一種從北葶藶子中提取硫苷化合物的方法及其應用與流程

本發明涉及醫藥領域，特別是一種從北葶藶子中提取硫苷化合物的方法及其應用。

背景技術：

葶藶子始載于《神農本草經》，列為草部下品，為常用中藥材。2015版《中國藥典》收錄的“葶藶子”有南北之分，其中十字花科植物獨行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟種子習稱“北葶藶子”，而播娘蒿Descurainia sophia(L.)Webbex Prantl.的干燥成熟種子習稱“南葶藶子”。該藥味辛、苦，性大寒，歸肺與膀胱經，具有宣泄平喘、行水消腫的功效。南葶藶子研究較多，其化學成分主要有黃酮類、硫苷類、異硫氰酸類等，而北葶藶子研究較少。據記載，北葶藶子具有強心作用，其化學成分主要是黃酮類。而從葶藶子的水提物中分離硫苷化合物以及研究其應用至今還未見有這方面的相關報道。

技術實現要素：

針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種從北葶藶子中提取硫苷化合物的方法，可有效挖掘北葶藶子的新作用。

本發明解決的技術方案是，從北葶藶子中提取硫苷化合物的方法：取炮制后的北葶藶子，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子2-3倍重量的體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，先用水洗脫，再用20％乙醇洗脫，得到20％乙醇洗脫部位A，20％乙醇洗脫部位A用水離散溶解，離心過濾，濃縮后通過Toyopearl HW-40柱色譜，依次用水和10％含水甲醇洗脫，得到水洗脫組分B1和10％甲醇洗脫組分B2，組分B2經ODS-18反相柱色譜，分別用水和10％含水甲醇洗脫洗脫，得到組分C1和C2，組分C2用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結晶，將上層溶液吸出，干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結晶，如此反復操作4次，合并得到的無色結晶，將無色結晶用甲醇溶解，用半制備HPLC分離，色譜柱為YMC-Pack ODS-A色譜柱(規格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝32:68，得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin。

硫苷化合物(cis-desulfoglucotropaeolin)，分子式為C₁₄H₁₉NO₆S[M+H]+m/z 330.1013，其結構式如下：

本發明從北葶藶子水提物中分離得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin，含量較高，且硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin對雙氧水(H₂O₂)損傷大鼠心肌細胞H9c2具有一定的保護作用，能極顯著提高細胞活力，為制備心肌保護類藥物提供了新的途徑。

附圖說明

圖1為本發明cis-desulfoglucotropaeolin的¹H-NMR譜(DMSO-d₆)。

圖2為本發明cis-desulfoglucotropaeolin的¹³C-NMR譜(DMSO-d₆)。

圖3為本發明cis-desulfoglucotropaeolin的¹H-¹H COSY譜。

圖4為本發明cis-desulfoglucotropaeolin的HSQC譜。

圖5為cis-desulfoglucotropaeolin的HMBC譜。

圖6為本發明cis-desulfoglucotropaeolin的NOESY譜。

圖7為本發明cis-desulfoglucotropaeolin的MS譜。

圖8為本發明cis-desulfoglucotropaeolin的UV譜。

圖9為本發明cis-desulfoglucotropaeolin的IR譜。

圖10為本發明硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin對H₂O₂誘導的H9c2大鼠心肌細胞存活率的影響(n＝6)。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1

取炮制后的北葶藶子8kg，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至2000ml浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子4倍體積的體積濃度為80％的乙醇醇沉，醇沉5次，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味(約1500ml)，上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，先用水洗脫，除去大部分多糖，再用20％乙醇洗脫，得到20％乙醇洗脫部位A(71.2g)，20％乙醇洗脫部位A用水離散溶解，離心過濾，濃縮后(約30ml)通過Toyopearl HW-40柱色譜，依次用水和10％含水甲醇洗脫，得到水洗脫組分B1(40.2g)和10％甲醇洗脫組分B2(12.8g)，組分B2經ODS-18反相柱色譜，分別用水和10％含水甲醇洗脫洗脫，得到組分C1(5.0g)和C2(5.2g)，組分C2用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結晶，將上層溶液吸出，干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結晶，如此反復操作4次，合并得到的無色結晶，將無色結晶用甲醇溶解，用半制備HPLC分離，YMC-Pack ODS-A色譜柱(規格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝32:68，得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin(質量m＝2.0g,保留時間t_R＝26.2min)。

