本發明屬于生物化工領域，特別涉及一種酶法制備甘露糖-6-磷酸的方法。
背景技術：
甘露糖-6-磷酸（英語：Mannose-6-phosphate，M6P）是一個在免疫系統中與凝集素結合的分子，M6P可由磷酸甘露糖異構酶轉化為果糖-6-磷酸。在蛋白質代謝過程中，與細胞核內體、細胞膜和細胞外分泌物有關的蛋白質必須經過修飾才能轉運到細胞中的最終位置。6-磷酸甘露糖(mannose-6-phosphate,M-6-P)就是廣泛存在于生命體中的與蛋白質修飾密切相關的磷酸化糖類化合物。M-6-P與其相應的受體6-磷酸甘露糖受體(mannose-6-phosphate receptor,M-6-P receptor)結合，在溶酶體酶發生效應的過程中起著重要的作用，M-6-P是溶酶體酶的分揀員和投送員。
專利號201080035798.3中提到了甘露糖-6-磷酸及其鹽、其前體或其類似物有減少皮膚發紅的用途，同時具有美容效果，并且能夠加快受損皮膚的愈合。近年來，以M-6-P為前體的藥物研究日益受到關注，人們對于M-6-P的需求也隨之提升。因此，尋找一種大規模生產M-6-P的方法是非常有必要的。
目前，人們大多數采用化學法來合成M-6-P的類似物，而利用酶法來合成M-6-P非常的少。化學法基本都是以甲基α-D-吡喃甘露糖苷或者甲基2,3,4-三-O-b苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷為起始物經過3-5步的合成步驟，形成與M-6-P具有相似結構的類似物。合成過程所需要的條件比較苛刻，需要低溫環境或者需要重金屬或有毒試劑的參與，并且總回收率也不高。
相比于化學法合成M-6-P的類似物來說，酶法合成M-6-P具有催化效率高、反應條件溫和的優點，且無需有機試劑以及重金屬的參與，更加有利于后期的藥物合成。
本發明提供了一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，通過對D-甘露糖制備工藝參數，酶促反應合成甘露糖-6-磷酸工藝參數的優化，使得原料選擇更加簡單，工藝流程明了詳細，合成效率更好，同時制備得到的甘露糖-6-磷酸的純度更高，達到99%以上。
本發明的技術方案如下：
一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，包括以下步驟：
(1)D-甘露糖的制備：a.將摩爾比(1-10)：(1-2)葡萄糖和果糖用純化水稀釋到濃度25-65％(質量)，加入催化劑鉬酸鹽，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質量之和的比值為0.1-1：50，在50-110℃的真空條件下進行差向異構，得到的異構混合液；b.將步驟a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，進行脫鹽精制后進入模擬移動床進行分離提純，得到富含甘露糖的組分A和其他組分B；將其他組分B返回到步驟a進行差向異構；c將步驟b得到的富含甘露糖的組分A，進行一次蒸發然后加入活性炭進行脫色，經脫色處理后，進行二次蒸發，得到料液，該料液進行水相結晶，結晶過程中的降溫梯度控制：0～6小時，每小時降0.5-1℃；7～18小時，每小時降1-2℃；19小時以后，每小時降0.5-1℃，直至降至20～30℃，結晶后經離心精制，得到粗品結晶D-甘露糖，以20-40％的無水乙醇對粗D-甘露糖進行15-60分鐘浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品;
(2) 配制反應液，將步驟(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉、MgCl2溶解在去離子水中，用Tris-Hcl緩沖液調節pH值；其中D-甘露糖濃度為300-800mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉濃度為500-1500mmol/L，MgCl2濃度為10-100mmol/L，pH值為4-9；
(3)加入己糖激酶混合，然后將其置于反應溫度15-50℃的搖床上反應，100rpm震蕩溫育使之進行轉化反應5-48小時；
(4)加入活性炭脫色，過濾；
(5)加入KOH，然后利用SSMB進行分離提純，濃縮，干燥即得。
優選地，步驟(1)中，葡萄糖和果糖的摩爾比(9-10)：(1-1.2)，用純化水稀釋到濃度38％(質量)，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質量之和的比值為0.8-1：50。
優選地，步驟(2)中，D-甘露糖濃度為500-800mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉濃度為500-1200mmol/L，-甘露糖與腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉摩爾比為1：2.3。
優選地，步驟(2)中，MgCl2濃度為D-甘露糖濃度的1/3-1/9。
優選地，步驟(2)中，pH值為6.5-8.8。
優選地，腺苷三磷酸鈉鹽與六偏磷酸鈉摩爾比為1-10：10-1。
本發明具有以下有益效果：
(1)本發明使用酶法合成M-6-P，相比于化學法合成M-6-P的類似物來說，酶法合成M-6-P具有催化效率高、反應條件溫和、高效、綠色安全等優點，且只需從市場獲得己糖激酶即可以作為原料，利于工業化生產；
(2)本發明通過對D-甘露糖制備工藝參數，酶促反應合成甘露糖-6-磷酸工藝參數的優化，使得原料選擇更加簡單，工藝流程明了詳細，合成效率更好，同時制備得到的甘露糖-6-磷酸的純度更高，達到99%以上。
本發明的其它特征和優點將在隨后的說明書中闡述，并且部分地從說明書中變得顯而易見，或者通過實施本發明而了解。本發明的主要目的和其它優點可通過在說明書、權利要求書中所特別指出的方案來實現和獲得。
附圖說明
附圖僅用于示出具體實施例的目的，而并不認為是對本發明的限制，在整個附圖中，相同的參考符號表示相同的部件。
圖1為利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的工藝流程圖。
具體實施方式
實施例1
