本申請是以下申請的分案申請：申請日2010年2月24日，申請號201080010073.9，發明名稱“通過選擇性酶促酯交換生產蓖麻油酸酯的方法”。一般說來，本發明涉及油酯化學(oleochemistry)領域。更具體地說，本發明涉及從純的或混合的植物油，特別地蓖麻油，制備蓖麻油酸酯的方法，所述方法至少包括酶促酯交換的一個步驟，該步驟在輕質醇的存在下和通過類型選擇性(typoselective)脂肪酶進行，并且產生富集蓖麻油酸酯的級分。
背景技術：
：：脂肪酸酯通常是在催化劑，特別地酸或堿催化劑的存在下通過精制植物油的化學酯交換獲得的。產生脂肪酸酯的這種路線使以良好的收率獲得所述酯成為可能；然而它具有許多缺點，特別地與需要除去所用的催化劑，難以回收甘油和高能量消耗有關的缺點。這類方法仍然是費力的，因為它包括許多物理化學轉化步驟，這導致由此產生的脂肪酸酯的高成本。此外，對于脂肪酸的類型來說，所用的酸或堿催化劑不是選擇性的，并且將全部脂肪酸鏈酯交換，產生酯的混合物。然而，將具有較接近的物理性能的各種脂肪酸酯分離是非常困難的。另外，這類方法沒有使從通過酯交換反應獲得的脂肪酸酯的混合物選擇性提取官能化的、特別地羥基化的脂肪酸酯成為可能。因此令人期望的是獲得富集羥基化的脂肪酸酯的級分，其包含例如蓖麻油酸甲酯(或12-羥基-順-9-十八烯酸甲酯)，因為這樣的級分是在生產11-氨基十一烷酸(rilsan?11的組成單體，其是由申請人開發的具有優異的物理性能的聚酰胺)中的起點。在生產11-氨基十一烷酸期間，蓖麻油酸甲酯經受氣相熱裂化。為此，它必須包含最低量的甘油酯，即甘油三、二和單酯，因為這些產品非常難以汽化，并且常常在汽化前分解，這導致裂化選擇性降低。同樣，蓖麻油酸甲酯必須包含最低量的蓖麻油酸，其同樣難以汽化。根據上述內容，申請人本身設定了發現一種用于含蓖麻油酸的植物油的酯交換的方法的目的，該方法解決了已知酯交換方法的上述缺點并且使獲得富集蓖麻油酸酯的級分成為可能。在脂肪酶的存在下酯化或水解植物油中所含的甘油三酯的方法是眾所周知的。這些酶具有若干優點：它們不需要輔助因素，常常是市售可得的并且具有高活性和高選擇性，甚至是在非水性體系中。甘油的酯或甘油三酯是它們的天然底物。這些脂肪酶中的一些顯示出位置特異性（spécificitédeposition）(或區域選擇性（régioséléctivité）)，這使得它們在中心位置(sn-2)和甘油的兩個外部位置(sn-1和sn-3)之間區分。然而，這種特異性可以在存在于蓖麻油中的蓖麻油酸(ar)的情況下僅僅以收率損失為代價被利用，因為后者主要由ar殘基構成(85至90wt%)，存在的其它脂肪酸殘基特別地是油酸，亞油酸，硬脂酸，棕櫚酸和亞麻酸的那些。蓖麻油酸優選地占據外部位置，但也可能在內部位置中被發現。此外，文獻沒有描述在酯交換反應中對ar特異性的任何脂肪酶。甚至從蓖麻油植物提取的脂肪酶，在水解反應期間其顯示出對于ar的優先性，沒有顯示出與此相關的類型選擇性(typoselectivity)。其它脂肪酶相對于脂肪酸的性質顯示出類型選擇性(typoselectivity)或特異性。因此已知在酯化或水解反應中，從白地霉(geotrichumcandidum)提取的脂肪酶，類酵母真菌(ayeast-likefungus)，顯示出對順-9單不飽和的脂肪酸的強特異性。文件de4124248描述了從白地霉提取的胞外脂肪酶用于特別地斷開油酸酯(ch3(ch2)7ch=ch(ch2)7cooh)的用途。文件us5633151描述了相同的脂肪酶用于特別地斷開芥酸酯(ch3(ch2)7ch=ch(ch2)11cooh)的用途。fogliat.a.等的出版物,eur.jlipidsci.technol.102(2000):612-617描述了用于測定某些脂肪酶對植物來源的脂肪酸的選擇性的測試結果。表1中所示的結果表明在借助于商業固定的脂肪酶(commercialimmobilizedlipase)的在30℃進行1至4小時的蓖麻油部分水解反應期間，白地霉脂肪酶是對蓖麻油酸(以下由ar表示)有認別性的。此外，表2中所示的結果表明在游離脂肪酸與1-丁醇的混合物的酯化反應期間這種酶也對ar具有認別性。在白地霉的存在下的酯化，在24小時的反應后，導致由12%的脂肪酸丁酯和88%的游離脂肪酸組成的混合物(按質量計)，ar占所述游離脂肪酸的94.5%。所述混合物因此包含大約83%的ar。在水解反應期間相對于底物的酶的特定性能沒有使在酯交換或酯化反應期間預見其對相同底物的性能成為可能。脂肪酶的特異性在彼此反應類型之間不同。vayssel.等的出版物,enzymemicrob.technol.31(2002):648-655通過表1和2中所示的結果顯示，在水解，酯交換和酯化反應期間相同脂肪酶可以分別地對相同脂肪酸酯或游離脂肪酸具有不同的性能。