酪氨酸酶抑制劑及其制備法和用途的制作方法

本發明涉及一類酪氨酸酶抑制劑及其制備方法，該類化合物為含肟醚基團的羥基吡啶酮衍生物，即為具有酪氨酸酶抑制活性的含肟醚基團的羥基吡啶酮衍生物。

背景技術：

酪氨酸酶(tyrosinase，ec.1.14.18.1)是一種含酮的金屬酶，同時兼有單酚酶和二酚酶生物活性，廣泛分布于動、植物和微生物中。在動物、微生物中多被稱為酪氨酸酶，在植物中多被稱為多酚氧化酶。據目前研究所知，酪氨酸酶是生物體中參與黑色素代謝的關鍵酶，不僅決定著黑色素合成的速率，而且標志著黑色素細胞分化成熟程度。此外，其在生物體中也具有重要的生理功能，除了形成動物皮膚中的保護性黑色素；還與昆蟲的傷口愈合與發育、以及果蔬與海鮮類產品的褐變密切相關。酪氨酸酶抑制劑大多具有清除自由基、抗氧化、延緩衰老的能力，因此，近年來多種酪氨酸酶抑制劑作為美白劑已陸續應用于化妝品中。此外，酪氨酸酶抑制劑還可用于治療黑色素代謝異常引起的疾病(如黑色素瘤、白癜風、白化病、阿爾茨海默病等)。酪氨酸酶抑制劑還可通過抑制或破壞昆蟲體內的酪氨酸酶活性來抑制昆蟲的正常發育，從而間接達到殺死害蟲的能力。綜上所述，酪氨酸酶抑制劑在美容保健、疾病治療、蟲害防治、食品保鮮等領域有著廣泛的應用前景。

對酪氨酸酶及抑制劑的研究涉及生物、醫學、農學、化學、藥學等多個學科和領域，尋求新的酪氨酸酶抑制劑是藥物化學家和食品科學家高度關注的研究課題之一。目前已得到確認的酪氨酸酶抑制劑很多，如：植物多酚(類黃酮、沒食子酸、查耳酮類、芪類等)，高等植物中的一些醛類化合物(枯茗醛、肉桂醛等)，一些真菌代謝物(曲酸等)，合成的抑制劑(卡托普利，4-取代間苯二酚等)等。但由于各種各樣的缺點，如活性不夠、有較大毒性、價格較高等，目前得到應用的酪氨酸酶抑制劑非常有限。因此，研究安全、高效、價格低廉、有我國自主知識產權的酪氨酸酶抑制劑是迫切需要的。

羥基吡啶酮是一類對三價鐵具有很強親合性的螯合劑，在醫藥領域具有廣泛的應用前景。羥基吡啶酮由于對銅離子有較強的螯合能力，能通過奪取酪氨酸酶活性中心的銅離子而對酶具有抑制作用，但羥基吡啶酮環上的取代基及取代位置對其抑制酶活性具有很大影響。

目前現有的具有較強酪氨酸酶抑制活性的羥基吡啶酮衍生物的結構式為：

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種酪氨酸酶抑制劑(即，含肟醚基團的羥基吡啶酮衍生物)及其制備方法，該類化合物具良好的酪氨酸酶抑制活性。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種含肟醚基團的羥基吡啶酮衍生物，其結構通式為：

