重組腺病毒載體表達體內自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒及其制備方法和應用與流程

文檔序號：11582399閱讀：476來源：國知局

本發明涉及基因工程領域。更具體地，涉及一種重組腺病毒載體表達體內自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒及其制備方法和應用。

背景技術：

人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus,rsv)是引起全球5歲以下嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病毒性病原，常引發肺炎、支氣管炎(hall,c.b.,e.a.simoes,andl.j.anderson,clinicalandepidemiologicfeaturesofrespiratorysyncytialvirus.currtopmicrobiolimmunol,2013.372:p.39-57.)。老年人和免疫缺陷病人也是rsv的易感人群(jorquera,p.a.,l.anderson,andr.a.tripp,understandingrespiratorysyncytialvirus(rsv)vaccinedevelopmentandaspectsofdiseasepathogenesis.expertrevvaccines,2016.15(2):p.173-87.)。人在一生中可反復感染rsv，自然感染rsv僅能誘導短期的免疫力，產生不完全的保護(graham,b.s.,k.modjarrad,andj.s.mclellan,novelantigensforrsvvaccines.curropinimmunol,2015.35:p.30-8.)。統計數據顯示：1歲以內的嬰幼兒，有超過60％的急性呼吸道感染、超過80％的下呼吸道感染是由rsv引起(mazur,n.i.,etal.,lowerrespiratorytractinfectioncausedbyrespiratorysyncytialvirus:currentmanagementandnewtherapeutics.lancetrespirmed,2015.3(11):p.888-900。)。世界衛生組織估計，每年在世界范圍內rsv可引起至少6400萬人發病和16萬人死亡。盡管rsv危害嚴重，但是尚缺乏可靠、有效的方法來診斷、預防及治療rsv病毒感染(girard,m.p.,etal.,areviewofvaccineresearchanddevelopment:humanacuterespiratoryinfections.vaccine,2005.23(50):p.5708-24；murata,y.,respiratorysyncytialvirusvaccinedevelopment.clinlabmed,2009.29(4):p.725-39.)。具有預防rsv病毒感染作用的rsv疫苗亟待研制。世界衛生組織及美國醫學研究院有關21世紀疫苗報告中均將開發rsv疫苗列為最優先發展的疫苗項目之一。

rsv屬于副黏病毒科，肺炎病毒屬，有一個血清型，二個抗原亞型，單股負鏈rna病毒，共編碼11種蛋白，其中跨膜包膜糖蛋白f為rsv的主要中和抗原，基質蛋白m為rsv的骨架蛋白(mclellan,j.s.,w.c.ray,andm.e.peeples,structureandfunctionofrespiratorysyncytialvirussurfaceglycoproteins.currtopmicrobiolimmunol,2013.372:p.83-104)。

病毒樣顆粒(virus-likeparticles,vlps)是利用病毒衣殼或其他結構蛋白的自組裝能力形成的一種具有病毒形態結構特征的顆粒狀物質，不含病毒核酸，僅包括大量重復的病毒表面蛋白。病毒的糖蛋白像天然病毒一樣插入到vlps的膜上，從而保持了與天然病毒一樣的大小、空間構象、重復排列的中和抗原表位和顆粒特征，vlps的病毒抗原表位不會發生丟失、變性和增加，能誘導產生有效的免疫應答。

vlps作為rsv候選疫苗的研究取得了初步成果，但臨床應用仍存在許多問題有待探討。例如，rsv的f蛋白有5-6個n糖基化位點，這些糖基化位點對于f蛋白空間構象、融合活性、抗原性等都具有重要作用，但采用昆蟲和禽細胞表達系統制備rsvvlps，可能存在蛋白質翻譯后修飾修飾不足，影響vlps的空間構象和免疫原性(fang,n.x.,i.h.frazer,andg.j.fernando,differencesinthepost-translationalmodificationsofhumanpapillomavirustype6bmajorcapsidproteinexpressedfromabaculovirussystemcomparedwithavacciniavirussystem.biotechnolapplbiochem,2000.32(pt1):p.27-33；zhou,w.,etal.,molecularcharacterizationofrecombinanthepatitisbsurfaceantigenfromchinesehamsterovaryandhansenulapolymorphacellsbyhigh-performancesizeexclusionchromatographyandmulti-anglelaserlightscattering.jchromatogrbanalyttechnolbiomedlifesci,2006.838(2):p.71-7.)。而以天然病毒感染的宿主(或同源宿主)來源的表達系統能產生與天然病毒生物活性高度一致的vlps，并誘導產生最有效的免疫應答，取得更好的免疫保護效果(frietze,k.m.,d.s.peabody,andb.chackerian,engineeringvirus-likeparticlesasvaccineplatforms.curropinvirol,2016.18:p.44-9.)。另一方面，vlps的體外制備、表達和純化成本高昂，純化過程也可能引發蛋白構象變化而降低免疫原性。這些不足為其臨床應用帶來較大限制。