技術實現要素：申請人已經進行研究，目的在于確定在蓖麻油酯交換反應期間白地霉脂肪酶對存在于蓖麻油中的脂肪酸，特別地蓖麻油酸(ch3(ch2)5ch(oh)ch2ch=ch(ch2)7cooh)的作用。這些研究已經表明，令人驚訝地，所述脂肪酶在輕質醇的存在下在酯交換反應中對ar具有認別性。本發明的目標是提供一種酯交換的方法，其允許蓖麻油酸酯的生物選擇性提取，并且因此從蓖麻油或任何其它含ar殘基的油中產生富集這種酯(包含多于85wt%的酯)的級分。為此，根據第一方面，本發明涉及一種用于從含蓖麻油酸的植物油，特別地蓖麻油中生產蓖麻油酸酯的方法，包括以下步驟：i)在輕質醇(alcoolléger)和從白地霉提取的脂肪酶的存在下進行的第一酯交換反應，產生含ar甘油單、二和三酯、非ar的脂肪酸的酯、和醇的混合物m；ii)將所述混合物m分離為至少兩種級分的轉化步驟，包括富含ar甘油酯的級分a和富含非ar的脂肪酸的酯的級分b；iii)將所述ar甘油酯轉化為ar酯的步驟，形成富集ar酯的級分c和富集醇的級分。有利地，所述脂肪酶選擇性地斷開涉及非ar的脂肪酸，特別地油酸和亞油酸的酯鍵，并且幾乎留下完整的涉及ar殘基的酰基鍵。實施根據本發明的方法使獲得特別富集蓖麻油酸酯的級分c成為可能。因此，根據第二方面，本發明涉及富集ar酯的級分，當原材料是純蓖麻油時，其含至少91wt%，并且優選地94至98wt%，的蓖麻油酸甲酯。這樣的級分非常有利地適于用作合成中間化學產品如11-氨基十一烷酸的原材料。根據另一實施方案，實施根據本發明的方法使獲得富集蓖麻油酸酯的級分c成為可能。因此，根據第三方面，當原材料是具有低蓖麻油酸含量的油時，如下文限定的，根據本發明的方法使獲得含至少75wt%并且優選地82至91wt%的蓖麻油酸甲酯的富集ar酯的級分成為可能。這樣的級分特別適合用作合成中間化學產品如11-氨基十一烷酸的原材料，因為它然后具有相當于常規蓖麻油的蓖麻油酸含量。附圖說明其它特性和優點將從隨后的根據本發明生產蓖麻油酸酯的方法的詳細說明和所附的圖1至10顯露出來，圖1至10是：-圖1舉例說明了以游離形式和各種商用脂肪酶的形式用白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶獲得的在甲醇的存在下在酯交換反應中乙酯轉化至甲酯的轉化率。-圖2顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的酯交換反應期間在蓖麻油中的最初以甘油酯的形式的蓖麻油酰基(ricinoleoyl)，亞油酰基(linoleoyl)和油酰基(oleoyl)基團轉化為甲酯或相應脂肪酸的動力學；-圖3舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的蓖麻油的酯交換期間偏甘油酯（partialglycerides）級分的ar濃度的變化；-圖4顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w(按重量計)蓖麻油/三亞油精（castoroil/trilinolein）混合物的酯交換反應期間亞油酰基(linoleoyl)基團和酰基基團轉化為甲酯的動力學的比較；-圖5舉例說明了[ar/(ar+al)]和[mear/(mear+meal)]比例的變化，其代表了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換反應期間白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團的識別力和其對于亞油酰基(linoleoyl)基團的選擇性；-圖6表示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換期間偏甘油酯級分中ar濃度的變化；-圖7舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換反應期間亞油酰基(linoleoyl)基團和酰基基團轉化為甲酯的動力學的比較；-圖8舉例說明了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的變化，其代表了在甲醇的存在下90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換反應期間白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團的識別力和其對于亞油酰基(linoleoyl)基團的選擇性；-圖9顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換期間偏甘油酯級分的ar濃度的變化；-圖10顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的固定的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換反應期間最初以甘油酯的形式的蓖麻油酰基(ricinoleoyl)和亞油酰基(linoleoyl)基團轉化為甲酯或相應的脂肪酸的動力學。