實施例2

取炮制后的北葶藶子5kg，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至1500ml浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子4倍體積的體積濃度為80％的乙醇醇沉，醇沉5次，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味(約1200ml)，上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，先用水洗脫，再用20％乙醇洗脫，得到20％乙醇洗脫部位A(45.3g)，20％乙醇洗脫部位A用水離散溶解，離心過濾，濃縮后(約25ml)通過Toyopearl HW-40柱色譜，依次用水和10％含水甲醇洗脫，得到水洗脫組分B1(25.6g)和10％甲醇洗脫組分B2(9.1g)，組分B2經ODS-18反相柱色譜，分別用水和10％含水甲醇洗脫洗脫，得到組分C1(3.3g)和C2(3.4g)，組分C2用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結晶，將上層溶液吸出，干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結晶，如此反復操作4次，合并得到的無色結晶，將無色結晶用甲醇溶解，用半制備HPLC分離，色譜柱為YMC-Pack ODS-A色譜柱(規格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝32:68，得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin(1.3g)。

實施例3

取炮制后的北葶藶子10kg，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至2500ml浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子4倍體積的體積濃度為80％的乙醇醇沉，醇沉5次，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味(約2000ml)，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，先用水洗脫，再用20％乙醇洗脫，得到20％乙醇洗脫部位A(88.9g)，20％乙醇洗脫部位A用水離散溶解，離心過濾，濃縮(40ml)后通過Toyopearl HW-40柱色譜，依次用水和10％含水甲醇洗脫，得到水洗脫組分B1(51.0g)和10％甲醇洗脫組分B2(16.3g)，組分B2經ODS-18反相柱色譜，分別用水和10％含水甲醇洗脫洗脫，得到組分C1(6.3g)和C2(6.5g)，組分C2用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結晶，將上層溶液吸出，干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結晶，如此反復操作4次，合并得到的無色結晶，將無色結晶用甲醇溶解，用半制備HPLC分離，色譜柱為YMC-Pack ODS-A色譜柱(規格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝32:68，得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin(2.5g)。

為了明確北葶藶子的藥效物質基礎，本發明采用水煎煮法對其進行提取，而由于其遇水發黏，使得水煎液提取率低不說，提取出來的成分絕大部分是粘液質，因此本發明首先采用清炒法，于240℃，炒制5.5min對其進行簡單炮制，以使北葶藶子中的成分更易溶出，從北葶藶子的水提物中從中分離并鑒定了兩個新的酚苷化合物，即：北葶新苷A和北葶新苷B，實驗結果顯示這兩個新酚苷化合物均能顯著提高雙氧水(H₂O₂)誘導的大鼠心肌細胞H9c2損傷的細胞存活率，具有心肌細胞保護作用。并經試驗進行了充分證明，相關試驗資料如下：

1儀器與試藥

核磁共振用BrukerAVANCEⅢ500核磁共振儀(TMS內標)(Bruker)，紅外光譜用Nicolet is 10Microscope Spectrometer(Thermo Scientific,USA)，高分辨質譜用Bruker maxis HD mass spectrometer，紫外光譜用Shimadzu UV-2401PC apparatus，高效液相色譜用Waters Alliance系列2695高效液相系統，配備2998型二極管陣列檢測器，Empower3色譜數據工作站，LC50型高壓制備液相色譜儀，UV200型紫外檢測器[賽譜銳思(北京)科技有限公司]，YMC-Pack ODS-A色譜柱(250×10mm.D.S-5mm,12mm)(YMC有限公司)，其余有N-1100型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)，A-1000S型水流抽氣機(上海愛朗儀器有限公司)，N-1111型冷凍水循環裝置(上海愛朗儀器有限公司)，FDU-2110型冷凍干燥機(上海愛朗儀器有限公司)，DFZ-60508型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，AB204-N萬分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)，iMARK型酶標儀(美國BIO-RAD)，二氧化碳培養箱(上海STIK)，超凈工作臺(蘇凈集團)，Arium 611VF超級組合型超純水器(SARTORIUS)，倒置顯微鏡(Nikon)，PB-10酸度計(德國賽多利斯集團)。