化合物1中：r為h、cnh2n+1(n＝1-12)、取代烴基；r’＝cnh2n+1(n＝1-6)。

作為本發明的含肟醚基團的羥基吡啶酮衍生物的改進，其結構式為如下任意一種：

本發明還同時提供了上述含肟醚基團的羥基吡啶酮衍生物的制備方法。化合物1的合成依次包括以下步驟：

1)、將曲酸的5位羥基芐基化，然后與氨水或含不同碳鏈長度的脂肪胺反應，再經二氧化錳氧化，得到2號位含醛基的吡啶酮衍生物；

2)、o-烷基羥胺鹽酸鹽與2號位含醛基的吡啶酮衍生物發生縮合反應，再經鹽酸脫芐基后得到含肟醚基團的羥基吡啶酮衍生物1。

本發明還同時提供了上述羥基吡啶酮衍生物的用途：用作酪氨酸酶抑制劑。

本發明的含肟醚基團的羥基吡啶酮衍生物由于具有酪氨酸酶抑制活性，因此能用于化妝品或食品的保鮮。

其用法和用量可參照上述羥基吡啶酮衍生物。

本發明的羥基吡啶酮化合物較曲酸衍生物有更好的穩定性。羥基吡啶酮環由于存在共振結構，故具有芳香性，其穩定性比沒有芳香性的曲酸中的環要高得多。

附圖說明

下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1為化合物1(a-f)對單酚酶的抑制作用對比圖；

圖2為化合物1e和1f對二酚酶的抑制作用對比圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1、化合物1a-1f的合成：

以曲酸為原料合成化合物1a-1f的路線如scheme1所示。

化合物3的合成是以曲酸(2)為原料并按文獻報道方法合成(designandsynthesisofhydroxypyridinone-l-phenylalanineconjugatesaspotentialtyrosinaseinhibitors.journalofagriculturalandfoodchemistry2013,61(27),6597-6603)。

a、化合物4的合成

1)、化合物4a-4c的合成

取10g化合物3加入17ml無水乙醇，邊攪拌邊油浴加熱回流，之后量取83ml氨水(質量濃度25-28％)注入其中，于60℃反應過夜，用tlc檢測反應進程。待反應結束后(反應時間為12小時)，冷卻至室溫放置，沉淀析出，過濾收集沉淀，然后沉淀用少量乙醚洗滌2次，干燥得到產物4a。產率76％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:4.34(d,j＝5.5hz,2h,ch2),5.01(s,2h,ch2),5.58(s,1h,吡啶酮環中c3-h),6.10(s,1h,吡啶酮環中c6-h),7.30-7.43(m,5h,ph).esi-ms:m/z232([m+h]⁺)。

2)、化合物4b-4f的合成按文獻報道方法合成(designandsynthesisofhydroxypyridinone-l-phenylalanineconjugatesaspotentialtyrosinaseinhibitors.journalofagriculturalandfoodchemistry2013,61(27),6597-6603)。

b、化合物5的合成

稱取20mmol化合物4(4a-4f)溶于100ml二氯甲烷，再加入0.16mol二氧化錳，此混合體系在攪拌條件下于50℃油浴加熱回流反應72-96h，tlc點板檢測反應進程。待反應結束后，抽濾除去二氧化錳，蒸去溶劑得化合物5。

5-芐氧基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛(5a):產率60.6％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:5.31(s,2h,ch2),7.34-7.49(m,6h,ph和吡啶酮環中c3-h),8.42(s,1h,吡啶酮環中c6-h),9.25(s,1h,cho).esi-ms:m/z230(mh⁺)。

5-芐氧基-1-甲基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛(5b)：產率72.3％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:2.49(s,3h,ch3),5.28(s,2h,ch2),7.00(s,2h,吡啶酮環中c-3h和c-6h),7.29-7.45(m,5h,ph),9.75(s,1h,cho).esi-ms:m/z244(mh⁺)。

5-芐氧基-1-乙基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛(5c)：產率74.4％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:1.27(t,j＝7.0hz,3h,ch3),4.24(q,j＝7.0hz,2h,ch2),5.25(s,2h,ch2),7.00(s,2h,吡啶酮環中c-3h和c-6h),7.29-7.40(m,5h,ph),9.59(s,1h,cho)。esi-ms:m/z258(mh⁺)。

5-芐氧基-1-丁基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛(5d)：產率75.8％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:0.86(t,j＝7.5hz,3h,ch3),1.13-1.21(m,2h,ch2),1.51-1.57(m,2h,ch2),4.18(t,j＝7.5hz,2h,ch2),5.25(s,2h,ch2),6.96(s,1h,吡啶酮環中c-3h),6.97(s,1h,吡啶酮環中c-6h),7.30-7.40(m,5h,ph),9.58(s,1h,cho)。esi-ms:m/z286(mh⁺)。