具體實施方式本發明涉及與化學或酶促酯交換的方法聯系的含蓖麻油酸（acidericinoléique）的植物油的酶促酯交換的方法，以便產生富集蓖麻油酸酯的級分。特征上，該方法使用了一種酶，其顯示出對蓖麻油酸的"抗"-選擇性(也稱為識別力（discrimination）)，即其優選地對鏈而不是蓖麻油酸進行酯交換。這種效果特別地顯示在非蓖麻油的蓖麻油酸的兩個主要的脂肪酸上：油酸和亞油酸。本發明的酶促酯交換的方法特別合適于"具有低含量"的蓖麻油酸，即包含小于82wt%的蓖麻油酸的油。這種情況是具有低蓖麻油酸含量的蓖麻油的情況，或者包括蓖麻油及來源于至少一種其它產油的（oleaginous）、產油的/產蛋白的（oleaginous/protein-producing）或產蛋白（protein-producing）的植物的其他植物油的混合物的情況，所述混合物包含至少10wt%的蓖麻油酸，或者來源于單獨地產生蓖麻油酸的基因修飾植物或來源于產生蓖麻油酸的基因修飾植物與任選地被基因修飾的產油的植物的混合物并且包含至少10wt%的蓖麻油酸的油的情況。參考pilarrijas-barros等在cropscience44(2004):76-80,and45(2005):157-162中的出版物，表述"具有低蓖麻油酸含量的蓖麻油"還被理解為是指來源于突變株如ole-1的油，其描述于這些出版物中并且產生含約10%的蓖麻油酸的油。參考k.m.hosamani在chemistryandphysicsoflipids,152(2008)9-12中的文章，表述"具有低蓖麻油酸含量的油"還被理解為是指橡膠樹(heveabrasiliensis)和棉葉麻風樹(jatrophagosypiifolia)的油，其中已經發現蓖麻油酸的含量為大約18%。參考同一作者在phytochemistry,vol.37,no.6,pp.1621-1624，1994中發表的另一篇文章，所述表述還被理解為是指斯里蘭卡毛束草(trichodesmazeylanicum)的油，其看起來包含22%的蓖麻油酸。也可提及非洲黃果藤黃木(mammeaafricana)，其在它的果實的籽中包含20%的蓖麻油酸，以及蓮子草(alternantheratriandra)syn.a.無柄籽(sessilisseed)的油，其包含大約22%的蓖麻油酸(k.m.hosamanietal.,industrialcropsandproducts,2004,19(2),133-136)。因此，表述"含蓖麻油酸的植物油"，在本發明的范圍中，覆蓋了蓖麻油以及全部這些上述的油和油混合物。現在已經發現從白地霉微生物提取的胞外的脂肪酶在輕質醇的存在下進行的含蓖麻油酸的植物油的酯交換反應期間相對于非蓖麻油酸的在順-9位單不飽和的脂肪酸有選擇性。根據第一方面，本發明的主題是從含蓖麻油酸的植物油，特別地蓖麻油產生蓖麻油酸酯的方法，包括以下步驟：i)在輕質醇和從白地霉菌株提取的類型選擇性(typoselective)脂肪酶的存在下進行的第一酶促酯交換反應，產生含ar甘油單、二和三酯、非ar的脂肪酸的酯、和醇的混合物m；ii)將所述混合物m分離為至少兩種級分的步驟，包括富含ar甘油酯的級分a，和富含非ar的脂肪酸的酯的級分b；iii)將級分a中所含的所述ar甘油酯轉化為ar酯的步驟，以便形成富集ar酯的級分c和富集醇的級分。有利地，在步驟i)期間，酯交換反應的持續時間是至多1小時，優選地至多30分鐘，其相應于在混合物m的偏甘油酯級分中，相對于其它脂肪酸的至少90wt%的ar的含量。根據第一實施方案，酯交換方法的步驟iii)由以下構成：在堿性催化劑如氫氧化鈉的存在下在包括ar甘油酯和醇的相上進行的化學酯交換反應，以便獲得富集ar酯的所述級分c。根據第二種實施方案，步驟iii)由以下構成：在輕質醇和例如選自南極假絲酵母b（candidaantarcticab)(特別地固定形式的n.435?