一種啟動子以及重組酵母菌株的制作方法

本發明涉及基因工程技術領域，更具體的說是涉及一種啟動子以及重組酵母菌株。

背景技術：

萜類化合物是所有異戊二烯聚合物及其衍生物的總稱，根據其分子中包括異戊二烯單位的數目可分為：單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜。萜類在植物界中普遍存在，具有重要的藥用價值和經濟價值，如抗腫瘤藥物紫杉醇、抗瘧疾藥物青蒿素，強抗氧化劑類胡蘿卜素，還有番茄紅素、香葉醇、青蒿二烯等等。然而由于植物資源稀缺、活性物質含量低、化學合成難度大等因素，限制了萜類在醫藥等領域中的廣泛應用。

合成生物細胞工廠針對宿主細胞(微生物等)和目標生物合成路徑進行有目標地改造產生直接效益，能夠降低生產成本、縮短生產周期，因此運用合成生物細胞工廠高效生產上述化合物，具有十分廣闊的應用前景。釀酒酵母是公認安全的模式微生物，它生長周期短且容易高密度培養，可作食用、藥用酵母，是上述物質合成的非常優秀的宿主。

目前合成生物細胞工廠存在的關鍵科學問題是宿主細胞與異源生物合成路徑間的適配。一方面異源生物合成路徑本身的代謝通量決定目標產物的產量，因此需要優化異源路徑，包括優化異源基因的表達、基因來源的篩選、胞內前體物質供給等；另一方面來自宿主細胞固有的代謝和調控系統也會影響目標生物合成路徑的生產能力，這就需要對底盤細胞進行深入系統的優化。

在釀酒酵母中，基因ALD6(由ALD6啟動子控制)編碼乙醛脫氫酶，催化細胞質中的乙醛生成乙酸。基因ALD6的表達水平會直接影響細胞中乙酸的積累，但尚未有任何該基因可影響萜類化合物產量的報道。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種啟動子，使得所述啟動子能夠提高所在酵母菌株的多種萜類化合物產量；

本發明的另外一個目的在于提供一種包含有上述啟動子序列的重組酵母菌株，使其能夠提高多種萜類化合物的產量。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

一種啟動子，在酵母菌株ALD6啟動子全長序列基礎上，進行如下一項或多項的處理：

(1)敲除一段或多段ALD6啟動子上的保守序列；

(2)敲除一段或多段ALD6啟動子上的包含保守序列的序列；

(3)對一段或多段ALD6啟動子上的保守序列進行突變；

(4)置換一段或多段ALD6啟動子上的保守序列；

(5)置換一段或多段ALD6啟動子上的包含保守序列的序列。

目前酵母菌株ALD6啟動子功能的研究僅局限在乙酸積累方面，而其他方面的功能并未有相關報道，本發明針對目前現狀，從多方面對ALD6啟動子進行研究，發現ALD6啟動子保守序列的缺失、置換、突變可提高萜類化合物生產酵母菌株的產量提高。

作為優選，本發明所述啟動子在酵母菌株ALD6啟動子全長序列基礎上，為進行如下之一項處理后的啟動子：

(1)敲除一段或多段ALD6啟動子上的包含保守序列的序列；

(2)敲除一段ALD6啟動子上的保守序列；

(3)對一段ALD6啟動子上的保守序列進行突變；

(4)敲除一段或多段ALD6啟動子上的包含保守序列的序列，對一段ALD6啟動子上的保守序列進行突變；

(5)采用抗性標簽置換一段或多段ALD6啟動子上的包含保守序列的序列。

作為優選，本發明所述酵母菌株為釀酒酵母，可選自CEN.PK系列釀酒酵母，如釀酒酵母CEN.PK2-1C或釀酒酵母CEN.PK2-1D或釀酒酵母CEN.PK2，也可選自BY系列釀酒酵母，如BY4741釀酒酵母或BY4742釀酒酵母或BY4743釀酒酵母。所有已經被基因組測序的釀酒酵母的ALD6啟動子具備相同的保守序列，并且也具備基本相同的非保守序列，從整體來說，所有釀酒酵母的ALD6啟動子基本相同。其中，上述提及的釀酒酵母CEN.PK2-1C、釀酒酵母CEN.PK2-1D、BY4741釀酒酵母三者具備完全相同的ALD6啟動子序列。

