一種流感病毒株及其應用的制作方法

本發明涉及病毒領域，具體涉及一種流感病毒株及其應用。

背景技術：

流感病毒（influenzavirus）的基因組由8個單鏈rna片斷組成，編碼11種蛋白，屬于正粘病毒科流感病毒屬。流感病毒分為a、b、c三型，a、b兩型為人群中流行的常見類型，并能引起世界性大流行，但a型流感病毒感染范圍更廣，危害更大。流感病毒的8個基因組片斷按分子量由大到小順序依次為pb2、pb1、pa、ha、np、na、m和ns基因，這些基因片段編碼的11種病毒蛋白中有8個是病毒結構蛋白（ha、na、np、m1、m2、pb1、pb2和pa）；ns基因編碼的ns1和ns2為兩個非結構蛋白；兩種主要表面糖蛋白：血凝素（ha）和神經氨酸酶（na）為流感病毒主要表面抗原。根據ha和na的不同，a型流感病毒又分為不同亞型，目前己鑒定出9種na亞型和16種ha亞型。

流感病毒能夠引起嚴重的呼吸道疾病，傳染性很強，容易誘發其他嚴重并發癥。已發生多次世界性大流行，給人類生命健康帶來了極大危害。由于病毒表面蛋白ha和na易發生變異，能夠產生抗原漂移（antigenicdrift）和抗原轉換（antigenicshift）兩種突變形式，尤其近年來在世界及中國出現的h1n1和h7n9等流感病毒突變株的爆發和流行在全球一體化背景下給疾病的防控帶來了更多困難，隨著交流越來越頻繁，病毒發生重組或重配的頻率也隨之增加，對于新型突變株的預測也會更加困難，不僅給各國、各地區造成巨大經濟損失，給人們健康和生命安全帶來了極大威脅，更是加大了對疾病的防控難度。

接種疫苗是當前預防流感病毒大流行的最有效手段。現在廣泛使用的流感疫苗設計主要針對病毒的ha和na蛋白，以ha和na作為靶抗原誘導機體產生免疫保護，目前已批準應用于人體的滅活病毒疫苗是由對人類危害較大的兩種甲型流感病毒（h1n1和h3n2）和一種乙型流感病毒組成的三價滅活疫苗。雖然針對ha和na設計的滅活全病毒疫苗安全性較高、抗原組分齊全、免疫原性強，能夠抵抗同亞型流感病毒的攻擊，提供良好的免疫保護。但當前疫苗在流感病毒流行和爆發期間的防治效果并不非常理想，一方面和病毒本身的特點具有重要的關系，同時疫苗設計方法、研發策略和保護效果等也有著直接的影響。首先流感病毒的ha和na蛋白易發生抗原漂移或轉變，新疫苗的生產要隨著流行毒株的變異而及時更新，病毒疫苗株的選育費時費力，生產周期長、成本高，難以適應防控流感大流行的需要。其次滅活疫苗難以對病毒的感染產生完全充分的免疫保護，無法有效的刺激細胞免疫反應，因此選擇疫苗設計的合適靶抗原、加快候選疫苗株的高效篩選及充分提高疫苗的免疫保護效果是當前流感疫苗研究中非常關鍵和急需解決的問題。

流感病毒疫苗靶抗原選擇中，除了病毒表面ha和na蛋白外，基質蛋白m也被眾多學者廣泛報道，m蛋白由病毒rna節段7編碼，含1027個核苷酸，包括非糖基化結構蛋白m1和m2。m1和m2編碼區部分重疊，但具有不同的開放讀碼框架，m1蛋白由252個氨基酸編碼，m2蛋白編碼區包括核苷酸26～51和740～1007，編碼97個氨基酸。m1形成二聚體，結合病毒rna和囊膜，在病毒核衣殼組裝時發揮作用。m1變異率低、具有型特異性，抗原的差異是病毒分型的依據之一。m2蛋白是流感病毒膜蛋白之一，甲型流感病毒包膜上低密度表達，在感染細胞胞膜上分布廣泛。m2蛋白以同源四聚體形式存在內脂膜上，具有質子泵作用，通過控制質子通道活性調節病毒內的ph值，影響流感病毒的復制。由于m2蛋白是除ha、na外的第三種跨膜蛋白，在人類a型流感病毒中高度保守。m2蛋白作為具有交叉保護能力的“通用流感疫苗”（universalinfluenzavaccine）候選靶抗原，已成為目前流感病毒通用疫苗研究的熱點。

