雜色曲菌素核酸適配體及其應用的制作方法

本發明屬于檢測
技術領域：
，涉及一種對雜色曲菌素(versicolorina，vera)具有特異性識別作用的核酸適配體分子以及其應用。
背景技術：
：雜色曲菌素(vera，versicolorina)即1,6,8-三羥基-2-羥甲基蒽醌，是黃曲霉毒素b1及雜色曲霉素(sterigmytocystin，st)合成代謝過程中的重要前體物，其結構含有與afb1和st相同的毒性基團—雙呋喃環。研究表明對糧食在儲藏過程中的vera進行監測，有利于對尚未檢出或僅低水平檢出黃曲霉毒素污染的糧食起到預警的作用。此外，20世紀80年代，wong等初步研究了vera的急性毒性和致畸變性，其ld50(小鼠靜脈注射)為20mg/kg，致突變劑量為800ng/皿，因而雜色曲菌素的毒性不容忽視。vera常見于易受黃曲霉毒素污染的糧食等農產品中，若某糧食樣品中檢測出較高水平的vera(如100ppb以上)，即使當時未檢出或低量檢出黃曲霉毒素，但在儲藏過程中，尤其是較長期的儲藏過程中，該糧食樣品存在著較高的受到黃曲霉毒素污染的風險。隨著國內外對afb1、st的危害性重視程度日益加深，很多高靈敏性的分析檢測方法也隨之成熟，但對vera的污染和檢測關注仍然不足。目前主要的分析檢測的vera方法包括hplc(高效液相色譜)和tlc(薄層色譜)。hplc方法分辨率高、穩定性好、成本較低，但是樣品的預處理過程較繁瑣，操作技術水平要求高，對樣品的前處理要求苛刻，靈敏度不夠高；而tlc方法操作簡單、無需復雜儀器，但其靈敏度不高，可靠性也不強。適配體親和固相萃取柱是基于適配體的特異性作用實現特異性分離目標物，聯用hplc的檢測手段實現對目標物的定量分析的裝置。與蛋白質抗體相比，適配體具有更優越的特點：親和力高，特異性強，穩定性好，易于修飾，生產成本低，靶分子范圍廣等。因此，利用適配體制作親和固相萃取柱，具有耗時短，操作簡單、特異性強、靈敏度高、可在線和易于微型化等優點，避免了制作抗體的復雜性，因此受到了人們高度重視。技術實現要素：為了解決現有雜色曲菌素(versicolorina,vera)檢測技術單一，檢測方案復雜，檢測時間過長的缺點，本發明的第一個目的在于提供一種雜色曲菌素核酸適配體，即vera-aptamar，它對vera具有特異性識別作用，可用于樣品中vera檢測樣品的前處理。本發明所述的一種雜色曲菌素核酸適配體是全長49nt的單鏈dna，包括序列為seqidno.1的核心序列。seqidno.1：ttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttc。本發明還提供了以所述的雜色曲菌素核酸適配體為前體進行3’端氨基修飾的雜色曲菌素核酸適配體。優選地，3’端的氨基修飾基團為-(ch2)6-nh2-，也就是veraaptamar3’-(ch2)6-nh2-。本發明的第二個目的在于提供一種雜色曲菌素的樣品前處理適配體親和柱，可通過高效液相色譜檢測法實現對vera的高靈敏度、高選擇性的快速檢測。本發明所述的雜色曲菌素的樣品前處理適配體親和柱組裝有所述的雜色曲菌素核酸適配體。本發明所述的適配體親和柱是一種親和固相萃取柱，它是以本發明所述的適配體為分子識別元件來檢測vera的，其原理是：在vera存在的情況下，本發明所述的適配體與vera特異性結合，引起所述適配體空間構象發生變化，從而特異性的從基質中捕獲vera。本發明的第三個目的在于提供一種hplc紫外熒光聯用檢測vera的方法。本發明所述的hplc紫外熒光聯用檢測vera的方法，包括以下步驟：提供所述的雜色曲菌素的樣品前處理適配體親和柱；待測糧食樣品與緩沖液混合上柱，清洗洗脫；收集洗脫液，濃縮，進行hplc檢測。本發明的第四個目的在于提供一種生物傳感器。本發明所述的生物傳感器含有本發明所述的雜色曲菌素核酸適配體。本發明的第五個目的在于提供一種檢測雜色曲菌素的生物檢測試紙條。本發明所述的檢測雜色曲菌素的生物檢測試紙條含有所述的雜色曲菌素適配體。本發明的第六個目的在于提供一種檢測雜色曲菌素的試劑盒。