5-芐氧基-1-己基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛(5e)：產率76.4％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:0.87(t,j＝7.0hz,3h,ch3),1.23(m,6h,ch2),1.56(m,2h,ch2),4.17(t,j＝7.0hz,2h,ch2),5.26(s,2h,ch2),6.97(s,1h,吡啶酮環中c3-h),6.99(s,1h,吡啶酮環中c6-h),7.30-7.41(m,5h,ph),9.58(s,1h,cho)。esi-ms:m/z314(mh⁺)。

5-芐氧基-1-辛基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛(5f)：產率77.5％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:0.88(t,j＝7.0hz,3h,ch3),1.17-1.28(m,10h,5ch2),1.56(m,2h,ch2),4.17(t,j＝7.0hz,2h,ch2),5.26(s,2h,ch2),6.97(1h,吡啶酮環中c-3h),6.98(s,1h,吡啶酮環中c-6h),7.30-7.41(m,5h,ph),9.58(s,1h,cho)。esi-ms:m/z342(mh⁺)。

c、化合物6的合成

稱取5mmol化合物5(5a-5f)溶于40ml乙醇水溶液(乙醇：水＝1:1的體積比)中，再加入15mmolo-乙基羥胺鹽酸鹽，冰浴條件下攪拌至上述固體全部溶解，逐滴滴加9ml氫氧化鉀溶液(2mol/l)，滴加完畢后撤去冰浴，室溫下攪拌2-3h，tlc點板檢測反應進程。待反應結束后，旋蒸除去乙醇，用二氯甲烷萃取2-3次，合并有機層，用飽和食鹽水洗滌2次，用無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸去溶劑，殘留物用硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇15:1，體積比)，得化合物6。

備注說明：

1)、當r基團為h時，所得產物為6a，柱層析純化的具體步驟為：以二氯甲烷/甲醇(15:1的體積比)作為洗脫液；收集rf＝0.35的溶液，蒸去溶劑得到6a。

2)、當r基團為ch3時，所得產物為6b，柱層析純化的具體步驟為：以二氯甲烷/甲醇(15:1的體積比)作為洗脫液；收集rf＝0.45的溶液，蒸去溶劑得到6b。

3)、當r基團為c2h5時，所得產物為6c，柱層析純化的具體步驟為：以二氯甲烷/甲醇(15:1的體積比)作為洗脫液；收集rf＝0.52的溶液，蒸去溶劑得到6c。

4)、當r基團為n-c4h9時，所得產物為6d，柱層析純化的具體步驟為：以二氯甲烷/甲醇(15:1的體積比)作為洗脫液；收集rf＝0.60的溶液，蒸去溶劑得到6d。

5)、當r基團為n-c6h13時，所得產物為6e，柱層析純化的具體步驟為：以二氯甲烷/甲醇(15:1的體積比)作為洗脫液；收集rf＝0.63的溶液，蒸去溶劑得到6e。

6)、當r基團為n-c8h17時，所得產物為6f，柱層析純化的具體步驟為：以二氯甲烷/甲醇(15:1的體積比)作為洗脫液；收集rf＝0.63的溶液，蒸去溶劑得到6f。

5-芐氧基-4-氧-1,4--二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(6a):rf＝0.35，產率71.4％.¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:1.24(t,j＝7.0hz,3h,ch3),4.16(q,j＝7.0hz,2h,ch2),5.14(s,2h,ch2),7.31-7.46(m,5h,ph),7.97(s,1h,ch).esi-ms:m/z273(mh⁺)。

5-芐氧基-1-甲基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(6b)：rf＝0.45，產率64.4％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:1.31(t,j＝7.0hz,3h,ch3),3.68(s,3h,ch3),4.24(q,j＝7.0hz,2h,ch2),5.20(s,2h,ch2),6.66(s,1h,吡啶酮環中c-3h),6.93(s,1h,吡啶酮環中c-6h),7.29-7.42(m,5h,ph),7.91(s,1h,ch)。esi-ms:m/z287(mh⁺)。