一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)D-甘露糖的制備：a.將摩爾比8：1葡萄糖和果糖用純化水稀釋到濃度40％(質量)，加入催化劑鉬酸鹽，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質量之和的比值為0.2：50，在65℃的真空條件下進行差向異構，得到的異構混合液；b.將步驟a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，進行脫鹽精制后進入模擬移動床進行分離提純，得到富含甘露糖的組分A和其他組分B；將其他組分B返回到步驟a進行差向異構；c將步驟b得到的富含甘露糖的組分A，進行一次蒸發然后加入活性炭進行脫色，經脫色處理后，進行二次蒸發，得到料液，該料液進行水相結晶，結晶過程中的降溫梯度控制：0～6小時，每小時降0.5℃；7～18小時，每小時降1.5℃；19小時以后，每小時降0.5℃，直至降至26℃，結晶后經離心精制，得到粗品結晶D-甘露糖，以35％的無水乙醇對粗D-甘露糖進行40分鐘浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品；
(2) 配制反應液，將步驟(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸鈉鹽、MgCl2溶解在去離子水中，用Tris-Hcl緩沖液調節pH值；其中D-甘露糖濃度為500mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉濃度為1300mmol/L，MgCl2濃度為12mmol/L，pH值為6；
(3)加入己糖激酶（商業購買，sigma公司生產CAS：9001-51-8）混合，然后將其置于反應溫度30℃的搖床上反應，100rpm震蕩溫育使之進行轉化反應36小時；
(4)加入活性炭脫色，過濾；
(5)加入KOH，然后利用SSMB進行分離提純，濃縮，干燥即得。
轉化率達到90%以上，提純后的甘露糖-6-磷酸的純度達到99.2%。
實施例2
一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，包括以下步驟：
(1)D-甘露糖的制備：a.將摩爾比8：1葡萄糖和果糖用純化水稀釋到濃度30％(質量)，加入催化劑鉬酸鹽，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質量之和的比值為1：50，在80℃的真空條件下進行差向異構，得到的異構混合液；b.將步驟a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，進行脫鹽精制后進入模擬移動床進行分離提純，得到富含甘露糖的組分A和其他組分B；將其他組分B返回到步驟a進行差向異構；c將步驟b得到的富含甘露糖的組分A，進行一次蒸發然后加入活性炭進行脫色，經脫色處理后，進行二次蒸發，得到料液，該料液進行水相結晶，結晶過程中的降溫梯度控制：0～6小時，每小時降1℃；7～18小時，每小時降2℃；19小時以后，每小時降1℃，直至降至22℃，結晶后經離心精制，得到粗品結晶D-甘露糖，以25％的無水乙醇對粗D-甘露糖進行50分鐘浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品；
(2) 配制反應液，將步驟(1)制得的D-甘露糖、六偏磷酸鈉、MgCl2溶解在去離子水中，用Tris-Hcl緩沖液調節pH值；其中D-甘露糖濃度為350mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉濃度為780mmol/L，MgCl2濃度為40mmol/L，pH值為8.5；
(3)加入己糖激酶（商業購買，品牌：星科生物 ）混合，然后將其置于反應溫度40℃的搖床上反應，100rpm震蕩溫育使之進行轉化反應20小時；
(4)加入活性炭脫色，過濾；
(5)加入KOH，然后利用SSMB進行分離提純，濃縮，干燥即得。
轉化率達到90%以上，提純后的甘露糖-6-磷酸的純度達到99.35%。
實施例3
一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，包括以下步驟：
(1)D-甘露糖的制備：a.將摩爾比2：1葡萄糖和果糖用純化水稀釋到濃度33％(質量)，加入催化劑鉬酸鹽，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質量之和的比值為0.2：50，在55℃的真空條件下進行差向異構，得到的異構葡萄糖、果糖、甘露糖混合液；b.將步驟a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，進行脫鹽精制后進入模擬移動床進行分離提純，得到富含甘露糖的組分A和其他組分B；將其他組分B返回到步驟a進行差向異構；c將步驟b得到的富含甘露糖的組分A，進行一次蒸發然后加入活性炭進行脫色，經脫色處理后，進行二次蒸發，得到料液，該料液進行水相結晶，結晶過程中的降溫梯度控制：0～6小時，每小時降0.8℃；7～18小時，每小時降1.2℃；19小時以后，每小時降1℃，直至降至25℃，結晶后經離心精制，得到粗品結晶D-甘露糖，以28％的無水乙醇對粗D-甘露糖進行55分鐘浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品；
(2) 配制反應液，將步驟(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸鈉鹽和六偏磷酸鈉、MgCl2溶解在去離子水中，用Tris-Hcl緩沖液調節pH值；其中D-甘露糖濃度為400mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽濃度為400mmol/L，六偏磷酸鈉濃度為250mmol/L，MgCl2濃度為25mmol/L，pH值為7.5；
(3)加入己糖激酶（商業購買，品牌：星科生物 ）混合，然后將其置于反應溫度30℃的搖床上反應，100rpm震蕩溫育使之進行轉化反應35小時；
(4)加入活性炭脫色，過濾；
(5)加入KOH，然后利用SSMB進行分離提純，濃縮，干燥即得。
轉化率達到90%以上，提純后的甘露糖-6-磷酸的純度達到99.5%。
上所述僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內所想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。