腺病毒載體(adenovirusvector,adv)對分裂期及非分裂期細胞均具有高感染效率、遺傳穩定性好、易制備高滴度病毒等多種優點被廣泛用于基因治療和疫苗載體研究。重組腺病毒具有體外復制滴度高，制備成本低，能高效表達外源蛋白及安全性好等特點。因此，建立一種以腺病毒為載體的vlps的新方法，既能發揮vlps的作用，又能適于大規模生產，且能有效降低成本。

技術實現要素：

本發明的第一個目的在于提供一種重組腺病毒表達自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒。

本發明的第二個目的在于提供上述呼吸道合胞病毒樣顆粒的制備方法。

本發明的第三個目的在于提供上述呼吸道合胞病毒樣顆粒的應用。

為達到上述目的，本發明采用下述技術方案：

一種重組腺病毒表達自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒包含呼吸道合胞病毒f和m蛋白，所述f和m蛋白分別采用哺乳動物細胞偏愛的密碼子優化的f和m基因進行編碼。

進一步，所述密碼子優化的f基因的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示；所述密碼子優化的m基因的核苷酸序列如序列表seqidno.2所示；

進一步，所述重組腺病毒表達的呼吸道合胞病毒f和m蛋白的基因由如seqidno.3所示的2a序列連接，連接后得到的核苷酸序列如seqidno.4所示。

進一步，所述重組腺病毒為一種復制缺陷型重組腺病毒ad5載體系統，包括一個骨架質粒、一個穿梭質粒和一個包裝細胞系。

本發明基于腺病毒的生物遞送和表達系統，提供了一種重組腺病毒表達呼吸道合胞病毒f和m蛋白自組裝成呼吸道合胞病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：

(1)按照哺乳動物細胞密碼子偏好分別優化rsvf、m基因；pcr方法用2a序列連接f和m基因，得到f-m基因，其核苷酸序列如seqidno.4所示；

(2)將f-m基因克隆到穿梭載體中，得到攜帶f-m基因的穿梭質粒，并進一步將穿梭質粒線性化后轉化到攜帶腺病毒基因組padeasy-1的bj5183的感受態細胞中進行重組，經篩選鑒定獲得重組質粒padeasy-f-m；

(3)將重組質粒padeasy-f-m線性化后轉染hek293細胞，獲得重組腺病毒rad-f-m；

(4)用cscl密度梯度法離心純化重組腺病毒rad-f-m；

(5)將純化后的重組腺病毒rad-f-m感染vero細胞，用透射電鏡可觀察病毒樣顆粒的形成。

優選地，所述用透射電鏡觀察病毒樣顆粒的步驟為：

(1)重組腺病毒rad-f-m感染vero細胞72h后收取細胞，2.5％戊二醛固定；

(2)經脫水、包埋、固化后做超薄切片；

(3)3％醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色；

(4)透射電鏡觀察、拍照。

優選地，所述穿梭載體為pshuttle載體。

本發明進一步提供了重組腺病毒表達自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒在制備用于預防或治療呼吸道合胞病毒感染疫苗或藥物、呼吸道合胞病毒抗體和呼吸道合胞病毒的診斷試劑中的應用。

其中，所述疫苗為注射劑、口服劑、滴鼻劑或透皮劑。

本發明的有益效果如下：

在本發明中，對rsva亞型long株f、m蛋白基因進行了密碼子優化，有效的增加了蛋白的表達量。本發明以單一腺病毒為載體，通過構建可共表達rsvf-m的重組腺病毒rad-f-m，感染宿主細胞后可原位產生自組裝的內生性rsvvlps(endogenousrsvvlps,rsvevlps)，避免了體外制備、純化vlp面臨的諸多問題，可在最大程度上保持f蛋白天然的構象和免疫原性，誘導機體產生更具保護性的中和抗體。因此，以重組腺病毒載體傳遞rsvf和m蛋白原位組裝vlps的方法，制備相對簡單、顯著降低成本，有助于提高rsv疫苗的安全性、免疫效果和免疫保護作用。