本發明利用啟動子保守序列預測網站UCSC Genome Browser(http://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？hgsid＝471419258_3MF1PADILg7Od OMuaIJ15FmRtAai&command＝start)，對BY4741釀酒酵母ALD6啟動子(序列如SEQ ID NO:1所示)進化保守性預測，結果獲得9段保守序列，如圖1所示中的A啟動子(ALD6全長啟動子)，所述保守序列為ALD6啟動子全長序列中1-377bp(編號為IX)、630-654bp(編號為VIII)、701-787bp(編號為VII)、846-900bp(編號為VI)、916-925bp(編號為V)、941-1116bp(編號為IV)、1184-1205bp(編號為III)、1227-1313bp(編號為II)、1430-1469bp(編號為I)九段保守序列。

由于所述9段保守序列是解決問題的關鍵因素，因此在本發明中敲除包含保守序列在內的序列也可實現預期目的，而所述包含保守序列的序列可以是在保守序列上游、下游或上下游位置連接相鄰的序列，這些相鄰的序列中可以有非保守序列，也可以有其他保守序列，或者兩者兼有，可以是非保守序列或其他保守序列的全部序列，也可以是部分序列。

按照上述描述，包含保守序列的序列有多種形式，在本發明具體實施方式中，可選自1-629bp序列、630-700bp序列、701-845bp序列、846-915bp序列、916-940bp序列、941-1183bp序列、1184-1226bp序列、1227-1429bp序列、1430-1479bp序列、378-654bp序列、655-787bp序列、787-900bp序列、788-900bp序列、901-925bp序列、926-1116bp序列、1117-1205bp序列、1117-1191bp序列、1206-1313bp序列、1314-1469bp序列。

在對相關序列的敲除處理中，本發明按照圖1中A啟動子從左至右的順序，優選進行梯度敲除，即按照敲除IX序列、敲除IX序列+IX下游相鄰的整段非保守序列、敲除IX序列+IX下游相鄰的整段非保守序列+VIII序列、敲除IX序列+IX下游相鄰的整段非保守序列+VIII序列+VIII下游相鄰的整段非保守序列這種逐步疊加序列的方式進行多形式敲除，鑒于數量較多的原因，本發明在此并未全部列舉出所有按照上述描述方式的梯度敲除形式，但本領域技術人員能夠在上述描述的引導下實現其他未列舉的梯度敲除形式，這也是本發明的保護范圍。

在對保守序列的突變處理中，本發明對整段保守序列進行突變，并優選堿基置換突變，在具體實施過程中以堿基轉化突變為例進行了說明，所謂堿基轉換突變即將嘧啶堿基C與T互換、嘌呤堿基A與G互換。

在對相關序列的置換處理中，可選擇不影響酵母菌株萜類化合物生產功能的序列進行置換，在本發明具體實施過程中，本發明結合實際篩選的方便選用抗性標簽進行置換，如KanMX抗性標簽。

為了便于理解本發明技術思路，本發明以舉例但并非限制的方式進行說明，參見圖1的B-L啟動子，各啟動子在全長的A啟動子基礎上進行了敲除、突變以及置換等多種處理方式獲得了符合本發明條件的啟動子。其中，A啟動子為ALD6全長啟動子，共1479bp；B啟動子為敲除IX序列的啟動子；C啟動子為敲除包含IX的序列(1-629bp)的啟動子；D啟動子為敲除包含IX和VIII的序列(1-629bp、630-700bp)的啟動子；E啟動子為對VI整段序列進行堿基轉換突變的啟動子；F啟動子為敲除包含IX、VIII和VII的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp)的啟動子；G啟動子為在F啟動子基礎上對VI整段序列進行堿基轉換突變的啟動子；H啟動子為敲除包含IX、VIII、VII和VI的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp)的啟動子；I啟動子為敲除包含IX、VIII、VII、VI和V的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp)的啟動子；J啟動子為敲除包含IX、VIII、VII、VI、V和IV的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp、941-1183bp)的啟動子；K啟動子為敲除包含IX、VIII、VII、VI、V、IV和III的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp、941-1183bp、1184-1226bp)的啟動子；L啟動子為采用KanMX抗性標簽置換包含VI、V、IV、部分III以及部分VII的序列(787-900bp、901-925bp、926-1116bp、1117-1191bp)的啟動子。

本發明采用上述C、D、E、F、G、H、K、L啟動子為試驗對象，分別替換香葉醇、青蒿二烯、香葉基香葉醇、酵母固醇和番茄紅素等生產用釀酒酵母菌株中的原有ADL6啟動子，然后與原有菌株進行產量對比，結果顯示，采用本發明啟動子后，各菌株相比原有菌株在香葉醇、青蒿二烯、香葉基香葉醇、酵母固醇和番茄紅素產量均得到提高。

