本發明涉及生物醫學光學與分子影像學
技術領域：
：，具體而言，涉及一種紅色熒光蛋白、融合蛋白、分離的核酸、載體和應用。
背景技術：
：：熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是供體熒光團在其激發態發生非輻射性的能量轉移，將能量轉給臨近的受體熒光團，因此導致受體熒光團發出熒光。由于FRET對供受體偶極子在1-10nm間的距離高度敏感，常常被作為一種高效的光學分子尺，廣泛的用于監測能夠產生分子間距離變化的生化反應，如研究生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測等。相比與其他生化監測方法如酵母雙雜交、免疫沉淀等，FRET的優勢為可在活細胞生理條件下對細胞生化反應進行實時的動態研究以及空間定位。大多數基于FRET的能量供受體對的熒光蛋白是青色熒光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)和黃色熒光蛋白(Yellowfluorescentprotein,YFP)。然而，這樣的能量供受體對存在著一些缺陷。首先，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白可發生可逆性的光漂白；黃色熒光蛋白可光轉化為青色熒光蛋白；青色熒光蛋白在黃色熒光蛋白的激發光波長下也可被激發；紫色的青色熒光蛋白激發光不但具有光毒性，而且可以同時激發生物體中的黃素蛋白，產生自發熒光的現象；其次，以青色和黃色熒光蛋白作為能量供受體對的FRET產生的變化小，這給監測細胞中一些細微或瞬時變化的生化反應增加了難度。除此以外，一些文獻報道過的，可替代青色和黃色熒光蛋白的供受體對，如供體熒光蛋白：綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)，黃色熒光蛋白；以及受體熒光蛋白：橘色熒光蛋白(Orangefluorescentprotein,OFP)，紅色熒光蛋白(Redfluorescentprotein,RFP)，也由于蛋白成熟率低，光漂白快等缺陷，導致FRET效果不理想。有鑒于此，特提出本發明。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種紅色熒光蛋白，該紅色熒光蛋白具有成熟率高的特點，可作為熒光共振能量轉移的受體或供體，提高FRET效應。本發明的再一目的在于提供一種融合蛋白，該融合蛋白含有上述的紅色熒光蛋白。本發明的另一目的在于提供一種分離的核酸，用于編碼上述的紅色熒光蛋白。本發明的另一目的在于提供一種載體，其含有上述的核酸。本發明的另一目的在于提供含有上述載體的重組細胞。本發明的另一目的在于提供上述的紅色熒光蛋白在作為熒光共振能量轉移受體或供體中的應用。本發明的另一目的在于提供一種用于熒光共振能量轉移成像的蛋白對，該蛋白對具有較高的FRET效應。本發明的另一目的在于提供上述的紅色熒光蛋白在蛋白標記與成像中的應用。本發明是這樣實現的：一種紅色熒光蛋白，其相對于熒光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突變位點：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一個或多個的組合。一種融合蛋白，其含有上述的紅色熒光蛋白。一種分離的核酸，其編碼上述的紅色熒光蛋白。一種載體，其含有上述的核酸。含有上述載體的重組細胞。上述的紅色熒光蛋白在作為熒光共振能量轉移受體或供體中的應用。一種用于熒光共振能量轉移成像的蛋白對，該蛋白對包括上述的紅色熒光蛋白，該紅色熒光蛋白作為熒光共振能量轉移受體或熒光共振能量轉移供體。上述的紅色熒光蛋白在蛋白標記與成像中的應用。與現有技術相比，本發明提供的一種紅色熒光蛋白、融合蛋白、分離的核酸、載體和應用的有益效果是：本發明提供的紅色熒光蛋白，其相對于現有的熒光蛋白mRuby3包括N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一個或多個的組合的氨基酸突變位點。其中，第8位的天冬酰胺突變為谷氨酸，氨基酸結構變大，且谷氨酸側鏈上的羧基更容易和第33位的天冬酰胺的氨基形成氫鍵；第10位的精氨酸突變為脯氨酸，以及第114位的谷氨酸突變為纈氨酸，有利于第10位非極性的脯氨酸與第114位非極性纈氨酸形成疏水鍵；第116位的纈氨酸突變為異亮氨酸，使得氨基酸側鏈變長，配合第114位的谷氨酸突變為纈氨酸，有利于第116位擁有較長側鏈的異亮氨酸與第114位的纈氨酸形成疏水鍵；第177位的極性蘇氨酸突變為酸性的谷氨酸，配合第179位的堿性精氨酸突變為擁有較短側鏈的堿性賴氨酸，有利于第177位點與第179位點形成穩定的離子鍵。