疫苗保護效果的提高上，減毒活疫苗（liveattenuatedinfluenzavaccine，laiv）能夠刺激體液免疫和細胞免疫，是目前流感疫苗研究的熱點和開發的主要方向之一。流感病毒減毒活疫苗與滅活疫苗相比有較多優勢。減毒活疫苗的免疫途徑與病毒自然感染相似，呼吸道復制能夠誘導有效的黏膜免疫應答，產生大量分泌型lga，誘導較強的細胞和體液免疫應答，有效控制病毒在呼吸道繁殖；可以通過滴鼻或噴鼻途徑給藥，非常方便，避免了注射途徑帶來的問題；經鼻免疫減毒疫苗所誘導細胞免疫及slga抗體對不同亞型流感病毒具有一定的交叉保護作用。

減毒活疫苗傳統的設計方法是在非生理條件下多次選擇性突變的正向遺傳學方法進行候選活疫苗篩選，僅能產生少量候選疫苗株。流感病毒冷適應減毒疫苗制備過程復雜耗時費力，技術要求高。當前利用反向遺傳技術將6個來自冷適應病毒株的基因和2個來源于當年流行病毒株的ha和na基因分別克隆到8個質粒中，共轉染哺乳動物細胞，能夠簡化冷適應減毒活疫苗制備過程，加快疫苗開發。然而反向遺傳技術仍不能進行減毒活疫苗候選株的大規模快速篩選，難以適應當前流感流行的防控需要。如果使用新的技術方法結合反向遺傳操作加快并大規模進行候選疫苗株篩選，能夠為當前流感病毒減毒活疫苗的設計提供新的研究方向，也能夠為其他具有反向遺傳操作平臺的病毒的疫苗設計和開發提供參考。

技術實現要素：

本發明的目的在于得到一種流感病毒株，并將其應用于疫苗的生產。

本發明采用如下技術方案：

一種流感病毒株，其保藏號為cgmccno.13784。保藏日期為2017年2月21日。分類命名為：a型流感病毒。保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。機構地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

其中，所述流感病毒株的m基因序列，如seqidno.1所示。

其中，所述流感病毒株在野生型流感病毒株的m2基因編碼區的第78nt后面插入了15nt的序列，如seqidno.2所示。

上述流感病毒株在制備用于預防和/或治療流感的藥物中的應用。

特別的，所述的藥物選自流感弱毒活疫苗、流感滅活疫苗、流感多肽疫苗或流感基因工程疫苗。

一種流感疫苗，所述的疫苗中含有上述流感病毒株。

進一步的，所述疫苗為流感病毒弱毒活疫苗。

一種用于制備抗體、雜交瘤細胞或抗血清的方法，根據上述的流感病毒株、所述病毒株的裂解成份、所述病毒株的基因工程蛋白或所述病毒株的多肽為免疫原進行制備。

由上述制備方法得到的制備抗體、雜交瘤細胞或抗血清。

上述流感病毒株在制備流感診斷制劑中的應用。

進一步的，所述的診斷制劑包括抗原檢測試劑盒、抗體檢測試劑盒和核酸檢測試劑盒。

進一步的，所述的抗原檢測試劑盒中的抗原選自上述流感病毒株、上述流感病毒株的裂解成份、上述流感病毒株的基因工程蛋白或上述流感病毒株的多肽；所述抗體檢測試劑盒中的抗體選自所述流感病毒株、所述流感病毒株的裂解成份、所述流感病毒株的基因工程蛋白或流感病毒株的多肽制備的單抗或多抗。

本發明的有益效果在于：所述流感病毒株安全穩定，能夠給機體提供高效廣譜的免疫保護。流感病毒株的進一步開發使用，不但能夠克服傳統流感滅活疫苗所面臨的各種問題，而且其很多方面都優于目前市售的常規弱毒活疫苗。此外，流感病毒株的開發利用，也能為其他病毒弱毒活疫苗研制提供參考。