同時，為了驗證保守序列是否為主要影響因素，在本發明所述啟動子基礎上保留其相鄰的非保守序列進行對比，結果顯示，兩者在萜類化合物產量上并不明顯差異，表明保守序列在ALD6啟動子上的缺失、置換、突變等為主要影響因素。

基于上述有益效果，本發明提供所述啟動子在構建萜類化合物生產用酵母菌株以及在生產萜類化合物中的應用。其中，所述萜類化合物為香葉醇、青蒿二烯、香葉基香葉醇、酵母固醇、番茄紅素中的一種或多種。

此外，根據試驗結果和應用，本發明提供了一種重組的生產萜類化合物酵母菌株，采用本發明所述啟動子替換原有ALD6啟動子。在實際構建過程中，可以先行構建出需要的所述啟動子，通過酵母的自身同源重組整合到基因組上，也可以在原有ALD6啟動子基礎上直接進行敲除、置換、突變等操作來實現。所述酵母菌株為釀酒酵母菌株，可選自CEN.PK系列釀酒酵母，如釀酒酵母CEN.PK2-1C或釀酒酵母CEN.PK2-1D，也可選自BY系列釀酒酵母，如BY4741釀酒酵母。

由以上技術方案可知，本發明通過對酵母菌株ALD6啟動子的深入研究，發現其保守序列的缺失、置換、突變等情形能夠提高萜類化合物生產用酵母菌株的產量，可作為酵母工程菌合成路徑的優化手段，構建出產能更加優異的重組工程菌。

附圖說明

圖1所示為ALD6全長啟動子以及本發明所述啟動子示意圖；其中，羅馬數字表示ALD6啟動子上的保守序列，英文字母表示各啟動子編號，E和G啟動子中的VI保守序列進行了堿基轉換突變；

圖2所示為基因片段1的基因元件模式圖；其中，兩端TRP1LHA、TRP1RHA分別表示酵母trp1位點上、下游同源序列；

圖3所示為基因片段2的基因元件模式圖；其中，兩端LEU2LHA、LEU2RHA分別表示酵母leu2位點上、下游同源序列；

圖4所示為基因片段3的基因元件模式圖；其中，兩端TRP1LHA、TRP1RHA分別表示酵母trp1位點上、下游同源序列；

圖5所示為基因片段4的基因元件模式圖；其中，兩端LEU2LHA、LEU2RHA分別表示酵母leu2位點上、下游同源序列；

圖6所示為基因片段5的基因元件模式圖；其中，兩端TRP1LHA、TRP1RHA分別表示酵母trp1位點上、下游同源序列；

圖7所示為基因片段6的基因元件模式圖；其中，兩端LEU2LHA、LEU2RHA分別表示酵母leu2位點上、下游同源序列；

圖8所示為不同重組菌株的香葉醇產量柱形圖；其中，A表示含有全長啟動子A的重組菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有對應編號啟動子的重組菌株，橫坐標為香葉醇產量，單位mg/L；

圖9所示為不同重組菌株的青蒿二烯產量柱形圖；其中，A表示含有全長啟動子A的重組菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有對應編號啟動子的重組菌株，橫坐標為青蒿二烯產量，單位mg/L；

圖10所示為不同重組菌株的香葉基香葉醇產量柱形圖；其中，A表示含有全長啟動子A的重組菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有對應編號啟動子的重組菌株，橫坐標為香葉基香葉醇產量，單位mg/L；

圖11所示為不同重組菌株的酵母固醇產量柱形圖；其中，A表示含有全長啟動子A的重組菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有對應編號啟動子的重組菌株，橫坐標為酵母固醇產量，單位mg/g DCW；

圖12所示為不同重組菌株的番茄紅素產量柱形圖；其中，A表示含有全長啟動子A的重組菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有對應編號啟動子的重組菌株，橫坐標為番茄紅素產量，單位mg/g DCW。

具體實施方式

本發明公開了一種啟動子以及重組酵母菌株，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述啟動子和菌株已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述啟動子和菌株進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。

在本發明具體實施方式中，為了便于搖瓶發酵試驗的進行，本發明采用了釀酒酵母CEN.PK2-1C，其為四重營養缺陷型(亮氨酸、色氨酸、組氨酸、尿嘧啶)釀酒酵母，利于篩選正確菌株，同時為了保證釀酒酵母不消耗誘導劑半乳糖，本發明敲除了釀酒酵母中的gal1、gal7和gal10三個基因，上述的這些對酵母的改動只是為了方便驗證試驗的進行，對最終效果的實現無影響。