5-芐氧基-1-乙基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(6c)：rf＝0.52，產率60.7％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:1.26(t,j＝7.0hz,3h,ch3),1.30(t,j＝7.0hz,3h,ch3),4.00(q,j＝7.0hz,2h,ch2),4.23(q,j＝7.0hz,2h,ch2),5.19(s,2h,ch2),6.65(s,1h,吡啶酮環中c-3h),6.93(s,1h,吡啶酮環中c-6h),7.27-7.41(m,5h,ph),7.90(s,1h,ch).esi-ms:m/z301(mh⁺)。

5-芐氧基-1-丁基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(6d)：rf＝0.60，產率71.3％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:0.87(t,j＝7.5hz,3h,ch3),1.12-1.22(m,2h,ch2),1.31(t,j＝7.0hz,3h,ch3),1.50-1.61(m,2h,ch2),3.93(t,j＝7.5hz,2h,ch2),4.23(q,j＝7.0hz,2h,ch2),5.21(s,2h,ch2),6.68(s,1h,吡啶酮環中c-3h),6.89(s,1h,吡啶酮環中c-6h),7.27-7.41(m,5h,ph),7.90(s,1h,ch).esi-ms:m/z329(mh⁺)。

5-芐氧基-1-己基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(6e)：rf＝0.63，產率62.9％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:0.87(t,j＝7.5hz,3h,ch3),1.10-1.27(m,6h,3ch2),1.31(t,j＝7.0hz,3h,ch3),1.51-1.62(m,2h,ch2),3.92(t,j＝7.5hz,2h,ch2),4.23(q,j＝7.0hz,2h,ch2),5.21(s,2h,ch2),6.66(s,1h,吡啶酮環中c-3h),6.90(s,1h,吡啶酮環中c-6h),7.27-7.41(m,5h,ph),7.90(s,1h,ch).esi-ms:m/z357(mh⁺)。

5-芐氧基-1-辛基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(6f)：rf＝0.65，產率74.0％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:0.87(t,j＝7.5hz,3h,ch3),1.10-1.27(m,10h,5ch2),1.30(t,j＝7.0hz,3h,ch3),1.52-1.61(m,2h,ch2),3.90(t,j＝7.5hz,2h,ch2),4.22(q,j＝7.0hz,2h,ch2),5.19(s,2h,ch2),6.65(s,1h,吡啶酮環中c-3h),6.90(s,1h,吡啶酮環中c-6h),7.25-7.40(m,5h,ph),7.88(s,1h,ch)。esi-ms:m/z385(mh⁺)。

d、化合物1的合成

取1mmol化合物6(6a-6f)溶于2ml甲醇，加入3ml鹽酸溶液(3m)，此混合體系在攪拌條件下于100℃油浴回流反應，tlc板點板檢測反應進程。反應后處理方式如下：

1)、當r基團為h、ch3、c2h5時，反應體系需要油浴加熱回流約36h，待反應結束后，冷卻至室溫，用二氯甲烷萃取，有機相出現懸浮固體，旋蒸除去溶劑，所得產物分別為1a、1b、1c。

2)、當r基團為n-c4h9、n-c6h13時，反應體系需要油浴加熱回流48h，待反應結束后，冷卻至室溫，用二氯甲烷萃取2-3次，合并有機相，旋蒸除去二氯甲烷后，所得產物分別為1d、1e。

3)、當r基團為n-c8h17時，反應體系需要油浴加熱回流約72h，待反應結束后，冷卻至室溫，析出白色固體產物，收集并干燥所得產物為1f。

5-芐氧基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(1a):白色固體，產率85.0％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:1.28(t,j＝7.0hz,3h,ch3),4.27(q,j＝7.0hz,2h,ch2),7.53(s,1h,吡啶酮環中c-3h),8.16(s,1h,吡啶酮環中c-6h),8.37(s,1h,ch).¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ:14.80,71.22,110.44,127.79,137.84,141.77,146.34,161.25.esi-ms:m/z183(mh⁺)；hrms:c8h11n2o3(mh⁺)計算值183.0764，實測值。