，novonordisk)，米黑根毛霉(rhizomucormiehei)(特別地固定形式的rm?im，novozymes)，thermomyceslanuginosa(特別地固定形式的tl?im，novozymes)，洋蔥假單胞菌（pseudomonascepacia），黑曲霉（aspergillusniger），米根霉（rhizopusoryzae），少根根霉（rhizopusarrhizu），皺褶假絲酵母（candidarugosa），爪哇毛霉(mucorjavanicus)，豬胰脂肪酶（porcinepancreaticlipase）和產生富集ar酯的所述級分c的任何其它脂肪酶的脂肪酶的存在下進行的第二酶促酯交換反應。所用的輕質醇是低級脂族醇如甲醇，乙醇，異丙醇和正丙醇，和優選地是甲醇。在步驟i)中的底物/醇比例為1:4.5至1:0.75，在一次或多次添加中添加所述醇。假定蓖麻油的組成(見實施例1)，非ar的脂肪酸的最主要的酯是油酸酯和亞油酸酯。分離蓖麻油酸甘油酯/油酸的甲酯/亞油酸的甲酯的混合物的步驟ii)包括至少一種選自以下的操作：蒸餾，離心，潷析，用非極性有機溶劑如己烷或石油醚的液-液萃取，和通過選擇吸附的色譜分離。白地霉是dipodascaceae科的endomycete，其具有接近于絲狀真菌的形態。其野生廣泛分布并且在許多食物，包括乳制品中被發現。它也是人和動物中的消化道的腐生菌。表述"從白地霉提取的脂肪酶"意圖在本文中是指根據例如在文件de4124248中描述的規程從這種酵母中提取的胞外脂肪酶的粗制混合物，和通過異種表達編碼這些脂肪酶之一的白地霉基因獲得的酶。以提供良好的收率以便在工業規模上使用為目的，這種酶優選地以固定(immobilisée)形式用于本發明的范圍中。在酯交換階段期間使用白地霉的脂肪酶的條件是以下的：-溫度20至40℃，優選地大約30℃；-脂肪酶/底物比例大于或等于0.5%；-充分攪拌以便良好的均化間歇類型的反應介質，或者足夠的流速以便最佳的接觸時間(催化床)；-大氣壓或更高，這取決于所進行的方法。在低溫和接近于大氣壓力的壓力下進行該方法。停留時間也是受限制的，因為不意圖將全部脂肪族鏈轉化，而僅僅是存在的雜質(非蓖麻油酸的脂肪酸)。在一個實施方案變化中，含源于根據本發明方法的蓖麻油酸酯的級分c可以有利地直接用于合成11-氨基十一烷酸。當蓖麻油酸酯不是足夠純的，另外的提純步驟可能是必需的，然后使其經受熱解反應。這樣獲得的11-氨基十一烷酸主要地意圖于根據以下系列反應通過聚酰胺11或rilsan?11的縮合來合成：-裂解或裂化蓖麻油酸酯，特別地甲酯，產生庚醛和十一碳烯酸甲酯；-十一碳烯酸甲酯的水解，產生十一烯酸；-十一烯酸的溴氫化，產生11-溴十一烷酸，和-11-溴十一烷酸的胺化，產生11-氨基十一烷酸。根據一種實施方案變化，富集非ar的脂肪酸的酯的級分b經受一系列的化學和/或物理反應，產生生物柴油。在這種情況下，脂肪酸酯可以通過各種另外的分離技術經受分離反應，例如通過蒸餾，包括分子蒸餾，通過液-液萃取(在甲醇/己烷介質中的逆流色譜)或通過模擬移動床色譜分離。當閱讀以下非限制性示范性實施方案后，本發明將更清楚地被理解。1.蓖麻油的脂肪酸組成分析來源于印度的蓖麻油的樣品其的脂肪酸組成。為該測定，根據包括兩個相繼步驟的程序，將油轉化為甲酯：堿性甲醇醇解，隨后酸性酯化。在第一步驟中，甘油酯(甘油單、二和三酯)通過甲醇鈉的作用，被轉化為甲酯，游離脂肪酸，其可能存在，被轉化為皂。在第二步驟期間，添加乙酰氯的甲醇溶液導致這些皂轉化為甲酯。然后通過氣相色譜法(agilent6890系列gc，裝備有火焰電離檢測器-fid)分析這樣獲得的甲酯。在supelcowax10柱(agilenttechnologies，30m×0.32mm×0.25μm；載體氣體：1ml/分鐘的氦；最初的烘箱溫度150℃，5℃/分鐘的溫度程序直至225℃并且在這一溫度保持7分鐘)上進行分離。通過這種技術識別的主要的脂肪酸是：-蓖麻油酸86.0wt%；-亞油酸5.3wt%；-油酸4.1wt%；-硬脂酸1.5wt%；-棕櫚酸1.3wt%。2.生產白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶使用文件de4124248中描述的操作規程獲得來源于這種酵母的胞外脂肪酶的粗制提取物。此外，利用重組技術通過巴斯德畢赤氏酵母(yeastpichiapastoris)的發酵也獲得脂肪酶。因此，在30小時的發酵后，收集含胞外脂肪酶的發酵上清液。在這個階段，上清液特征在于蛋白質濃度為2.46mg/ml并且對油酸乙酯測量的特定的水解活性(30℃)為90u/毫升(其中u=1μmol的水解的乙酯/每分鐘，在30℃，ph6.5)。然后，上清液經受一系列過濾，目的在于使其澄清并且將其濃縮，而沒有影響脂肪酶的特定活性，其包含：i)膜微量過濾(中止閾值5μm然后0.45μm)，膜超濾，目的在于將上清液濃縮14倍，然后用50mm磷酸鈉緩沖溶液(ph6.5)滲濾。