同時，釀酒酵母CEN.PK2-1C本身不具備生產萜類化合物的能力，缺少部分酶，需要構建外源基因元件導入其中成為生產菌株。其中，發酵生產香葉醇的酵母菌株需包含經酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：

酵母trp1位點上游同源序列、GAL1啟動子、香葉醇合成酶編碼基因GES、PGK1終止子、酵母trp1位點下游同源序列順次拼接而成的基因片段1，示意圖見圖2，香葉醇合成酶編碼基因GES來源于長春花(Catharanthusroseus)；

酵母leu2位點上游同源序列、LEU2標記、ACT1終止子、截短的HMG-CoA還原酶基因tHMGR1、GAL10啟動子、酵母leu2位點下游同源序列順次拼接而成的基因片段2，示意圖見圖3。

發酵生產青蒿二烯的酵母菌株需包含經酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：

酵母leu2位點上游同源序列、LEU2標記、ACT1終止子、截短的HMG-CoA還原酶基因tHMGR1、GAL10啟動子、酵母leu2位點下游同源序列順次拼接而成的基因片段2；

酵母trp1位點上游同源序列、GAL1啟動子、青蒿二烯合成酶編碼基因ADS、PGK1終止子、酵母trp1位點下游同源序列順次拼接而成的基因片段3，示意圖見圖4，青蒿二烯合成酶編碼基因ADS來源于青蒿(Artemisia annua)。

發酵生產香葉基香葉醇的酵母菌株需包含經酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：

酵母leu2位點上游同源序列、LEU2標記、ACT1終止子、截短的HMG-CoA還原酶基因tHMGR1、GAL10啟動子、GAL1啟動子、香葉基香葉醇合成酶編碼基因GGPPS、GPM1終止子、酵母leu2位點下游同源序列順次拼接而成的基因片段4，示意圖見圖5，香葉基香葉醇合成酶編碼基因GGPPS來源于曼地亞紅豆杉(Taxus x media)。

發酵生產酵母固醇的酵母菌株需包含經酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：

酵母leu2位點上游同源序列、LEU2標記、ACT1終止子、截短的HMG-CoA還原酶基因tHMGR1、GAL10啟動子、酵母leu2位點下游同源序列順次拼接而成的基因片段2。

發酵生產番茄紅素的酵母菌株需包含經酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：

CN105087406A中的基因片段1，在本發明中命名為基因片段5，示意圖見圖6，其中基因crtB的來源為成團泛菌(Pantoea agglomerans)，記為PacrtB，基因crtI的來源為三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)，記為Bt crtI：

CN105087406A中的基因片段2，在本發明中命名為基因片段6，示意圖見圖7，基因crtE的來源為成團泛菌(Pantoea agglomerans)，記為PacrtE，如SEQ ID NO:5所示：

如果需要同時發酵生產上述多種目標產物，按照需要引入的基因片段逐一引入即可。上述各基因元件、同源序列等均以釀酒酵母菌株BY4741的基因組為模板，設計并合成合適的引物，通過PCR擴增得到，具體可參照專利CN105087406A中的記載；異源基因均為經過密碼子優化并適當規避常用限制性酶切位點后通過人工合成得到，其中來源于長春花(Catharanthusroseus)的香葉醇合成酶編碼基因GES序列如SEQ ID NO:2所示，來源于青蒿(Artemisia annua)的青蒿二烯合成酶編碼基因ADS如SEQ ID NO:3所示，來源于曼地亞紅豆杉(Taxus x media)的香葉基香葉醇合成酶編碼基因GGPPS如SEQ ID NO:4所示。

下面結合實施例，進一步闡述本發明。

實施例1：本發明所述啟動子

在ALD6全長啟動子基礎上按照以下方式獲得對應的啟動子：

B啟動子為敲除IX序列的啟動子；

C啟動子為敲除包含IX的序列(1-629bp)的啟動子；

D啟動子為敲除包含IX和VIII的序列(1-629bp、630-700bp)的啟動子；

E啟動子為對VI整段序列進行堿基轉換突變的啟動子；

F啟動子為敲除包含IX、VIII和VII的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp)的啟動子；

G啟動子為在F啟動子基礎上對VI整段序列進行堿基轉換突變的啟動子；

H啟動子為敲除包含IX、VIII、VII和VI的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp)的啟動子；

I啟動子為敲除包含IX、VIII、VII、VI和V的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp)的啟動子；

J啟動子為敲除包含IX、VIII、VII、VI、V和IV的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp、941-1183bp)的啟動子；