本發明所述的檢測雜色曲菌素的試劑盒包括所述的生物檢測試紙條。本發明的有益效果在于：(1)本發明所述的vera核酸適配體具有親和力高，特異性強，穩定性好，易于修飾，生產成本低，靶分子范圍廣，長時間暴露不易變性，對周圍環境要求不高等特點。(2)采用氨基修飾后一步共價偶聯到載體的方式滿足了與適配體結合的穩定性要求，同時大大簡化了對適配體的修飾過程，還能夠維持適配體的活性結構。(3)本發明基于適配體與vera的特異性識別作用，用本發明所述的適配體親和柱組裝了所述的vera核酸適配體。采用hplc檢測技術，建立了一種基于適配體親和固相萃取作為前處理的hplc檢測vera的方法，為vera的檢測提供了一種新的方法和途徑。該適配體親和柱配合高效液相色譜的熒光或紫外檢測器聯用可檢測100ppb的vera。(4)本發明所述的適配體親和固相萃柱制備過程試劑用量極少，相比傳統的液液萃取與硅膠柱凈化而言，處理速度更快，需要使用的有機溶劑也指數倍地減少。與傳統的液液萃取手段相比，該方法具有特異性強，簡便靈活，分析速度快，使用成本低廉等優點。該樣品前處理方法操作簡單便捷，較液液萃取法靈敏度高且更加穩定可靠。本發明為vera的檢測提供了一種新的快速的樣品前處理方法。附圖說明圖1為5μg/ml濃度下的vera標準品的hplc紫外吸收圖譜，rs為16.420min，紫外檢測波長288nm。圖2為5μg/ml濃度下的vera標準品的hplc熒光圖譜，rs為16.529min，熒光檢測器的激發光波長為288nm，發射光波長為530nm。圖3為含vera的實際玉米樣品經過aac柱處理后的洗脫液的hplc色譜圖(紫外吸收檢測器)，rsvera為16.293min，紫外檢測波長288nm。圖4為與圖3相同的含vera的實際玉米樣品經過aac柱處理后的洗脫液的hplc色譜圖(熒光檢測器)，rsvera為16.400min,熒光檢測器的激發光波長為288nm，發射光波長為530nm。圖5為未經aac柱處理的含vera標品100ng/ml的溶液與bb6.4緩沖液的混合液(含6％甲醇)的過柱處理前的hplc色譜圖，rsvera為16.260min，紫外檢測波長為288nm。未檢出熒光信號。圖6為未經aac柱處理的含vera100ng/ml的玉米提取液與bb6.4緩沖液的混合液(含6％甲醇)的過柱處理前的hplc色譜圖，rsvera為16.177min，紫外檢測波長為288nm。未檢出熒光信號。圖5為含vera為100ng/mlvera標準品與緩沖液混合液，含6％甲醇，未經aac柱處理的hplc色譜圖的紫外檢測。圖6為含vera100ng/ml的玉米提取液與緩沖液混合液，含6％甲醇，未經aac柱處理的hplc色譜圖的紫外檢測色譜圖。未檢出熒光信號。圖7為標準品vera(100ng/ml)與緩沖液混合液(含6％甲醇)經aac柱處理后的hplc色譜圖(紫外吸收檢測器)。紫外檢測波長為288nm。圖8為標準品vera(100ng/ml)與緩沖液混合液(含6％甲醇)經aac柱處理后的hplc色譜圖(熒光檢測器)。熒光檢測器的激發光波長為288nm，發射光波長為530nm。具體實施方式實施例一：本發明所述的vera核酸適配體化學合成如下表1所示的vera核酸適配體，這些核酸序列均為長度49bp的單鏈dna。表1如上表所示，所有雜色曲菌素核酸適配體均包括序列為seqidno.1的核心序列，該核心序列為37個堿基，分別在核心序列的兩端隨機引入核酸堿基。seqidno.1：ttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttc將表1所列的核酸適配體的3’端進行氨基修飾，得到vera-aptamar3’-(ch2)6-nh2-，用于以下的實施例。實施例二：vera的適配體親和固相萃取小柱的構建(一)試劑與儀器雜色曲菌素a(vera，本實驗室制備，純度99.96％)。na2hpo4·12h2o、c6h8o7·h2o、nacl、kcl、mgcl·6h2o、甲醇為色譜純，購自fisherscientific(thermofisher)。實驗用水為超純水(電阻率：18.2mω/cm)。