所獲得的濃縮物的蛋白質含量為18mg/ml，對于油酸乙酯的特定活性為522u/毫升，對于橄欖油的特定活性為900u/毫升(30℃)。脂肪酶的固定從白地霉提取的脂肪酶的混合物(或根據上述規程在發酵后獲得的濃縮物)被固定在選自以下的載體上：-微孔聚丙烯，例如accurel?mp1000型，由accurelsystems,membarnagmbh,obernburg,germany制造；-deae纖維素；-celite(硅藻土)。舉例來說，將白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶固定在accurel?mp1000上包括，在第一步驟中，物理吸附，接著在第二步驟中在戊二醛的存在下交聯。3.在甲醇的存在下在酯交換反應中在模擬底物（modèle）上白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性和特異性在甲醇的存在下在酯交換反應中白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性可與商品化酶(南極假絲酵母b，n?435，novonordisk；米根霉，fap15?,amano；r.mieihei，lipozymerl-im，novozymes；tl-im，lipozyme，novozymes)(c.antarcticab,n?435,novonordisk;r.oryzae,fap15?,amano;r.mieihei,lipozymerl-im,novozymes;tl-im,lipozyme,novozymes)的活性相比。油酸、亞油酸和蓖麻油酸的乙酯(油酸乙酯、亞油酸乙酯、蓖麻酸乙酯（ricinoléated’ethyle）)的等摩爾混合物與酶(脂肪酶/底物重量比：5%)接觸。以1.5:1的甲醇/底物摩爾比添加甲醇，并且然后在30℃培養混合物24小時。根據實施例1中詳述的方法，通過氣相色譜法量化所形成的甲酯。在附圖1中給出了所獲得的結果，其舉例說明用白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶和各種商品化脂肪酶獲得的，在甲醇的存在下在酯交換反應中乙酯至甲酯的轉化率(24小時，30℃，3份相同樣品，脂肪酶/底物比例=1.5%w/w，甲醇/底物摩爾比=1.5:1)。無論酶如何，對于油酸乙酯和亞油酸乙酯來說，獲得了40%至50%的轉化率。對于蓖麻酸乙酯，僅僅白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶產生了小于40%的轉化，值為2%至5%。這些結果表明白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對油酰基和亞油酰基(linolenoyl)基團的作用的非常強的選擇性，并且因此，對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團的識別力的非常強的選擇性。4.在甲醇的存在下在酯交換反應中在蓖麻油上白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性和特異性在分子篩(3埃，perlform，直徑2mm)的存在下，其數量為10%w/w的底物(蓖麻油)，在大氣壓力，在30℃，進行甲醇醇解反應。將白地霉類型選擇性(typoselective)脂肪酶濃縮物蛋白/底物比例調節到1.5%w/w并且在反應的0、2和4小時在3次順序添加中建立4.5:1的甲醇/蓖麻油甘油三酯摩爾比。通過渦旋(10秒)均化整個反應介質。在各個時間，從反應介質中取出等分試樣，并且在丙酮/乙腈(1:1v/v)中稀釋，然后通過以下所述的色譜技術進行分析。有可能通過薄層色譜法(tlc)和高效液相色譜法(hplc)表征酯交換反應動力學。更具體地說，tlc使顯現所形成的脂質實體的類型成為可能，同時在標定曲線確定后通過hplc可以量化這些實體中的一些。通過將以10mg/ml溶解在丙酮/乙腈(50/50v/v)中的樣品沉積到預涂有二氧化硅的玻璃板(100×200mm，sig60，merck)上，進行tlc分離。用自動沉積設備(linomativ,camag)進行沉積(10μl)。在用由己烷/二乙醚/乙酸(40:60:1v/v)構成的流動相洗脫后，通過用硫酸銅的飽和溶液和磷酸(50:50v/v)噴霧和培養(10分鐘，180℃)顯示所存在的實體。通過與標準化合物的比較，確定以下表i中給出的保持系數。