通過上述氨基酸位點的突變，有利于蛋白形成時的折疊，進而使得熒光蛋白成熟率更高，其相對現有的熒光蛋白mRuby3，成熟率提高了28％。因此，本發明的紅色熒光蛋白能夠用作熒光共振能量轉移受體或供體，具有較高的FRET效應；或者是用于蛋白標記與成像或活體成像用于監測細胞內基因表達、蛋白定位、蛋白間相互作用、蛋白活性等領域中，具有非常廣闊的應用前景。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發明實施例2提供的紅色熒光蛋白與熒光蛋白mRuby3的氨基酸序列對比結果；圖2為本發明實施例2提供的紅色熒光蛋白的HPLC檢測結果。具體實施方式為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。下面對本發明實施例的一種紅色熒光蛋白、融合蛋白、分離的核酸、載體和應用進行具體說明。熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是距離很近的兩個熒光分子間產生的一種能量轉移現象。當供體熒光分子的發射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內，由于偶極的相互作用，就會發生一種非放射性的能量轉移。能量傳遞的效率和供體的發射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等有關。和傳統的FRET的能量供受體對熒光蛋白，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白相比。綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白所組成的FRET的能量供受體對有著更多的優勢。首先，紅，綠熒光蛋白的光譜分的更開；其次，光毒性更小；第三自發熒光性若弱；第四，能夠穿透組織更深層。目前，在已報道過的紅色熒光蛋白中，紅色熒光蛋白eqFP611中的一個單體突變蛋白，mRuby及其衍生物的性能最佳，Kredel等人在2009年報道了這個蛋白的最大激發峰和發射峰，分別為558nm和605nm，大斯托克斯位移為47nm，與同被定位在內質網中的EGFP(增強型綠色熒光蛋白)相比，mRuby的亮度是EGFP的十倍。2011年，Lam等將mRuby進一步工程改造為mRuby2，成為當時最亮的紅色熒光蛋白。與改造后的最亮的熒光蛋白Clover(綠色熒光蛋白)組成FRET能量供受體對，與已有的FRET能量供受體對相比，Clover，mRuby2有著更好的動態范圍以及光穩定性，這大大提高了在神經生物學研究中，對于單個動作電位監測的準確性。Bajar等人在2016年通過基因工程改造技術，將mRuby2改造為亮度提高了35％，光穩定性提高200％的mRuby3，在哺乳動物細胞實驗中，mRuby3的熒光強度高于其他珊瑚紅色熒光蛋白衍生物，成為迄今為止，亮度最強，穩定性最好的紅色熒光蛋白，同時mRuby3與綠色熒光蛋白組成的FRET能量供受體對也具有很高的FRET效應。盡管mRuby3有以上優勢，但mRuby3蛋白的成熟率并不理想，這將會直接影響mRuby3在動物細胞中的表達。此外，在以mRuby3和綠熒光蛋白為受供體的FRET中，mRuby3的成熟要滯后于綠色熒光蛋白，這種成熟率之間差異將會直接影響FRET效應，影響監測細胞中一些細微或瞬時變化的生化反應的準確性。如何更好的改造mRuby3，使其成熟更快，亮度更高，同時作為FRET受體蛋白，能夠被更為高效的利用則成為一個重要的研究方向。基于此，本發明的發明人在現有的紅色熒光蛋白mRuby3的基礎上，通過對mRuby3的氨基酸序列(如SEQIDNO:3所示)和結構的分析，采用定點誘變技術，然后在組成型表達載體pNCS上對突變體進行表達和篩選，所用表達菌株為Stellar(購買自安捷倫科技公司)，為確保文庫的完整性，每個突變體設置10個克隆，最后通過藍色LED激發光透過橙色丙烯酸濾波器檢測突變體的熒光性質，篩選出熒光度高的紅色熒光蛋白的單克隆，命名該熒光蛋白為mRuby4。本發明篩選得到的紅色熒光蛋白具有較高的成熟率、亮度以及消光系數等方面的光物理特性，不僅可獨立地用于蛋白標記與成像中，以監測細胞內基因表達、蛋白定位、蛋白間相互作用、蛋白活性等生理生化反應；還可以將其作為熒光共振能量轉移受體(或供體)，與其他熒光蛋白組合或配對形成熒光共振能量轉移供受體對。在活細胞生理條件下，對蛋白質-蛋白質間相互作用進行實時的動態研究以及空間定位提供更為靈敏有效的監測途徑，以及監測細胞內基因表達、蛋白定位、蛋白活性、細胞分化發育等生理生化反應。