nano-100，微量分光光度計，用以測定dna濃度。vera核酸適配體組裝液的配制：組裝液為769.5μg/ml的3’端修飾了氨基的單鏈dna適配體溶液，用200mm磷酸氫二鈉(na2hpo4)，5mm氯化鎂(mgcl)，ph8.0的適配體溶液溶解配制。(二)適配體親和固相萃取柱的構建(1)3’端氨基化的適配體預處理1.5ml離心管中含有5od的適配體。溶解到200μl的適配體溶解液中，以封口膜封閉離心管后。置于85℃的熱水浴中3min，關閉水浴鍋，將離心管與熱水一同轉移至鋁盤中隨同水溫一起降至室溫25℃，使得適配體經歷變性和退火的過程，形成特定的二級結構。(2)cnbr-activatedsepharose活化處理準確稱取35mg的cnbr-activatedsepharose，置入spe空柱管中，加入1ml的1mmhcl溶脹15min后以1ml的1mmhcl，4℃淋洗6次，每次1ml，然后使用ddh2o清洗2ml，最后加入200ml適配體溶解液潤洗。(3)適配體與載體偶聯a.200μl的經過退火處理的適配體加入到上述已經經過預活化的cnbr-activatedsepharose中，震蕩處理混合室溫下25℃過夜處理。回收活化后的適配體廢液。b.經過適配體偶聯處理的載體簡稱為aac柱，向aac柱中加入3ml的200mm磷酸氫二鈉溶液，ph8.0，淋洗柱體清洗掉多余的適配體。c.加入200μl的0.1mtris-鹽酸(tris-hcl)，ph8.0封閉aac柱中殘留的活性基團，室溫下兩小時。d.除去沒有偶聯的適配體：先使用3ml的0.1m的0.1m醋酸-醋酸鈉(ch3cooh—ch3coona)，0.5mnacl，ph4.0淋洗；之后使用3ml的0.1m的0.1mtris-鹽酸(tris-hcl)，0.5mnacl，ph8.0淋洗。e.加入5ml的結合緩沖液(bindingbuffer)，ph6.4，(簡稱為bb6.4)來復性適配體。如果暫時不使用，排空bb6.4，替換成0.05％的疊氮化鈉保護液，置于4℃中保存。實施例三：適配體親和固相萃取柱對空白液加標樣品的富集(1)適配體親和柱上樣，清洗洗脫操作a)配置100ng/ml，含有6％甲醇的bb6.4溶液的vera標準液。b)上樣：1ml(相當于0.05g玉米，6％甲醇)，100ng/ml的上述母液，通過柱子的速度為1滴/5秒，一個大氣壓下緩慢通過適配體親和柱。1ml樣品完全通過柱子后，最后利用正壓將管路內的所有的上樣液壓出。c)清洗：加入10ml的bb6.4緩沖液，同樣2滴/秒通過柱子。待所有bb6.4緩沖液完全通過適配體親和柱后，利用正壓將管路內的所有液體排空，之后抽真空30s將所有的bb6.4緩沖液完全排空。d)洗脫：向適配體親和柱中加入1.5ml的色譜級甲醇，1滴/秒。待所有的甲醇通過柱子后，利用正壓將管路內的所有甲醇完全壓出到2ml離心管中。e)重生：向適配體親和柱中加入5ml的bb6.4緩沖液，以1滴/秒的速度通過aac柱。f)樣品揮干：將收集到的3個裝有樣品的2ml離心管放入真空干燥箱中，開啟真空泵，之后開啟真空干燥箱的真空閥，開啟烘箱設定溫度80℃。樣品揮干后，關閉真空閥門，再關閉真空泵。一個柱子重復上述操作3次，避免因為適配體親和柱之間的柱效差異干擾。(2)高效液相色譜分析采用戴安u3000高效液相色譜進行定量分析，設定檢測通道為uv288nm，fld為ex288，em530nm。分析流動相梯度如下所示。a相：10mm醋酸銨/20μm乙酸鈉水溶液；d相：10mm醋酸銨/20μm乙酸鈉甲醇溶液。表2：vera的hplc梯度洗脫程序時間(分鐘)流動相d(％)流動相a(％)0.0140601.00158511.0158515.0010025.0010026.04060404060使用同一條一個柱子重復上述操作3次，避免因為適配體親和柱之間的組裝差異導致的柱效差異干擾，作為三個平行。每一個平行的加標量為100ng，每一個揮干的平行進行hplc檢測前的復溶體積為100μl。將表1所列的10個適配體分子進行實施例二和三的實驗，得到的實驗結果如表3所示。