脂質種類保持系數*單蓖麻油酸甘油酯0.02非羥基化的甘油單酯0.07二蓖麻油酸甘油酯0.13單羥基化的甘油二酯(1,2)0.17單羥基化的甘油二酯(1,3)0.22三蓖麻精(rrr)0.36蓖麻油酸(ar)0.42二羥基化的甘油三酯0.47蓖麻醇酸甲酯0.58非羥基化的脂肪酸0.65單羥基化的甘油三酯0.69其它酯0.95*保持系數=實體遷移距離/溶劑前沿遷移距離tablei。使用基于泵(p1000xr)、樣品轉換器(as1000)和光散射檢測器(alltech500elsd)的自動系統(thermo-finningan,courtaboeuf,farnce)進行通過hplc的產品分離。使用串聯安裝的兩個interchimc18柱(5μm;4.6×250mm,modulocartqs,lichrosphere500ds2)用于分離。根據丙酮/乙腈/甲酸(70:30:1，v/v；x)和氯仿(y)的混合物的梯度洗脫樣品(1mg/ml)。根據以下線性梯度以1ml/min的流速進行洗脫：0分鐘100%x，30分鐘90%x，50分鐘90%x，在5分鐘的過程中回到初始條件并且保持這些條件另外的15分鐘。在以下表ii中給出了根據上述規程通過hplc分析的主要實體的停留時間。在甲醇的存在下在酯交換期間獲得的產品基本上是蓖麻油酸(ar)，亞油酸(al)，油酸(ao)和相應甲酯，蓖麻醇酸甲酯(mear)，亞油酸甲酸(meal)和油酸甲酯(meao)。所分析的實體停留時間(分鐘)蓖麻油酸7.2蓖麻醇酸甲酯8.1單蓖麻油酸甘油酯9.3亞油酸9.5二蓖麻油酸甘油酯11.5亞油酸甲酸11.8油酸12.3油酸甲酯14.6三蓖麻精19.8三亞油精22.6表ii。在圖2中舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的酯交換反應期間在蓖麻油中的最初以甘油酯的形式存在的蓖麻油酰基(ricpresentinoleoyl)，亞油酰基(lpresentinoleoyl)和油酰基基團轉化為甲酯或相應脂肪酸的動力學(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小時的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比=4.5:1)。蓖麻油酰基(ricinoleoyl)，亞油酰基(linoleoyl)和油酰基基團(最初在蓖麻油中酯化)轉化為脂肪酸和甲酯導致偏甘油酯級分的出現，其中ar含量在反應0.5至2小時的時候處于其最大值。附圖3舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的蓖麻油的酯交換期間偏甘油酯級分的ar濃度的變化(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小時的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比=4.5:1)。5.在甲醇的存在下在酯交換反應中在混合物中的蓖麻油上白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性和特異性在以下全部實施例中，在類似于實施例3中所述的條件下，進行甲醇醇解反應。5.1蓖麻油/三亞油精50/50w/w附圖4顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進行的酯交換反應期間亞油酰基(linoleoyl)基團和酰基基團轉化為甲酯的動力學的比較(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小時的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。在6小時的反應中達到了最初在油混合物中酯化的亞油酰基(linoleoyl)基團的80%的轉化率。在反應產品中蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團與全部蓖麻油酰基(ricinoleoyl)和亞油酰基(linoleoyl)基團的比例表征了脂肪酶對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團的識別力，并且相反地，其對亞油酰基(linoleoyl)基團的選擇性。與這種甲醇醇解反應平行，由脂肪酶濃縮物提供的水分子導致通過水解反應形成游離脂肪酸(ar，al)。這種識別力在甲醇醇解反應中大于在水解反應中，如附圖5中所表示的。