因此，一方面，本發明提供了一種紅色熒光蛋白，其相對于熒光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突變位點：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一個或多個的組合。其中，第8位(對應于圖1序列對比圖中的氨基酸序列的第12位的位置)的天冬酰胺突變為谷氨酸(N8E)，氨基酸結構變大，且谷氨酸側鏈上的羧基更容易和第33位的天冬酰胺的氨基形成氫鍵；第10位(對應于圖1序列對比中的氨基酸序列的第14位的位置，其他突變位點的位數與序列對比位點的對應關系依次類推)的精氨酸突變為脯氨酸(R10P)，以及第114位的谷氨酸突變為纈氨酸(E114V)，有利于第10位非極性的脯氨酸與第114位非極性纈氨酸形成疏水鍵；第116位的纈氨酸突變為異亮氨酸(V116I)，使得氨基酸側鏈變長，配合第114位的谷氨酸突變為纈氨酸，有利于第116位擁有較長側鏈的異亮氨酸與第114位的纈氨酸形成疏水鍵；第177位的極性蘇氨酸突變為酸性的谷氨酸(T177E)，配合第179位的堿性精氨酸突變為擁有較短側鏈的堿性賴氨酸(R179K)，有利于第177位點與第179位點形成穩定的離子鍵。上述各氨基酸位點的突變，都有利于蛋白形成時的折疊，進而使得熒光蛋白成熟率更高。因此，容易理解，在本發明的其他實施例中，上述氨基酸位點N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的任意一個或多個的組合，都具有提高紅色熒光蛋白的成熟率的作用。優選地，本發明提供的紅色熒光蛋白相對于熒光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突變位點：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K。同時包括上述氨基酸突變位點的紅色熒光蛋白的成熟率更高。進一步地，優選地，本發明提供的紅色熒光蛋白其相對于熒光蛋白mRuby3還包括以下氨基酸突變位點：E16T，S18T，E111Q，V124E以及N173S中的一個或多個的組合。上述突變位點可進一步改善紅色熒光蛋白在成熟率、亮度以及消光系數方面的特性。進一步，更優選地，本發明提供的紅色熒光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。其相對于熒光蛋白mRuby3具有氨基酸突變位點：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E、R179K，E16T，S18T，E111Q，V124E以及N173S，共12個突變位點。再一方面，本發明提供了上述的紅色熒光蛋白在蛋白標記與成像中的應用。除了將本發明的紅色熒光蛋白與其他熒光蛋白組合形成熒光共振能量轉移供受體對外，本發明提供的紅色熒光蛋白也可以單獨地對其他蛋白進行標記，然后利用分子影像技術，對其進行成像，用以檢測或監測細胞內基因表達情況、蛋白定位、細胞分化、蛋白間相互作用、細胞分化發育等生理生化反應。另一方面，還提供了一種融合蛋白，其含有上述的紅色熒光蛋白。由于本發明提供的紅色熒光蛋白較高的成熟率，因此，可通過基因工程的技術將其與其他感興趣的蛋白進行融合，也或者是將紅色熒光蛋白標記其他感興趣的蛋白。通過對紅色熒光蛋白的成像，來對其他感興趣的蛋白進行研究。另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，該核酸可編碼上述的紅色熒光蛋白。根據密碼子的簡并性，在紅色熒光蛋白的氨基酸序列確定的情況下，其相應的編碼核酸序列也有很多種情況，其均屬于本發明的保護范圍。需要說明的是，這類核酸的應用也屬于本發明的保護范圍。優選地，編碼上述SEQIDNO:1所示的紅色熒光蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。另一方面，本發明提供了含有上述核酸的載體。載體可以是克隆載體或表達載體等，優選為表達載體。其中，表達載體可以是真核表達載體或原核表達載體，優選為真核表達載體。又或者是其他類型的載體，均屬于本發明的保護范圍。另一方面，本發明還提供了含有上述載體的重組細胞。重組細胞可以是原核細胞也可以是真核細胞。當然，重組細胞也可以是大腸桿菌、酵母菌或動物細胞或人類細胞，或者是其他類型的細胞或細菌均屬于本發明的保護范圍。另一方面，本發明提供了紅色熒光蛋白在作為熒光共振能量轉移受體或供體中的應用。