附圖說明

圖1野生型wsn病毒和w7-791突變型病毒m2蛋白核酸和蛋白序列比較。

圖1中，(a)核酸比較；(b)蛋白質序列比較。

圖2在m2蛋白晶體結構上標記w7-791插入位置。

圖3病毒滴度測定。（用0.25moi的野生型wsn病毒和w7-791病毒感染mdck細胞來檢測不同時間點的病毒滴度）。

圖4w7-791感染對mdck細胞存活的影響。

圖5w7-791病毒免疫效果評價。

圖5中，(a，c)接種10⁶、10⁷或者10⁸tcid50的w7-791或野生型wsn病毒后小鼠體重檢測；(b，d)接種后第四和第六天病毒滴度測定；(e)w7-791、wsn或pbs接種新生balb/c小鼠后小鼠體重監測。

圖6w7-791單次免疫能夠激活對致死劑量流感病毒感染的保護。

圖6中，(a)小鼠免疫和病毒感染流程示意圖；(b-c)每組5只小鼠滴鼻免疫10⁵pfu的w7-791或者同體積pbs，免疫一個月后接種4倍mld50的wsn病毒，在病毒感染后定時檢測小鼠體重和存活狀況；(d-e)每組5只小鼠滴鼻免疫10⁵pfu的w7-791或者pbs，免疫一個月后接種4倍mld50的pr8病毒，病毒感染后定時檢測小鼠體重和存活狀況。***代表p-值<0.001。

圖7w7-791單次免疫能夠激活針對致死劑量異型流感感染的強大交叉保護作用。

圖7中，(a-b)6只小鼠被滴鼻免疫了10⁶pfuw7-791或pbs.三個星期免疫以后，小鼠被接種2mld50cam/h5。在標明的時間點檢測小鼠體重和存活情況。(c-d)小鼠被滴鼻免疫10⁵pfuw7-791(n=9)或pbs(n=6)免疫一個月以后，小鼠被接種2mld50vic/h3。在標明的時間點檢測小鼠體重和存活情況。(e-f)新生小鼠被w7-791免疫三周以后接種wsn(10⁵or10⁶tcid50)和hk68/h3(10⁶or10⁷tcid50)，觀察小鼠體重變化。***代表p-值<0.001。

圖8w7-791能夠更好的保護小鼠被異型h3病毒感染。

圖8中，c57bl/6小鼠被免疫了10⁶tcid50flumist(2016年)或者w7-791。一個月以后，這些小鼠被感染2mld50hk68h3n1。兩圖分別顯示感染以后小鼠體重變化和存活情況。

圖9w7-791能夠激活體液和細胞介導的免疫應答。

圖9中，(a)小鼠肺勻漿液中病毒滴度檢測；(b)免疫小鼠血清hai活性檢測；(c)免疫小鼠血清抗流感病毒抗體檢測；(d)微量中和實驗測定w7-791免疫小鼠血清中的中和抗體滴度；(e-f)過繼w7-791免疫小鼠的血清到未免疫小鼠體內，24小時后接種致死量的wsn和hk68/h3病毒，觀察并記錄各時間點小鼠存活率；(g-h)過繼w7-791免疫小鼠的t細胞到未免疫小鼠體內，24小時后接種致死量的wsn和hk68/h3病毒，觀察并記錄各時間點小鼠的存活率。

圖10單次w7-791免疫能夠在雪貂體內激抗活異型病毒保護作用。

圖10中，(a)滴鼻接種10⁶,10⁷或10⁸tcid50w7-791或pbs后觀察雪貂體溫變化。(b)雪貂感染w7-791或10⁶tcid50wsn后進行臨床打分。(c)hai分析顯示w7-791免疫過的雪貂提高了血清中抗w7-791抗體滴度。(d)hai分析顯示感染21天以后，血清中抗h1ha或者h3ha抗體升高.免疫或者沒有免疫過的雪貂接種10⁶tcid50wsn或hk68/h后，評價(e-f)病毒滴度和(g-h)臨床打分。