表3：vera在最適條件下過適配體親和柱后的回收率注：1e(standard)的表示1號柱，e代表洗脫液即elution液，standard代表標準品。如此類推。回收率數據為第2次、3次和6次重復使用的三次結果平均±標準差。如表3所示，在37個核心堿基序列的基礎上分別在兩端隨機引入核酸堿基，總長度為49bp的單鏈dna分子，經氨基修飾后以同樣的方法和條件組裝成親和柱，得到相似的結果。圖1和圖2分別為vera標品原液(5μg/ml)上機的hplc色譜的紫外吸收圖譜和熒光檢測圖譜。圖5為未經aac柱(1號柱)處理的標品與緩沖液的混合液上機后的hplc色譜圖，而圖7(紫外檢測)和圖8(熒光檢測)為相同的標品混合液經aac柱富集后的hplc效果圖。表明本發明的適配體親和柱(aac柱)具有明顯的富集vera的作用。實施例四：實際樣品中100ppbvera加標檢測將本發明所述的適配體親和固相萃取柱用于實際樣品測定及檢測其回收率，所述的樣品可以是農副產品和糧食作物包括玉米、花生、大米、小麥等，也可以是其它可能含有vera的產品如飼料、飲料、食用植物油等。本實施例中選用玉米樣品進行檢測。玉米萃取階段：取玉米樣品5克，利用粉碎機粉碎后過20目篩網后，放入50ml的離心管中，之后加入10ml的60％甲醇水溶液，高速勻質1min。之后在離心機中1000g離心1min，取上清濾液過0.45μm玻璃纖維濾膜，經過﹣20℃過夜處理后，添加vera標準溶液至終濃度為50ng/mlvera，即得到含有vera50ng/ml的玉米提取液(相當于0.5g玉米/ml)。之后使用1ml的50ng/mlvera，60％甲醇玉米提取液與9mlbb6.4緩沖液混合降低本底干擾，得到5ng/mlvera玉米提取液(相當于0.05g玉米/ml)，6％甲醇的玉米bb6.4混合液樣品液(相當于100ppbvera)。適配體親和柱上樣清洗洗脫操作：a)上樣：排空上篩板以上復性用的bb6.4緩沖液，加入5ml(相當于0.25g玉米，6％甲醇)，5ng/mlvera的上述樣品液，通過柱子的速度為1滴/5秒。5ml樣品完全通過柱子后，最后利用正壓將管路內液體排空。b)清洗：加入2ml的bb6.4緩沖液，同樣1滴/5秒通過柱子。待所有bb6.4緩沖液完全通過適配體親和柱后，利用正壓將管路內的所有液體排空，之后抽真空30s將所有的bb6.4緩沖液完全排空。c)洗脫：向適配體親和柱中加入1.5ml的色譜級甲醇，1滴/10秒。待所有的甲醇通過柱子后，利用正壓將管路內的所有甲醇完全壓出到2ml離心管中。d)重生：向適配體親和柱中加入5ml的bb6.4緩沖液，以1滴/秒的速度通過適配體親和柱。e)樣品揮干：將收集到的3個裝有樣品的2ml離心管放入真空干燥箱中，開啟真空泵，之后開啟真空干燥箱的真空閥，開啟烘箱設定溫度80℃。樣品揮干后，關閉真空閥門，再關閉真空泵。一個柱子重復上述操作3次，避免因為適配體親和柱之間的柱效差異導致干擾。所有操作過程中避免壓力突然增大或者降低，不然會造成柱體完整的截面受損影響柱效。高效液相色譜分析：采用戴安u3000高效液相色譜進行定量分析，設定檢測通道為uv288nm，fld為ex288，em530nm。分析流動相梯度如下所示。樣品使用60％a相40％d相作為溶解液，加入100μl復溶經過濃縮干燥的樣品，上機檢測前使用離心機以13200rpm(相當于11737g)轉速離心5min。a相：10mm醋酸銨/20μm乙酸鈉水溶液；d相：10mm醋酸銨/20μm乙酸鈉甲醇溶液。表4：vera的hplc梯度洗脫程序玉米中100pb的vera加標回收率每一個平行的vera加標量為25ng，每一個揮干的平行樣品進行hplc檢測前的復溶體積為100μl。回收率見下表：表5：適配體親和柱對vera的回收率注：1e(corn)的表示1號柱，e代表洗脫液即elution液，corn代表玉米提取液。如此類推。數據為第2次、3次和6次重復使用的三次結果平均±標準差。圖6為未經aac柱處理的玉米樣品提取液與緩沖液混合液的hplc色譜圖，而圖3(紫外檢測)和圖4(熒光檢測)為相同樣品經過aac柱處理后的hplc效果圖。