本發明提供的紅色熒光蛋白可用于作為熒光共振能量轉移受體或供體；若將本發明的紅色熒光蛋白作為熒光共振能量轉移受體時，可將其他蛋白例如發射光譜與本發明的紅色熒光蛋白的激發光譜重疊的蛋白例如綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白作為熒光共振能量轉移供體；若將本發明的紅色熒光蛋白作為熒光共振能量轉移供體時，可將其他蛋白例如激發光譜與mRuby4的光譜重疊的蛋白作為熒光共振能量轉移受體。進一步地，將本發明提供的紅色熒光蛋白(作為受體)與NeonGreen2(綠色熒光蛋白，作為供體)組成的新型FRET熒光供受體對。當然，在本發明其他的實施例中，當紅色熒光蛋白在作為熒光共振能量轉移受體時，還可以將mEGFP，Envy以及Clover中的任意一種蛋白作為熒光共振能量轉移供體，與該紅色熒光蛋白組成形成熒光共振能量轉移供受體對。容易理解到，至于具體選用何種類型的熒光蛋白與本發明的紅色熒光蛋白組合形成熒光共振能量轉移受體對可根據具體使用環境進行選擇。只要將本發明提供的紅色熒光蛋白在作為熒光共振能量轉移受體或供體中的應用即落入本發明的保護范圍。再一方面，本發明提供了用于熒光共振能量轉移成像的蛋白對，該蛋白對包括上述的任意一種紅色熒光蛋白，該紅色熒光蛋白作為熒光共振能量轉移受體或熒光共振能量轉移供體。容易理解到，至于具體將上述的紅色熒光蛋白作為熒光共振能量轉移受體還是作為熒光共振能量轉移供體，均可以根據實際使用情況選擇。只要是用于熒光共振能量轉移成像的蛋白對采用了本發明提供的紅色熒光蛋白，無論其作為受體還是供體的情形均落入本發明的保護范圍。需要說明的是，本發明提供的紅色熒光蛋白可獨立地作為熒光共振能量轉移受體，受一個或多個熒光共振能量轉移供體的激發，也可以是與其他類型的熒光蛋白一起作為熒光共振能量轉移受體，受一個或多個熒光共振能量轉移供體的激發。同理，本發明提供的紅色熒光蛋白可獨立地作為熒光共振能量轉移供體，激發一個或多個熒光共振能量轉移受體，也可以是與其他熒光蛋白一起作為熒光共振能量轉移供體，激發一個或多個熒光共振能量轉移受體。綜上，本發明提供的紅色熒光蛋白，其成熟率較熒光蛋白mRuby3顯著提高28％，且是目前亮度最高的紅色熒光蛋白，消光系數由mRuby3的128000M-1·cm-1增加到132494M-1·cm-1，采用本發明提供的紅色熒光蛋白作組合成的熒光共振能量轉移供受體對具有較高FRET效應，可用于蛋白標記與成像中，并在例如活細胞生理條件下或其他條件下監測細胞內基因表達、蛋白定位、蛋白間相互作用、蛋白活性等領域中，具有非常廣闊的應用前景。以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。實施例1本實施例提供的紅色熒光蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，其相對于熒光蛋白mRuby3(SEQIDNO:3)具有以下氨基酸突變位點：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K。其中，第8位的天冬酰胺突變為谷氨酸(N8E)，氨基酸結構變大，且谷氨酸側鏈上的羧基更容易和第33位的天冬酰胺的氨基形成氫鍵；第10位的精氨酸突變為脯氨酸(R10P)，以及第114位的谷氨酸突變為纈氨酸(E114V)，有利于第10位非極性的脯氨酸與第114位非極性纈氨酸形成疏水鍵；第116位的纈氨酸突變為異亮氨酸(V116I)，使得氨基酸側鏈變長，配合第114位的谷氨酸突變為纈氨酸，有利于第116位擁有較長側鏈的異亮氨酸與第114位的纈氨酸形成疏水鍵；第177位的極性蘇氨酸突變為酸性的谷氨酸(T177E)，配合第179位的堿性精氨酸突變為擁有較短側鏈的堿性賴氨酸(R179K)，有利于第177位點與第179位點形成穩定的離子鍵。需要說明的是：突變位點N8E中的“8”對應與圖1所示氨基酸序列的第12位的位置，突變位點R10P中的“10”對應與圖1所示氨基酸序列的第14位的位置，其他突變位點的位置依次類推。上述各氨基酸位點的突變，都有利于蛋白形成時的折疊，進而使得本實施例提供的紅色熒光蛋白成熟率更高。本實施例提供的紅色熒光蛋白可作為熒光共振能量轉移受體(或供體)，克服現有熒光蛋白mRuby3存在成熟率低的問題，與其他熒光蛋白組合或配對形成熒光共振能量轉移供受體對，其具有良好的FRET效應，提高其在監測細胞中一些細微或瞬時變化的生化反應的準確性。實施例2在實施例1的紅色熒光蛋白(SEQIDNO:4)的基礎上，對其進行進一步的定點突變，以提高其亮度、消光系數、量子產率等方面的特性。