在反應缸體1頂面中心處，另一個連接在反應缸體1側壁頂部。在加大氮氣攪拌的力度（即加大氮氣壓力）時，能夠使氮氣順暢地流出反應缸體1。

本發明盡管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解：依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。