5-羥基-1-甲基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(1b):白色固體，產率84.6％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:1.29(t,j＝7.0hz,3h,ch3),4.08(s,3h,ch3),4.28(q,j＝7.0hz,2h,ch2),7.64(s,1h,吡啶酮環中c-3h),8.29(s,1h,吡啶酮環中c-6h),8.55(s,1h,ch).¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ:14.82,44.55,71.27,110.72,133.39,139.68,142.07,146.34,160.21.esi-ms:m/z197(mh⁺)；hrms:c9h13n2o3(mh⁺)計算值197.0921，實測值。

1-乙基-5-羥基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(1c):白色固體，產率85.7％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:1.29(t,j＝7.5hz,3h,ch3),1.34(t,j＝7.5hz,3h,ch3),4.28(q,j＝7.5hz,2h,ch2),4.47(q,j＝7.5hz,2h,ch2),7.64(s,1h,吡啶酮環中c-3h),8.35(s,1h,吡啶酮環中c-6h),8.63(s,1h,ch).¹³cnmr(125mhz,meod)δ:14.82,16.53,51.96,71.29,111.50,132.14,138.84,141.86,146.71,160.48.esi-ms:m/z211(mh⁺)；hrms:c10h15n2o3(mh⁺)計算值211.1077實測值。

1-丁基-5-羥基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(1d):白色固體，產率61.0％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:0.88(t,j＝7.5hz,3h,ch3),1.29(t,j＝7.5hz,5h,ch2和ch3),1.62-1.71(m,2h,ch2),4.28(q,j＝7.5hz,2h,ch2),4.44(t,j＝7.5hz,2h,ch2),7.66(s,1h,吡啶酮環中c-3h),8.36(s,1h,吡啶酮環中c-6h),8.64(s,1h,ch).¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ:13.87,14.82,19.21,32.94,56.19,71.30,111.59,132.72,138.93,141.96,146.50,160.28.esi-ms:m/z239(mh⁺)；hrms:c12h19n2o3(mh⁺)計算值239.1390，實測值。

1-己基-5-羥基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(1e):白色固體，產率63.4％。¹hnmr(500mhz,cd3od)δ:0.92(t,j＝7.5hz,3h,ch3),1.36(t,j＝7.0hz,9h,3ch2和ch3),1.80-1.87(m,2h,ch2),4.35(q,j＝7.0hz,2h,ch2),4.48(t,j＝7.5hz,2h,ch2),7.56(s,1h,吡啶酮環中c-3h),8.22(s,1h,吡啶酮環中c-6h),8.50(s,1h,ch).¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ:12.82,13.41,22.06,25.38,30.57,30.92,56.66,71.33,111.28,131.95,139.79,140.21,146.26,159.80.esi-ms:m/z267(mh⁺)；hrms:c14h23n2o3(mh⁺)計算值267.1703，實測值。

5-羥基-1-辛基-4-氧-1,4-二氫吡啶-2-甲醛-o-乙基肟(1f):白色固體，產率70.1％。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:0.84(t,j＝7.0hz,3h,ch3),1.17-1.26(m,10h,5ch2),1.29(t,j＝7.0hz,3h,ch3),1.62-1.72(m,2h,ch2),4.28(q,j＝7.0hz,2h,ch2),4.42(t,j＝7.0hz,2h,ch2),7.60(s,1h,吡啶酮環中c-3h),8.32(s,1h,吡啶酮環中c-6h),8.64(s,1h,ch).¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ:14.36,14.81,22.47,25.79,28.81,28.87,30.90,31.56,56.28,71.27,111.78,132.50,139.00,142.08,146.57,160.67.esi-ms:m/z295(mh⁺)；hrms:c16h27n2o3(mh⁺)計算值295.2016，實測值。

實驗1、化合物1對蘑菇酪氨酸酶單酚酶抑制活性的測定

單酚酶活力測定參考文獻(designandsynthesisofhydroxypyridinone-l-phenylalanineconjugatesaspotentialtyrosinaseinhibitors.journalofagriculturalandfoodchemistry2013,61(27),6597-6603)的方法并稍加改進：酪氨酸酶的單酚酶活力測定是以2mmol/l酪氨酸為底物，在180μl緩沖液(ph6.86)中加入10μl化合物1(溶于dmso溶液)，再加入10μl預先在30℃恒溫水浴保溫的底物溶液，然后加入10μl蘑菇酪氨酸酶水溶液(1ml酶液活力為2000u，即10μl酶液活力為20u)，立刻混勻，于30℃恒溫條件下密閉溫浴10min，迅速于475nm處檢測吸光度值。不同組的反應體系的組成具體如表1。