柱層析填料Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20(日本三菱化學公司)，Toyopearl HW-40(日本TOSOH公司)，Sephadex LH-20(Parmacia Biotech公司)，柱層析所用硅膠H(160-200目)為青島海洋化工廠生產，培養皿、96孔培養板、細胞凍存管(Corning公司)，所用色譜純試劑位天津四友精細化學品有限公司生產，所用分析純試劑為北京化工廠和天津第三化學試劑廠生產。

DMEM高糖培養液(Gibco)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(Gibco)，DMSO(Solarbio)；MTT(Biosharp)，H₂O₂溶液(天津市恒興化學試劑制造有限公司)，水為超純水，PBS緩沖液等為自配。

北葶藶子于2014年采自河南南陽，經河南中醫學院陳隨清教授及董誠明教授鑒定為十字花科植物獨行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟種子。

2結構鑒定

cis-desulfoglucotropaeolin，無色結晶性粉末(MeOH)，分子式為C₁₄H₁₉NO₆S[M+H]⁺m/z330.1013(計算式.330.1013)，UV(MeOH)λ_max:209nm和230nm。其結構式、主要HMBC相關及核磁數據如下：

主要HMBC相關

HMBC相關

NOE相關

表1 cis-desulfoglucotropaeolin的¹H NMR(500MHz)和¹³C NMR(125MHz)數據(in DMSO-d₆)

3 cis-desulfoglucotropaeolin對雙氧水(H₂O₂)損傷大鼠心肌細胞H9c2的保護作用

3.1細胞

H9c2細胞株購自深圳市百恩維生物科技有限公司。

3.2細胞培養

將H9c2培養在含體積分數為10％胎牛血清的DMEM培養基中(含青霉素和鏈霉素100kU·L^-1)，置于37℃、5％CO₂飽和濕度培養箱中培養，均取對數生長期細胞用于實驗。

3.3 H₂O₂誘導的H9c2大鼠心肌細胞損傷模型的建立

傳代培養時，將對數生長期的細胞以5×10⁴的密度接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后，換用含藥的高糖DMEM培養液。H₂O₂給予含200μM H₂O₂的含血清高糖DMEM培養液培養6h。

3.4實驗分組

每組設6個平行孔，設正常組(NC)、H₂O₂組(M)、cis-desulfoglucotropaeolin給藥組。H₂O₂組：給予含200μM H₂O₂的含血清高糖DMEM培養液培養6h；cis-desulfoglucotropaeolin給藥組：分別給予含200μM H₂O₂和1、2、4、8、16、32、64μMcis-desulfoglucotropaeolin的含血清高糖DMEM培養液培養6h。

3.5 MTT法檢測cis-desulfoglucotropaeolin對H9c2損傷細胞存活率的影響

細胞接種于96孔板，貼壁后加藥干預培養后，吸除上清液，各孔分別加入含1％MTT(5g/L)的高糖DMEM培養液200μl，37℃孵育4h，吸除上清液，加入150μL的DMSO，震蕩10min使結晶充分溶解。用酶標儀檢測490nm波長處OD值，用公式計算細胞存活率＝(OD實驗組/OD對照組)×100％。實驗重復3次，取平均值。

3.6統計方法

實驗數據用均數±標準差表示，用SPSS18.0統計軟件處理數據，各組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，P<0.05表示有顯著性意義，P<0.01表示有極顯著性意義。

3.7結果

北葶藶子中化合物cis-desulfoglucotropaeolin對H₂O₂誘導的H9c2大鼠心肌細胞存活率的影響(n＝6)

注：與正常組比較:*P<0.05；**P<0.01與H₂O₂組比較:^#P<0.05；^##P<0.01

研究結果表明：與空白組相比，模型組細胞活力顯著降低；與模型組相比，北葶藶子單體化合物cis-desulfoglucotropaeolin給藥劑量在32、64μM時，極顯著提高細胞活力(P<0.01)，在2、4μM時，顯著抑制細胞活力(P<0.05)，在8、16μM時，對細胞活力無明顯改變，表明北葶藶子單體化合物cis-desulfoglucotropaeolin對心肌細胞有一定的保護作用。

綜上，本發明從北葶藶子的水提物中分離并鑒定的硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin，含量較高，硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin對雙氧水(H₂O₂)損傷大鼠心肌細胞H9c2具有一定的保護作用，能極顯著提高細胞活力，可有效用于制備心肌保護類藥物，開發了北葶藶子的新用途，具有實際的臨床意義和良好的應用推廣價值。