具體實施方式

為了更加清楚明了的敘述，下文中，本發明的流感病毒株采用w7-791指代。

實施例1w7-791的制備方法

mu噬菌體轉座子介導（transposon-mediatedmutagenesis）的隨機插入高密度突變技術是一種能夠在dna中隨機性插入一段15bp（5’-nnnnntgcggccgca-3’，n代表靶序列dna上5個重復堿基）的短核苷酸序列，從而產生高庫容的基因插入突變體文庫的方法。將其與病毒方向遺傳學操作技術結合就能獲得相應的病毒突變體文庫，再結合pcr擴增、毛細管電泳、熒光標記dna測序技術和片段長度多態性分析（aflp）等技術就能夠準確鑒定突變數量和插入位點。這一技術已被廣泛用于各種病毒基因組功能及病毒與宿主相互作用的研究。

本發明以流感病毒（a/wsn/1933(h1n1)）基質蛋白m為靶基因通過mu噬菌體轉座子介導的隨機插入技術建立了含m基因的高密度突變庫（突變效率大于10⁵），并通過反向遺傳操作技術獲得了m基因高密度突變的流感病毒庫。在此基礎上綜合應用體內篩選的方法和第二代測序技術從病毒突變體庫中篩選到一株致弱性突變流感病毒株w7-791。在對w7-791的致病力及免疫保護性進行全面檢測和評價后，發現w7-791是一株非常理想的流感病毒弱毒活疫苗毒株，具有能夠用于流感病毒防治的候選疫苗毒株。

實施例2w7-791的基本信息

w7-791是通過結合新興第二代高通量測序技術和疫苗體內篩選技術，從病毒m基因被高頻突變的流感病毒突變體庫中篩選得到的流感弱毒活疫苗毒株。對病毒具體遺傳物質（病毒基因組rna）的分析顯示，w7-791在其m2基因編碼區的第78nt（指病毒基因組對應的cdna）后面插入了gtcattgcggccgca這一15nt的序列（seqidno.2）。對應到蛋白質水平，w7-791病毒m2蛋白的第26個氨基酸的后面插入了rhcgri的肽段。從m2蛋白的整體結構來看，這段插入肽段是位于m2蛋白離子通道的胞漿段（如圖1和圖2所示）。

實施例3w7-791在體外細胞培養中和小鼠體內的復制動力學

（1）w7-791在細胞培養中的復制

當我們用野生型wsn（wt-wsn）和w7-791以moi為0.25感染mdck細胞，然后在不同的時間點檢測感染細胞上清中病毒的滴度，結果顯示，w7-791的復制雖然要比wt-wsn要慢，但其在mdck細胞中也表現出良好的復制能力，在復制的高峰點，w7-791能夠達到與wt-wsn基本一致的病毒滴度（如圖3所示）。

（2）w7-791在小鼠體內的復制

w7-791病毒雖然在感染小鼠后前六天能夠在小鼠體內有效地復制，在肺臟能夠檢測到較高滴度的病毒，但是在感染后6-8天時則被機體清除，此時幾乎檢測不到這些病毒的存在。但在整個感染過程中小鼠不會出現任何流感相關癥狀。