可以發現aac除了具有富集vera的作用之外，還消除了在圖6中出現在目標分子vera附近的兩個來自玉米的雜質峰。顯示出本發明vera適配體親和柱(aac柱)的特異選擇性(消除了兩個極性與目標分子相似的雜質)。如表4所示，在37個核心堿基序列的基礎上分別在兩端隨機引入核酸堿基，總長度為49bp的單鏈dna分子，經氨基修飾后以同樣的方法和條件組裝成親和柱，得到相似的結果。三次平行的最大變異系數c.v為11.5％，三次的回收率都能保持在較高的水平，這說明所制備的vera適配體親和柱性能穩固。綜合上述實施例的實驗結果，本發明所述的雜色曲菌素(vera)核酸適配體構建的適配體親和固相萃取柱作為前處理手段在檢測玉米樣品中具有顯著效果。由此推知，在其他典型的糧食樣品中，本發明所述的適配體親和固相萃取柱也能作為檢測vera的前處理手段。實施例五：本發明所述的雜色曲菌素核酸適配體的應用基于上述實施例的實驗結果，結合本領域的已知技術，至少可以制備出以下產品：(1)生物傳感器，它含有本發明所述的雜色曲菌素核酸適配體。(2)檢測雜色曲菌素的生物檢測試紙條，它含有所述的雜色曲菌素適配體。(3)檢測雜色曲菌素的試劑盒，它包括上述的檢測雜色曲菌素的生物檢測試紙條。sequencelisting<110>暨南大學<120>雜色曲菌素核酸適配體及其應用<130><160>11<170>patentinversion3.4<210>1<211>37<212>dna<213>人工合成<400>1ttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttc37<210>2<211>49<212>dna<213>人工合成<400>2tgttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgcaggcccgg49<210>3<211>37<212>dna<213>人工合成<400>3gtgttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggccc49<210>4<211>49<212>dna<213>人工合成<400>4gtggggttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctagg49<210>5<211>49<212>dna<213>人工合成<400>5gttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggcccac49<210>6<211>49<212>dna<213>人工合成<400>6ttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcaggcccggccgg49<210>7<211>49<212>dna<213>人工合成<400>7ggtgttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggcc49<210>8<211>49<212>dna<213>人工合成<400>8aggtgttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggc49<210>9<211>49<212>dna<213>人工合成<400>9agtgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggcccac49<210>10<211>49<212>dna<213>人工合成<400>10taggggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggcccac49<210>11<211>49<212>dna<213>人工合成<400>11tggttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctagccac49當前第1頁12