本實施例提供的紅色熒光蛋白，命名為mRuby4，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其相對于熒光蛋白mRuby3(其氨基酸序列如SEQIDNO:3)不僅具有以下氨基酸突變位點：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K；還具有以下氨基酸突變位點：E16T，S18T，E111Q，V124E以及N173S。mRuby4與mRuby3的氨基酸序列比對結果如圖1所示。本實施例提供的紅色熒光蛋白(SEQIDNO:1)不僅具有較高的成熟率，還具有較高的消光系數、亮度等特性。本實施例提供的紅色熒光蛋白可以獨立地用于蛋白標記與成像的領域中，還可以與其他熒光蛋白組合或配對，形成熒光共振能量轉移供受體對進行成像，用以檢測或監測細胞內基因表達情況、蛋白定位、細胞分化、蛋白間相互作用、細胞分化發育等生理生化反應，提高其在監測細胞中一些細微或瞬時變化的生化反應的準確性。實施例3本實施例提供了獲得實施例2的紅色熒光蛋白(SEQIDNO:1)的方法，當然，實施例1所提供的紅色熒光蛋白的獲得方法也可參考本實施例。需要說明的是，本發明的紅色熒光蛋白的獲得方法并不限于本實施例所提供的方法，在其他的實施例中，采用其他方法所得到的本發明的紅色熒光蛋白同樣屬于本發明的保護范圍。本實施例提供的獲得紅色熒光蛋白(SEQIDNO:1)的方法，如下。(1)根據實施例2提供的紅色熒光蛋白(SEQIDNO:1)的氨基序列設計出相應的核酸序列，該核酸序列編碼紅色熒光蛋白(SEQIDNO:1)。在本實施例中，編碼該紅色熒光蛋白的核酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。(2)通過基因合成方法獲得上述核酸序列(SEQIDNO:2)，將該核酸序列連接至表達載體上，并轉化感受態細胞，并涂布培養。(3)挑取單菌落，接種培養，然后測序，取測序正確的單克隆繼續培養。(4)對培養液進行離心、純化，得到紅色熒光蛋白。實施例4本實施例提供了一種用于熒光共振能量轉移成像的蛋白對，該蛋白對以實施例2提供的紅色熒光蛋白(SEQIDNO:1)作為熒光共振能量轉移受體，以綠色熒光蛋白NeonGreen2作為熒光共振能量轉移供體。該蛋白對具有較高的提高FRET效應，其為在活細胞生理條件下，對蛋白質-蛋白質間相互作用進行實時的動態研究以及空間定位提供更為靈敏有效的監測途徑。實施例5實施例2提供的紅色熒光蛋白(SEQIDNO:1)的單體性檢測熒光蛋白mRuby4的單體性實驗采用B-PERII(購買自皮爾斯公司)對表達mRuby4的菌株進行裂解，然后采用HisPurCobaltResin(購買自皮爾斯公司)純化蛋白，接著通過Econo-Pac10DG重力流色譜柱(購買自美國Bio-Rad公司)去鹽。完成以上蛋白純化步驟后，統一將熒光蛋白的濃度濃縮成10mg/ml，放入到進樣瓶中，用島津高效液相色譜儀檢測熒光蛋白的單體性。以現有的熒光蛋白：mKate2、Fusionred、mRuby3作為參照，結果如圖2所示。圖2中：A為mRuby3，B為mRuby4，C為Fusionred，D為mKate2，橫坐標為出峰的時間，單位分鐘，縱坐標為蛋白質紫外吸收值。結果如圖2所示(圖中：A代表mRuby3；B代表mRuby4；C代表FusionRed；D代表mKate2)。圖2的結果顯示，mRuby4為單體紅色熒光蛋白。Fusionred為目前已知的單體性較好的熒光蛋白，mKate2為目前已知的熒光蛋白二聚體，從圖2中可知mRuby3與mRuby4的單體性良好，甚至優于Fusionred。實施例6對實施例2提供的紅色熒光蛋白的光物理性質檢測，具體的檢測方法可參考相關文獻(ChuJ,等Abrightcyan-excitableorangefluorescentproteinfacilitatesdual-emissionmicroscopyandenhancesbioluminescenceimaginginvivo.NatBiotechnology.2016Jul；34(7):760-767)。結果如表1所示。表1實施例4提供的紅色熒光蛋白mRuby4的光物理性質蛋白名稱mRuby3mRuby4激發峰(nm)558558發射峰(nm)592592消光系數(M-1cm-1)128000132494.1量子產率0.450.45亮度57.659.6成熟率0.4386080.558755由表1的結果可知，mRuby4的成熟率為0.558755，相較于mRuby3，mRuby4的成熟率提高了28％；此外，從表1還可得到，mRuby4的亮度為59.6，顯著高于mRuby4的亮度，本發明實施例2提供的mRuby4是目前亮度最高的紅色熒光蛋白；mRuby4的消光系數由mRuby3的128000M-1·cm-1增加到132494M-1·cm-1，由此表明，本發明實施例2提供的紅色熒光蛋白的具有優良的光物理性質。