表1、反應液體系

化合物對酪氨酸酶活性的抑制率按如下公式進行計算：

抑制率(％)＝[1-(od3-od4)/(od1-od2)]×100％；

其中od1、od2、od3和od4分別為第一到第四組溶液的光密度。

隨著化合物濃度的增大，對酪氨酸酶活性的抑制增加。化合物對酪氨酸酶單酚酶活性的抑制率為50％時的化合物的濃度(ic50)見表2。化合物1e和1f的活性最高，分別約為曲酸的5.9倍和7.5倍。

表2、化合物1的酪氨酸酶抑制活性

選取酪氨酸酶單酚酶抑制活性較好的化合物1e和1f測定其對酪氨酸酶二酚酶的抑制活性(實驗2)、抑制類型和抑制常數(實驗3)。

實驗2、化合物1e和1f對蘑菇酪氨酸酶二酚酶抑制活性的測定

二酚酶活力測定參考文獻(designandsynthesisofhydroxypyridinone-l-phenylalanineconjugatesaspotentialtyrosinaseinhibitors.journalofagriculturalandfoodchemistry2013,61(27),6597-6603)的方法：以原始濃度0.5mmol/l的l-多巴為底物，總測活體系是300μl，用套裝緩沖劑ph6.86維持溶液的ph，緩沖劑要現用現配。具體方法是先在180μl緩沖液(ph6.86)中加入10μl抑制劑(溶于dmso溶液)，再加入100μl預先在30℃恒溫水浴保溫的底物溶液，然后加入10μl蘑菇酪氨酸酶水溶液(1ml酶液活力為2000u，10μl酶液活力為20u)，立刻混勻，在30℃恒溫條件下實時跟蹤波長為475nm的吸光度值隨時間增長的曲線，測定儀器為infinitem200全自動酶標儀。由曲線的直線部分的斜率求得酶活力，以酶的相對剩余活力對抑制劑濃度作圖，酶的相對剩余活力為50％時對應的抑制劑濃度即為抑制劑的半抑制率ic50。

酶的相對活力隨化合物1e或1f濃度的增大而不同程度地減小，說明1e或1f抑制二酚酶的活力，導致酶活力下降，且濃度越大，抑制能力越強。化合物1e對酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率為50％時的化合物的濃度(ic50)為13.89μmol/l、1f的濃度(ic50)為7.99μmol/l；經比較知1f比1e對二酚酶的抑制能力強。現有的羥基吡啶酮衍生物7a、7b、7c的濃度(ic50)分別為4.00、8.97、26.20μmol/l。

實驗3、1e和1f對酪氨酸酶二酚酶抑制類型和抑制常數的測定

測定方法與實驗2測定方法基本相同，固定酪氨酸酶的濃度(實驗加入的10μl酶液的酶活為20u)，改變加入的l-多巴的量，測定不同濃度1e或1f對酶活力的影響。采用lineweaver-burk雙倒數法作圖，以底物濃度的倒數1/[s]為x軸，以反應速度的倒數1/υ為y軸，來判斷抑制劑的抑制類型。以直線的斜率和在y軸上的截距對抑制劑濃度再次作圖，求出抑制劑對游離酶(e)的抑制常數ki和對酶-底物復合物(es)的抑制常數kis。

隨著1e和1f濃度的增大，不但使酶促反應的最大反應速度(vmax)變小，還導致米氏常數(km)變大，可知1e和1f對酪氨酸酶二酚酶的抑制類型為混合型。化合物1e和1f對酪氨酸酶二酚酶抑制類型和抑制常數見表3。

表3、化合物1e和1f的酪氨酸酶二酚酶抑制類型及抑制常數

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。