實施例4w7-791的安全性和遺傳穩定性

良好的弱毒活疫苗需要具有絕對的安全性，而且其表型和基因型需要能夠在代際之間穩定遺傳。所以，我們對弱毒疫苗候選毒株w7-791進行了系統全面的安全性和遺傳穩定性評價。（1）w7-791感染對細胞的毒性檢測：我們檢測了w7-791感染mdck細胞在不同時間點的細胞活力，我們發現w7-791對細胞的毒性明顯小于wt-wsn病毒（圖4）；（2）弱毒疫苗遺傳穩定性檢測：為了確保疫苗不會發生回復突變，發生弱毒疫苗返祖的現象，我們將w7-791病毒在mdck細胞和小鼠體內進行了一系列的傳代，對從細胞或小鼠肺臟勻漿中獲得病毒的基因序列特別是m基因的序列進行了測定，我們發現w7-791病毒m基因的突變能夠被穩定地遺傳下去，并不會發生插入突變的刪除或回復突變的現象。而且隨著傳代次數的增多，w7-791病毒的滴度也逐漸降低。這說明w7-791病毒所具有的突變和表型能夠穩定的遺傳下去。（3）疫苗的安全性評估：用不同滴度的w7-791病毒免疫6-8周齡小鼠，甚至是當每只小鼠病毒接種量高達107tcid50，我們也沒發現小鼠產生體重下降及流感癥狀。與相比，10³tcid50的野生型wsn病毒感染的小鼠則出現明顯的流感癥狀并出現體重下降。w7-791感染小鼠6天病毒載量要比野生型wsn病毒及h3亞型病毒感染小鼠肺內病毒滴度低100倍（圖5a，b，c，d）。如果觀察感染后4天小鼠的肺臟，我們發現pbs組和w7-791感染小鼠的肺臟沒有發生明顯病變，而野生型wsn病毒感染的小鼠則呈現嚴重的肺組織損傷。為了進一步確認w7-791的安全性，我們給15日齡的新生balb/c小鼠滴鼻接種不同量(10⁶,10⁷or10⁸tcid50)的w7-791或10⁴tcid50的野生型wsn病毒，小鼠體重和肺臟病變檢測結果表明，w7-791接種小鼠上未觀察到像野生型wsn病毒感染小鼠那樣的體重下降和肺部病變（圖5e）。這些結果都表明，我們篩選獲得的流感病毒突變株w7-791是只能在體外和體內呈限制性復制，對成年和新生小鼠都具有較高安全新的弱毒株。

實施例5w7-791的免疫保護能力

（1）一次免疫能夠有效保護小鼠抵御致死劑量同亞型流感病毒的感染

用w7-791免疫小鼠，在免疫后一月，用4倍mld50的親本野生型wsn病毒或同亞型的pr8病毒對小鼠進行感染。我們發現未免疫組小鼠在實驗過程中體重嚴重下降并死亡，而w7-791免疫小鼠一直保持了正常的體重，而且也未表現出任何流感癥狀（如圖6a-e）。這就說明一次免疫w7-791就能夠有效保護小鼠抵抗致死劑量同亞型流感病毒的感染。

（2）一次免疫能夠為小鼠提供交叉保護抵御不同亞型流感病毒的感染

由于流感病毒可以分為不同的亞型，各亞型病毒的之間缺乏交叉保護，傳統的滅活疫苗需要根據不同時間段流行的不同亞型病毒進行不斷的更新。所以我們進一步研究了w7-791能否為機體提供抗不同亞型流感病毒感染的交叉保護能力。為此，我們用先用10⁶pfu劑量的w7-791免疫balb/c小鼠，在免疫后3周，用2mld50量的h5n1亞型高致病性禽流感病毒a/cambodia/p0322095/05(cam/h5)對免疫組和對照組小鼠進行攻毒。結果顯示，未免疫的小鼠表型出各種流感癥狀，體重嚴重下降并死亡；而免疫組小鼠未出現顯著的體重下降，表現出對cam/h5良好的抵御能力（圖7a，b）。另外，我們也檢測了w7-791對一株不同遺傳譜系流感病毒a/victoria/3/75h3n2(vic/h3)的免疫保護作用，小鼠用10⁵pfu的w7-791免疫后4周用2mld50的vic/h3進行感染。結果顯示，w7-791免疫小鼠在攻毒后3-5天的時間段內體重只下降了約10%后逐漸恢復，而免疫對照組的小鼠都死亡（圖7c，d）。另外，我們也檢測了w7-791能否為新生小鼠提供交叉保護，從而抵御致死劑量的親本wsn病毒或其他不同亞型致死劑量流感病毒的感染。用10⁶tcid50的w7-791病毒免疫15日齡的balb/c小鼠，然后用致死劑量的wsn病毒(10⁵or10⁶tcid50/mice)或a/hongkong/68h3n1(hk68/h3)(10⁶or10⁷tcid50/mice)病毒對小鼠進行攻毒。與成年小鼠類似，所有被免疫的小鼠都得到了保護，并從體內清除了病毒（圖7e，f）。