K啟動子為敲除包含IX、VIII、VII、VI、V、IV和III的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp、941-1183bp、1184-1226bp)的啟動子；

L啟動子為采用KanMX抗性標簽置換包含VI、V、IV、部分III以及部分VII的序列(787-900bp、901-925bp、926-1116bp、1117-1191bp)的啟動子。

上述中各啟動子在獲知其序列基礎上可進行全合成獲得，也可通過引物擴增獲得ALD6啟動子，并按照常規的敲除方法、置換方法和突變方法進行處理，獲得對應啟動子。

實施例2：搖瓶發酵試驗(全長啟動子與本發明啟動子之間的對比)

1、試驗菌株的構建

基礎菌株：

參照專利CN105087406A中的記載，敲除釀酒酵母CEN.PK2-1C中gal1、gal7、gal10三個基因，構建得到重組釀酒酵母菌株A(對照菌株，對應于全長啟動子A)；

參照專利CN105087406A中的記載，敲除釀酒酵母CEN.PK2-1C中gal1、gal7、gal10三個基因，將實施例1中的C、D、E、F、G、H、K、L啟動子通過酵母同源重組替換原有ALD6啟動子，構建得到重組釀酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L，對應于各自啟動自編號；

香葉醇生產菌株：

在重組釀酒酵母菌株A基礎上整合基因片段1和基因片段2，得到香葉醇生產菌株A；

在重組釀酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基礎上整合基因片段1和基因片段2，得到香葉醇生產菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

青蒿二烯生產菌株：

在重組釀酒酵母菌株A基礎上整合基因片段3和基因片段2，得到青蒿二烯生產菌株A；

在重組釀酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基礎上整合基因片段3和基因片段2，得到青蒿二烯生產菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

香葉基香葉醇生產菌株：

在重組釀酒酵母菌株A基礎上整合基因片段4，得到香葉基香葉醇生產菌株A；

在重組釀酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基礎上整合基因片段4，得到香葉基香葉醇生產菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

酵母固醇生產菌株：

在重組釀酒酵母菌株A基礎上整合基因片段2，得到酵母固醇生產菌株A；

在重組釀酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基礎上整合基因片段2，得到酵母固醇生產菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

番茄紅素生產菌株：

在重組釀酒酵母菌株A基礎上整合基因片段5和6，得到番茄紅素生產菌株A；

在重組釀酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基礎上整合基因片段5和6，得到番茄紅素生產菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

采用醋酸鋰法將上述相應基因片段分別轉化到各菌株，通過trp1或leu2上、下游同源序列與酵母基因組上trp1或leu2位點發生重組而整合到基因組上。轉化后采用SD-TRP或SD-LEU固體板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，單缺色氨酸或亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養后提取酵母基因組進行PCR驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名。

2、基因片段的構建

基因片段1、基因片段3、基因片段5參照專利CN105087406A實施例3的方法，采用對應的基因元件制備獲得；

基因片段2、基因片段4、基因片段6參照專利CN105087406A實施例4的方法，采用對應的基因元件制備獲得；

3、發酵方法

種子培養基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

發酵培養基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。

(注：對于香葉醇、青蒿二烯、香葉基香葉醇生產菌株，發酵培養基還要添加20％的正十二烷)

將上述菌株接種于5mL種子培養基中，在30℃、250rpm培養14-16h，以初始菌體濃度OD₆₀₀＝0.2轉接于新鮮的25mL種子培養基中，于30℃、250rpm條件下培養至對數生長中期，以初始菌體濃度OD₆₀₀＝0.5分別接種于50mL發酵培養基中，于30℃、250rpm條件下培養，監測發酵過程中的菌體密度(OD₆₀₀)及產量。

4、產量檢測

香葉醇、青蒿二烯、香葉基香葉醇：發酵48小時后，發酵液12000g離心5min后取上層有機相，用正己烷稀釋后進行GC-MS檢測。

酵母固醇：發酵48小時后，取兩等份的發酵液，4000g離心2min收集菌體，并水洗兩次。將其中一份菌體置于80℃烘干至恒重，稱重計算細胞干重；另一份菌體用以產物提取，具體方法為：用1mL 2N NaOH重懸細胞，置于沸水浴中煮沸10min，然后立即冰浴3min；將破碎的細胞12000rpm、4℃離心4min棄上清，加入300uL含1.5M NaOH的甲醇溶液，60℃皂化4h，加入300uL正己烷渦旋振蕩10min，離心收集有機相；水相再加300uL正己烷渦旋繼續振蕩10min，最后離心收集有機相。將收集的有機相真空冷凍干燥后，加入100ul衍生化試劑MSTFA 30℃孵育2h，最后用正己烷稀釋后進行GC-MS檢測。