其可以與其他的熒光蛋白組合形成熒光共振能量轉移供受體對，提高FRET效應，且可獨立地用于蛋白標記與成像中，并在監測細胞內基因表達、蛋白定位、蛋白間相互作用、蛋白活性等領域中，具有非常廣闊的應用前景。綜上所述，本發明提供的紅色熒光蛋白具有以下優點：(1)亮度高，是目前亮度最高的紅色熒光蛋白。(2)成熟率高，其成熟率較先前的mRuby3也有了28％的顯著提高。(3)消光系數高，消光系數由mRuby3的128000M-1·cm-1增加到132494M-1·cm-1。(4)應用前景廣闊，本發明的紅色熒光蛋白能夠用作熒光共振能量轉移受體或供體，具有較高的FRET效應；或者是獨立用于蛋白標記與成像或活體成像用于監測細胞內基因表達、蛋白定位、蛋白間相互作用、蛋白活性等領域中，具有非常廣闊的應用前景。以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>深圳先進技術研究院<120>一種紅色熒光蛋白、融合蛋白、分離的核酸、載體和應用<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>237<212>PRT<213>人工序列<400>1MetValSerLysGlyGluGluLeuIleLysGluGluMetProMetLys151015ValValMetThrGlyThrValAsnGlyHisTyrPheLysCysThrGly202530GluGlyGluGlyArgProTyrGluGlyValGlnThrMetArgIleLys354045ValIleGluGlyGlyProLeuProPheAlaPheAspIleLeuAlaThr505560SerPheMetTyrGlySerArgThrPheIleLysTyrProAlaAspIle65707580ProAspPhePheLysGlnSerPheProGluGlyPheThrTrpGluArg859095ValThrArgTyrGluAspGlyGlyValValThrValThrGlnAspThr100105110SerLeuGlnAspGlyValLeuIleTyrAsnValLysValArgGlyGlu115120125AsnPheProSerAsnGlyProValMetGlnLysLysThrLysGlyTrp130135140GluProAsnThrGluMetMetTyrProAlaAspGlyGlyLeuArgGly145150155160TyrThrAspIleAlaLeuLysValAspGlyGlyGlyHisLeuHisCys165170175SerPheValThrGluTyrLysSerLysLysThrValGlyAsnIleLys180185190MetProGlyValHisAlaValAspHisArgLeuGluArgIleGluGlu195200205SerAspAsnGluThrTyrValValGlnArgGluValAlaValAlaLys210215220TyrSerAsnLeuGlyGlyGlyMetAspGluLeuTyrLys225230235<210>2<211>711<212>DNA<213>人工序列<400>2atggtgtctaagggcgaagagctgatcaaggaagagatgcccatgaaggtggtcatgaca60ggtaccgtcaacggccactacttcaagtgcacaggtgaaggagaaggcagaccgtacgag120ggagtgcaaaccatgaggatcaaagtcatcgagggaggacccctgccatttgcctttgac180attcttgccacgtcgttcatgtatggcagccgtacctttatcaagtacccggccgacatc240cctgatttctttaaacagtcctttcctgagggttttacttgggaaagagttacgagatac300gaagatggtggagtcgtcaccgtcacgcaggacaccagccttcaggatggcgtgctcatc360tacaacgtcaaggtcagaggggagaactttccctccaatggtcccgtgatgcagaagaag420accaagggttgggagcctaatacagagatgatgtatccagcagatggtggtctgagagga480tacactgacatcgcactgaaagttgatggtggtggccatctgcactgcagcttcgtgaca540gaatacaagtcaaaaaagaccgtcgggaacatcaagatgcccggtgtccatgccgttgat600caccgcctggaaaggatcgaggagagtgacaatgaaacctacgtagtgcaaagagaagtg660gcagttgccaaatacagcaaccttggtggtggcatggacgagctgtacaag711<210>3<211>237<212>PRT<213>人工序列<400>3MetValSerLysGlyGluGluLeuIleLysGluAsnMetArgMetLys151015ValValMetGluGlySerValAsnGlyHisGlnPheLysCysThrGly202530GluGlyGluGlyArgProTyrGluGlyValGlnThrMetArgIleLys354045ValIleGluGlyGlyProLeuProPheAlaPheAspIleLeuAlaThr505560SerPheMetTyrGlySerArgThrPheIleLysTyrProAlaAspIle65707580ProAspPhePheLysGlnSerPheProGluGlyPheThrTrpGluArg859095ValThrArgTyrGluAspGlyGlyValValThrValThrGlnAspThr100105110SerLeuGluAspGlyGluLeuValTyrAsnValLysValArgGlyVal115120125AsnPheProSerAsnGlyProValMetGlnLysLysThrLysGlyTrp130135140GluProAsnThrGluMetMetTyrProAlaAspGlyGlyLeuArgGly145150155160TyrThrAspIleAlaLeuLysValAspGlyGlyGlyHisLeuHisCys165170175AsnPheValThrThrTyrArgSerLysLysThrValGlyAsnIleLys180185190MetProGlyValHisAlaValAspHisArgLeuGluArgIleGluGlu195200205SerAspAsnGluThrTyrValValGlnArgGluValAlaValAlaLys210215220TyrSerAsnLeuGlyGlyGlyMetAspGluLeuTyrLys225230235<210>4<211>237<212>PRT<213>人工序列<400>4MetValSerLysGlyGluGluLeuIleLysGluGluMetProMetLys151015ValValMetGluGlySerValAsnGlyHisGlnPheLysCysThrGly202530GluGlyGluGlyArgProTyrGluGlyValGlnThrMetArgIleLys354045ValIleGluGlyGlyProLeuProPheAlaPheAspIleLeuAlaThr505560SerPheMetTyrGlySerArgThrPheIleLysTyrProAlaAspIle65707580ProAspPhePheLysGlnSerPheProGluGlyPheThrTrpGluArg859095ValThrArgTyrGluAspGlyGlyValValThrValThrGlnAspThr100105110SerLeuGluAspGlyValLeuIleTyrAsnValLysValArgGlyVal115120125AsnPheProSerAsnGlyProValMetGlnLysLysThrLysGlyTrp130135140GluProAsnThrGluMetMetTyrProAlaAspGlyGlyLeuArgGly145150155160TyrThrAspIleAlaLeuLysValAspGlyGlyGlyHisLeuHisCys165170175AsnPheValThrGluTyrLysSerLysLysThrValGlyAsnIleLys180185190MetProGlyValHisAlaValAspHisArgLeuGluArgIleGluGlu195200205SerAspAsnGluThrTyrValValGlnArgGluValAlaValAlaLys210215220TyrSerAsnLeuGlyGlyGlyMetAspGluLeuTyrLys225230235當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3