附圖說明

下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1示出pshuttle-cmv-f-m酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖，1：dl15000dnamarker；2：目的基因，f-m，大小是2547bp；

圖2示出重組腺病毒質粒padeasy-f-m經paci酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，1：dl15000dnamarker；2：目的基因f-m，條帶大小是33kb和4.5kb的片段；

圖3示出為重組腺病毒rad-f-m感染293細胞，導致293細胞發生病變，a：病變的293細胞，b：正常的293細胞；

圖4示出重組腺病毒rad-f-m感染293細胞72h后細胞上清的westernblot鑒定結果，a為rsvf單抗檢測f蛋白的條帶，b為rsvm多抗檢測m蛋白的條帶，位置均在270kda處；

圖5示出氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒rad-f-m形成的條帶；

圖6示出氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒rad-f-m的電鏡照片；

圖7示出重組腺病毒rad-f-m感染vero細胞形成vlps的電鏡觀察結果(3％醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，jem-1400,20,000×)；

圖8示出免疫后小鼠血清抗體分析，a為rsv特異性血清抗體滴度檢測結果，b為中和抗體滴度檢測結果；

圖9示出免疫后小鼠在rsv攻毒后肺病毒滴度分析結果，a為實時定量pcr法檢測小鼠肺病毒滴度的結果，b為對肺病毒滴度檢測結果的數據分析；

圖10示出免疫后小鼠在rsv攻毒后肺病理分析結果，a為肺血管周圍炎癥評分，b為肺支氣管周圍炎癥評分，c為肺間質炎癥評分。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例和附圖對本發明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護范圍。

本發明所用的呼吸道合胞病毒和重組腺病毒來自北京交通大學生物工程與生命科學研究院基因工程實驗室。

實施例1重組穿梭質粒的構建

1.構建：為提高rsvf、m蛋白在哺乳動物細胞中的表達量，采用哺乳動物細胞偏好的密碼子對rsvf、m密碼子進行優化并全基因合成，pcr方法用2a序列連接f和m，經xhoi、sacii雙酶切后將目的片段連接至pshuttle載體。

2.酶切鑒定及測序：所獲得的質粒經xhoi、sacii雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果在2547bp處和7500bp處出現特異性條帶(圖1)，分別與f-m和pshuttle載體大小一致，酶切鑒定陽性結果的質粒經測序驗證為正確質粒，重組質粒pshuttle-f-m構建成功。

實施例2構建含有f-m基因的重組腺病毒質粒

1.線性化穿梭質粒及重組

pmei線性化所獲得的重組質粒pshuttle-f-m，取0.5μg的已線性化的pshuttle-f-m轉化至攜帶腺病毒基因組padeasy-1的bj5183的感受態細胞中進行重組，kana⁺抗性lb平板37℃培養16h，挑取單菌落進行培養，并提取質粒。

2.酶切篩選鑒定重組質粒

paci酶切所獲得的質粒，經瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質粒酶切結果(圖2)，電泳結果顯示獲得了4.5kb和33kb二個片段。經酶切鑒定獲得正確重組質粒padeasy-f-m。

3.擴增重組質粒

用獲得的正確重組質粒padeasy-f-m轉化ecoli.dh10b感受態，擴增并純化獲得較大量的padeasy-f-m質粒。具體方法參考adeasyadenoviralvectorsystem第24頁：amplifyingrecombinantadplasmid。

實施例3轉染hek293細胞包裝重組腺病毒

1.paci線性化重組腺病毒質粒padeasy-f-m

用paci酶切重組腺病毒質粒padeasy-f-m，乙醇沉淀、室溫干燥，取20μl滅菌去離子水溶解。

2.轉染hek293細胞

hek293細胞來自于由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制研究所。

hek293細胞接種細胞培養板(6孔板)，轉染時細胞豐度約為50％-70％；取10μlpaci線性化處理的重組腺病毒質粒padeasy-f-m加入240μlopti-mem(gibco)并混勻，10μllipofactamine2000加入240μlopti-mem并混勻，室溫孵育5min；將上述二種溶液混勻，室溫孵育20min。將上述500μl的轉染復合物加入細胞培養基中，于37℃培養繼續培養4h后更換新的培養基。約在轉染后10d左右，hek293細胞出現細胞腫脹、變圓、折光性增強等典型的細胞病變(cpe)(圖3a)，圖3b為正常細胞對照。收集細胞及上清于-80℃、37℃反復凍融3次，取離心后的上清(p0代)感染hek293細胞，至細胞出現完全cpe，重復上述操作，獲得p1、p2、p3代病毒。