最后，我們比較了w7-791與商品化的在2015-2016期間推薦使用的流感病毒弱毒活疫苗flumist?的免疫效果。flumist?是由四種流感弱毒株組成，包括兩個b型流感病毒弱毒株、一個h3n2(switzerland/9715293/2013)和一個h1n1(california/7/2009pandemicvirus)弱毒株。用同樣量的兩種弱毒疫苗免疫小鼠并用同樣量的hk68/h3病毒攻毒，結果顯示，w7-791的免疫保護效果要優于flumist?的免疫效果（圖8）。從上述研究可以看出，w7-791的一次接種免疫，能夠為機體提供非常有效的交叉免疫保護。

實施例6w7-791能夠同時激發有效的體液免疫和細胞免疫應答

通過流感病毒血凝抑制實驗或病毒中和實驗可以測定免疫小鼠血清中流感特異性抗體或病毒中和抗體。免疫小鼠抗體檢測結果表明，w7-791免疫的小鼠只產生了wsn病毒特異性的抗體，而沒有針對pr8病毒、hk68(h3n1)、wis(h3n2)病毒的抗體（如圖9a-c）。而將w7-791免疫小鼠的血清過繼轉移給未免疫小鼠，在用各種病毒對這些小鼠感染時，免疫小鼠血清除能提供部分針對wsn本身的保護了外，并不能保護其他病毒對小鼠的感染（圖9d-f）。這就說明體液免疫并不是w7-791病毒株所提供免疫力的唯一來源。

將w7-791免疫小鼠的t淋巴細胞過繼轉移給未免疫小鼠，然后用不同的野生型流感病毒感染小鼠，觀察所過繼t淋巴細胞可能為小鼠所能提供的免疫力，從而確定t細胞免疫在疫苗保護中所發揮的作用。我們發現，當w7-791免疫小鼠的t細胞過繼轉移給未免疫小鼠后，能夠使小鼠獲得部分廣譜的保護力，從而在一定程度上降低小鼠在受到各種流感病毒感染時的發病程度和疾病癥狀（圖9d-f）。由此說明w7-791能有效誘導機體產生保護性t細胞免疫應答，這也符合流感病毒弱毒活疫苗免疫的特點。

實施例7w7-791一次免疫能夠有效保護雪貂免受不同流感病毒的感染

雪貂目前認為是更好的流感病毒感染模型。為了進一步研究和確認w7-791作為流感病毒弱毒活疫苗的有效性，我們測試了w7-791對雪貂的免疫保護作用。首先，為了評估w7-791對雪貂的感染和致病力，我們分別用10⁶,10⁷and10⁸tcid50的w7-791疫苗株病毒感染雪貂，然后觀察病毒所引起的流感癥狀。我們發現，10⁸tcid50劑量的w7-791并未導致雪貂出現體溫升高和其他流感癥狀，這就說明w7-791對于雪貂有著與小鼠相同的安全性（圖10a，b）。然后，我們檢測了w7-791免疫雪貂體內的抗體水平，發現雪貂體內疫苗特異性抗體明顯增加（圖10c），但是血凝抑制實驗結果表明，這些抗體只能結合wsn的ha，而不能結合hk68/h3或h5n1病毒的ha（圖10d）。在雪貂用w7-791免疫后4周，我們分別用10⁶tcid50的wsn、10⁶tcid50的hk68/h3病毒進行攻毒，結果顯示，與未免疫動物相比，用10³和104.7tcid50的w7-791免疫的雪貂，攻毒后兩天雪貂體內基本檢測不到病毒(圖10e-f)。而且免疫雪貂在攻毒后所表現出的流感相關癥狀也明顯較輕(圖10g-h)。

根據上述的實施例對本發明作了詳細描述。需說明的是，以上的實施例僅為了舉例說明發明而已。在不偏離本發明的精神和實質的前提下，本領域技術人員可以設計出本發明的多種替換方案和改進方案，其均應被理解為在本發明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>蘇州系統醫學研究所

<120>一種流感病毒株及其應用

<130>2017

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