番茄紅素：發酵48小時后，取兩等份的發酵液，4000g離心2min收集菌體，并水洗兩次。將其中一份菌體置于80℃烘干至恒重，稱重計算細胞干重；另一份菌體用以產物提取，具體方法為：用3N HCl重懸細胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；將破碎的細胞12000rpm、4℃離心4min棄上清，水洗2次后加入丙酮，并渦旋5min；最后離心收集丙酮相，用2μm濾膜過濾后上紫外液相檢測，番茄紅素檢測波長為471nm。

5、結果

結果見圖8-圖12，可以明顯看出，原有菌株中含有ALD6全長啟動子，即A啟動子，其在香葉醇、青蒿二烯、香葉基香葉醇、酵母固醇、番茄紅素各萜類物質產量中較低，而替換為本發明各啟動子后，各萜類物質產量得到提高。

實施例3：搖瓶發酵試驗(去除保守序列以及去除含有該保守序列的序列啟動子之間的對比)

為了驗證保守序列是主要影響因素，本發明提供如下幾組區別僅在于是否有非保守序列的啟動子，并按照實施例2中的方式構建重組菌株進行各萜類物質產量的對比，結果見表1。

第1組：啟動子B和啟動子C，區別在于啟動子B比啟動子C多出一段378-629bp的非保守序列；

第2組：啟動子I和啟動子I+926-940bp非保守序列；

第3組：啟動子J和啟動子J+1117-1183bp非保守序列；

表1

由表1可以看出，各組之間的產量差異并不明顯，說明對保守序列進行處理能夠實現萜類物質產量的提高，而非保守序列對此無顯著影響。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大學

<120> 一種啟動子以及重組酵母菌株

<130> MP1701567

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accaagttcc cgctcgattt gattcatgaa gaaggacaaa agaactattt aatgttcatg 60

aagatgattg aggaagaaaa ggaaaaaatt agaatacagc aggagcaaat gggcgggcaa 120

acatttacgc tgaaagacta tgttgaaggt aacttgcctt cgccagaaga acaaatgaaa 180

atacaattgg agaagcagaa ggaggtagac gccttatttg aagaggaaaa gaaaaagaag 240

aagattgctg aatccaaata attttcatgt aaaccctctt ctcatgtatc tacgtatcta 300

tgtgtgtatg taaatgtacc tgtacactcc ccacaccctc attttgttac tgtcatgtga 360

ataaaactta tgtatattgc taacttacta ccactgcacc tcctaacatc accatactac 420

gtacaaacac gcctatttat tttttctatg ttaaatttta acgatgtaga cacacctaat 480

gatctgatgc gctttgcata tctcatattc cttcactagc ataaaaatcc aaaaaaaaag 540

aatatttagg ccgaatggaa ttattcgtaa cgtcatacga aaaaagtttc aattcgtaca 600

atgcctggca tgttcattcg aatataaggc cgccgccttc cagtcagggt agccaaaagt 660

ataatcccgg gtggaaacta aactaaaaac cgtactcaca actttccgcg gacgctaaca 720

gacaaataga cacactatca ggtcaggaac tgccgtcaca tacgacactg cccctcacgt 780

aagggcatga tagaattgga ttatgtaaaa ggtgaagata ccattgtaga agcaaccagc 840

acgtcgccgt ggctgatgag gtctcctctt gcccgggccg cagaaaagag gggcagtggc 900

ctgtttttcg acataaatga ggggcatggc cagcaccgag acgtcattgt tgcatatggc 960

gtatccaagc cgaaacggcg ctcgcctcat ccccacggga ataaggcagc cgacaaaaga 1020

aaaacgaccg aaaaggaacc agaaagaaaa aagagggtgg gcgcgccgcg gacgtgtaaa 1080

aagatatgca tccagcttct atatcgcttt aactttaccg ttttgggcat cgggaacgta 1140

tgtaacattg atctcctctt gggaacggtg agtgcaacga atgcgatata gcaccgacca 1200

tgtgggcaaa ttcgtaataa attcggggtg agggggattc aagacaagca accttgttag 1260

tcagctcaaa cagcgattta acggttgagt aacacatcaa aacaccgttc gaggtcaagc 1320

ctggcgtgtt taacaagttc ttgatatcat atataaatgt aataagaagt ttggtaatat 1380

tcaattcgaa gtgttcagtc ttttacttct cttgttttat agaagaaaaa acatcaagaa 1440

acatctttaa catacacaaa cacatactat cagaataca 1479

<210> 2

<211> 1146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcttact ctgctatggc aactatgggt tataatggta tggctgcatc ttgtcatact 60