實施例4重組腺病毒蛋白表達及鑒定

1.接種重組腺病毒于hek293細胞，72h后收獲上清，上清經冷凍干燥保存于-80℃。

2.取凍干濃縮10倍的細胞上清上樣做sds-page電泳。

3.轉膜做westernblot，分別用rsvf單抗(131-2a；merckmillipore)、rsvm小鼠多抗檢測，結果在上清中均可檢測到約270kda的條帶，說明rsvf蛋白與m蛋白結合在一起，且均成功表達，結果見圖4。

實施例5重組腺病毒rad-f-m的制備和純化

1.擴大培養hek293細胞，約用15個150mm培養皿，細胞傳代6h后(豐度為90％)接種重組腺病毒，約3d后細胞呈現完全cpe且約有50％脫落時收獲細胞上清，于4℃5000rpm離心10min，收獲細胞。

2.用pbs重懸細胞沉淀，凍存于-80℃。

3.氯化銫密度梯度法離心純化重組腺病毒(圖5)。具體方法參考djpalmer,png.methodsfortheproductionoffirstgenerationadenoviralvectors.methodsinmolecularbiology,2008,433(433):55-78

4.收集純化后的腺病毒經透析后加入5％甘油保存于-80℃。

5.取10μl純化樣品制備電鏡負染樣品，并用透射電鏡觀察拍照(圖6)。

實施例6重組腺病毒滴度測定

重組腺病毒滴度測定參考clontech的adeno-xrapidtiterkit方法檢測。以2.5×10⁵個細胞/孔接種hek293細胞于24孔板，10倍系列稀釋病毒，每孔加入100μl病毒稀釋液，37℃5％co2培養箱中繼續培養48h，經固定后加入鼠抗-hexon抗體、相應的二抗、tmb顯色，在顯微鏡下計數，計算病毒滴度(方法參考：clontech,adeno-xrapidtiterkitmanual第9頁的adeno-x^tmrapidtiterprocedure)，所獲得的重組腺病毒滴度為：2.4×10¹⁰pfu/ml。

實施例7電鏡檢測重組腺病毒rad-f-m感染vero細胞組裝vlps

為檢測所獲得的重組腺病毒rad-f-m是否能在細胞內表達組裝vlps，用30moi的rad-f-m感染vero細胞，72h收集細胞，2.5％戊二醛固定，經脫水、包埋、固化后制備電鏡超薄切片，3％醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，用透射電鏡觀察拍照，觀察到病毒樣顆粒形成(圖7)。

實施例8重組腺病毒免疫小鼠誘導產生rsv特異性抗體及中和抗體

為評價重組腺病毒免疫小鼠抗體產生情況，通過滴鼻途徑免疫小鼠，檢測小鼠血清中rsv特異性抗體產生情況(圖8a)，抗體滴度測定是采用elisa方法檢測。進一步地，分析了所獲得的小鼠血清中的rsv特異性中和抗體的滴度(圖8b)。從抗體及中和抗體的數據分析，采用重組腺病毒rad-f-m表達rsvf、m能有效誘導小鼠產生抗體及中和抗體，rad-f-m與rad-f兩組之間沒有統計學差異，這意味著這種方法沒有影響rsvf蛋白的功能。

實施例9重組腺病毒免疫小鼠誘導rsv特異性免疫保護

重組腺病毒rad-f-m誘導的免疫保護是通過用rsvlong株對免疫后的小鼠進行攻毒來檢測。在rsv感染后的第5天取小鼠的肺臟進行肺病毒滴度檢測(圖9)及肺病理分析(圖10)。對數據進行分析的結果顯示，rad-f-m及rad-f均能有效地降低小鼠肺組織中的rsv病毒滴度，且rad-f-m免疫組的肺病毒數量僅為rad-f免疫組的12％(表1)。肺病理分析結果顯示：rad-f-m免疫組較rad-f免疫組能更有效地減輕小鼠肺血管周圍炎病變的嚴重程度(圖10)。

表1對肺病毒滴度檢測結果的數據分析

顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。

sequencelisting

<110>北京交通大學

<120>重組腺病毒載體表達體內自組裝呼吸道合胞病毒樣顆粒及其制備方法和應用

<130>jlc17i0053ea

<160>4

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caggagctggacaagtacaagaacgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagtctacc300

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<212>dna

<213>人工合成的2a序列

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<212>dna

<213>f-m基因序列

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