該圖舉例說明了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的變化，其代表了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進行的酯交換反應期間白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團的識別力和其對于亞油酰基(linoleoyl)基團的選擇性(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。最后，這種識別力導致在6小時的反應后將最初的35%的ar濃度(在起始油混合物中以甘油酯的形式的ar)富集為反應介質的偏甘油酯級分中的多于77%，如在附圖6中所表示的，其舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換期間偏甘油酯級分的ar濃度的變化(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。5.2蓖麻油/三亞油精10/90w/w比較在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的在90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進行的酯交換反應期間亞油酰基(linoleoyl)基團和酰基基團轉化為甲酯的動力學(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)，并且所獲得的結果示于附圖7中。圖8顯示了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的變化，其代表了在甲醇的存在下在90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進行的酯交換反應期間白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團的識別力和其對于亞油酰基(linoleoyl)基團的選擇性(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。圖9顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換期間偏甘油酯級分的ar濃度的變化(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。5.3蓖麻油/亞麻子油50/50w/w以與蓖麻油的混合物形式使用的亞麻子油由主要地包括亞油酰基(linolenoyl)(45%)，亞油酰基(linoleoyl)(25%)和油酰基(19%)基團的甘油酯組成。在類似于實施例3中所述的反應條件下，在2小時后達到17%的這些酰基至甲酯的總轉化率。于是，甲酯級分中蓖麻醇酸甲酯(mear)的水平是6%。這些結果表明白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對亞油酰基(linolenoyl)基團的選擇性類似于對亞油酰基(linoleoyl)基團的選擇性。5.4蓖麻油/亞麻子油10/90w/w在類似于實施例3中所述的反應條件下，在2小時后達到12%的這些酰基至甲酯的總轉化率。然后，甲酯級分中蓖麻醇酸甲酯(mear)的水平是2%。6.在甲醇的存在下在酯交換反應中在混合物中的蓖麻油上白地霉的固定類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性和特異性在甲醇的存在下在50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物上在酯交換反應中(30℃，3份相同樣品，酶/底物比例為1.5%w/w，甲醇/甘油三酯摩爾比為1.5:1)測試固定在accurel?mp1000載體上的白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶。圖10舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的固定的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進行的酯交換反應期間(30℃，3份相同樣品，酶/底物比例為1.5%w/w，甲醇/甘油三酯摩爾比為1.5:1)最初以甘油酯的形式的蓖麻油酰基(ricinoleoyl)和亞油酰基(linoleoyl)基團轉化為甲酯或相應的脂肪酸的動力學。這些結果表明固定的脂肪酶保持了其對亞油酰基(linoleoyl)基團的非常強的選擇性，盡管它的活性顯著地下降。固定的酶的水合(aw=0.96)導致水解反應并且與甲酯一起出現游離脂肪酸。當前第1頁12當前第1頁12