ttgcatccaa catcaccatt aaaaccattt catggtgcat ctacatcatt ggaagctttt 120

aatggtgaac atatgggttt gttgagaggt tactctaaga gaaagttgtc ttcatacaag 180

aacccagctt caagatcttc aaatgctact gttgcacaat tgttgaatcc accacaaaag 240

ggtaaaaagg cagttgaatt cgatttcaat aagtacatgg attctaaagc tatgacagtt 300

aatgaagcat tgaataaggc tattccatta agatatccac aaaagatata tgaatctatg 360

agatactcat tgttagctgg tggtaaaaga gttagaccag ttttgtgtat tgctgcatgt 420

gaattagttg gtggtactga agaattggct attccaacag cttgtgcaat cgaaatgatc 480

catactatgt ctttgatgca tgatgatttg ccatgtatcg ataacgatga tttgagaaga 540

ggtaaaccaa caaaccataa gatcttcggt gaagatactg ctgttacagc tggtaatgct 600

ttgcattcat acgcattcga acatatcgct gtttctactt caaaaacagt tggtgcagat 660

agaatcttga gaatggtttc tgaattaggt agagctactg gttcagaagg tgttatgggt 720

ggtcaaatgg ttgatattgc atctgaaggt gacccatcaa tcgatttgca aactttggaa 780

tggatccata tccataagac agctatgttg ttggaatgtt ctgttgtttg tggtgcaatt 840

attggtggtg cttcagaaat cgttatcgaa agagcaagaa gatacgctag atgtgttggt 900

ttgttgttcc aagttgttga tgatatctta gatgttacta agtcttcaga tgaattgggt 960

aaaacagctg gtaaagattt gatctctgat aaggctacat acccaaagtt gatgggttta 1020

gaaaaggcaa aggaattttc tgatgaattg ttgaacagag ctaagggtga attgtcatgt 1080

tttgatccag ttaaagctgc accattgtta ggtttggcag attacgttgc ttttagacaa 1140

aattaa 1146

<210> 3

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtctttga ctgaagaaaa gccaatcaga ccaatcgcta acttcccacc atctatctgg 60

ggtgaccaat tcttgatcta cgaaaagcaa gttgaacaag gtgttgaaca aatcgttaac 120

gacttgaaga aggaagttag acaattgttg aaggaagctt tggacatccc aatgaagcac 180

gctaacttgt tgaagttgat cgacgaaatc caaagattgg gtatcccata ccacttcgaa 240

agagaaatcg accacgcttt gcaatgtatc tacgaaactt acggtgacaa ctggaacggt 300

gacagatctt ctttgtggtt cagattgatg agaaagcaag gttactacgt tacttgtgac 360

gttttcaaca actacaagga caagaacggt gctttcaagc aatctttggc taacgacgtt 420

gaaggtttgt tggaattgta cgaagctact tctatgagag ttccaggtga aatcatcttg 480

gaagacgctt tgggtttcac tagatctaga ttgtctatca tgactaagga cgctttctct 540

actaacccag ctttgttcac tgaaatccaa agagctttga agcaaccatt gtggaagaga 600

ttgccaagaa tcgaagctgc tcaatacatc ccattctacc aacaacaaga ctctcacaac 660

aagactttgt tgaagttggc taagttggaa ttcaacttgt tgcaatcttt gcacaaggaa 720

gaattgtctc acgtttgtaa gtggtggaag gctttcgaca tcaagaagaa cgctccatgt 780

ttgagagaca gaatcgttga atgttacttc tggggtttgg gttctggtta cgaaccacaa 840

tactctagag ctagagtttt cttcactaag gctgttgctg ttatcacttt gatcgacgac 900

acttacgacg cttacggtac ttacgaagaa ttgaagatct tcactgaagc tgttgaaaga 960

tggtctatca cttgtttgga cactttgcca gaatacatga agccaatcta caagttgttc 1020

atggacactt acactgaaat ggaagaattc ttggctaagg aaggtagaac tgacttgttc 1080

aactgtggta aggaattcgt taaggaattc gttagaaact tgatggttga agctaagtgg 1140

gctaacgaag gtcacatccc aactactgaa gaacacgacc cagttgttat catcactggt 1200

ggtgctaact tgttgactac tacttgttac ttgggtatgt ctgacatctt cactaaggaa 1260

tctgttgaat gggctgtttc tgctccacca ttgttcagat actctggtat cttgggtaga 1320

agattgaacg acttgatgac tcacaaggct gaacaagaaa gaaagcactc ttcttcttct 1380

ttggaatctt acatgaagga atacaacgtt aacgaagaat acgctcaaac tttgatctac 1440

aaggaagttg aagacgtttg gaaggacatc aacagagaat acttgactac taagaacatc 1500

ccaagaccat tgttgatggc tgttatctac ttgtgtcaat tcttggaagt tcaatacgct 1560

ggtaaggaca acttcactag aatgggtgac gaatacaagc acttgatcaa gtctttgttg 1620

gtttacccaa tgtctatcta a 1641

<210> 4

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcttata ccgcaatggc agcaggaact cagtcattgc agttgaggac agtcgcctct 60

taccaggagt gcaactcaat gaggtcttgc ttcaagttga ccccattcaa gtcattccac 120

ggtgtcaact tcaacgttcc ttctttaggt gccgccaact gcgaaatcat gggtcacttg 180

aaattgggtt ctttgccata caaacagtgt tcagtatcat ctaagtcaac taagactatg 240

gcccagttgg tagatttggc agagaccgag aaagccgagg gaaaggatat cgagttcgat 300

tttaacgagt atatgaagtc taaggctgtc gctgttgatg cagccttgga taaggccatc 360

cctttggagt atccagagaa gatccatgag tctatgaggt actcattgtt ggccggagga 420

aaaagggtca gacctgcatt atgcatcgct gcttgcgagt tagtaggtgg ttctcaggac 480

ttggccatgc caaccgcatg tgccatggaa atgattcata ccatgtcatt gattcacgat 540

gatttgcctt gcatggacaa cgacgacttc agaaggggaa agcctaccaa tcacaaggtt 600

ttcggagagg acactgctgt tttagccggt gacgcattgt tatctttcgc ttttgaacac 660

atcgccgttg ccacatcaaa aactgtccca tctgacagga ccttgagagt catttctgag 720

ttgggtaaaa ccatcggttc acagggattg gtcggaggtc aggtagtcga catcacttct 780

gagggagacg ccaacgtcga cttaaagaca ttggagtgga ttcacattca caagactgcc 840

gtcttgttgg aatgctctgt tgtttctgga ggaatcttgg gtggagctac cgaggatgag 900

attgctagaa taagaagata cgccaggtgc gtcggtttgt tgttccaggt tgtcgacgac 960

attttggatg tcaccaagtc ttcagaggaa ttgggaaaga ccgccggtaa agacttattg 1020

accgacaagg ctacctaccc taagttgatg ggtttggaga aggccaaaga gtttgcagca 1080

gaattagcta ccagggcaaa ggaagagttg tcatcattcg accagatcaa ggcagcccct 1140

ttgttaggat tggccgatta catcgctttc aggcaaaact aa 1182

<210> 5

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtttctg gttctaaggc tggtgtctca ccacacaggg agattgaggt catgaggcag 60

tctattgacg atcacttggc tggtttgttg cctgagactg actctcagga cattgtctca 120

ttggcaatga gggagggtgt catggctcca ggtaagagga taaggccttt gttgatgttg 180

ttggcagcta gggacttgag gtaccagggt tctatgccta ctttgttgga cttggcttgc 240

gctgtcgaat tgactcacac tgcatcattg atgttggacg acatgccttg catggacaac 300

gcagaattaa ggaggggtca gccaacaaca cacaagaagt tcggtgagtc agtcgcaatt 360

ttggcatcag ttggtttgtt atcaaaggct ttcggattga ttgctgcaac tggtgactta 420

ccaggtgaga ggagggcaca ggctgtcaac gagttgtcta ctgctgtcgg agtccaggga 480

ttggtcttgg gtcagttcag ggacttgaac gacgcagctt tggacaggac tccagacgct 540

atattgtcta caaaccactt aaagacagga attttgttct ctgctatgtt gcagatagtc 600

gctattgcat ctgcttcttc tccatctaca agggagactt tgcacgcttt cgcattggac 660

ttcggtcagg ctttccagtt gttggacgac ttgagggacg atcacccaga gacaggaaag 720

gacaggaaca aggatgcagg taaatcaact ttggtcaaca ggttaggtgc agacgctgct 780

aggcagaagt taagggagca cattgactct gctgacaagc acttgacttt cgcttgccca 840

cagggaggtg ctattaggca gttcatgcac ttgtggttcg gtcaccactt agctgactgg 900

tcacctgtca tgaagatagc ttaa 924