一種利用污泥蛋白為酶解助劑促進木質纖維素酶解糖化的方法與流程

本發明屬于木質纖維素酶解領域，涉及一種利用污泥蛋白為酶解助劑促進木質纖維素酶解糖化的方法。

背景技術：

木質纖維素是廉價且豐富的可再生資源。隨著能源危機的不斷嚴峻及人們對環境問題的日益重視，高效開發木質纖維素生物質資源已受到國內外學者的廣泛重視。木質纖維素水解糖化是其資源利用過程中的關鍵環節。在眾多水解方法中，酶解具有徹底、條件溫和、副產物少、環保、糖損耗低等特點備受青睞。但由于木質纖維素的結構與組成復雜，纖維素酶壽命短、穩定性差、活性低等缺陷，致使木質纖維素酶解糖化效率低、成本高。為此世界各國學者開展了大量研究致力于解決上述問題。例如利用PEG4000(0.5％～2％w/v)強化玉米芯酶解，纖維素的轉化率隨著PEG4000比例的增加而增大，Li J.H.,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2012,89,1；吳澤等通過設計一種臥式平推流酶解反應器，在低能耗、高傳質的環境下實現酶解工藝的連續化，吳澤，纖維素科學與技術，2013，21，2；Zhang通過白腐菌聯合堿預處理協同強化楊木的酶解糖化作用，效果顯著，Zhang Liming,et al.,Industrial Crops and Products,2016,86。綜上所述，這些方法均在一定程度上強化了木質纖維素的酶解效率，但是酶解糖化成本并沒有降低，相反加入的酶解助劑又額外增加了投入成本，同時纖維素酶的活性也并沒有顯著提高。

對于污泥蛋白，來源于城市污泥，主要作為發泡劑使用，目前還沒有用于酶解助劑的研究。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術中存在的問題，提供一種利用污泥蛋白為酶解助劑促進木質纖維素酶解糖化的方法，采用污泥蛋白作為酶解助劑，成本低，強化木質纖維素酶解糖化效率。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

包括以下步驟：

1)將木質纖維素生物質粉碎過篩，得到木質纖維素生物質粉；將木質纖維素生物質粉浸泡于去離子水中，充分浸泡后分離出木質纖維素生物質粉；

2)取城市污泥調節pH值為9～12，再經超聲處理后冷卻至室溫，分離出上清液并干燥得到污泥蛋白粉；

3)向步驟1)中分離得到的木質纖維素生物質粉中加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液混合均勻，得到混合溶液，再向混合溶液中加入纖維素酶和污泥蛋白粉，得到酶解液；其中，木質纖維素生物質粉和纖維素酶的比為1g：(5～20)FPU，污泥蛋白粉和混合溶液的質量體積比為(0.5～2.5)mg：1mL；酶解液在35～50℃進行酶解反應25～48h，完成利用污泥蛋白為酶解助劑促進木質纖維素的酶解糖化。

進一步地，步驟1)中木質纖維素生物質采用雜交楊木屑；過篩采用的40～80目篩網。

進一步地，步驟1)中浸泡時間為1～4h。

進一步地，步驟2)中用氧化鈣或氫氧化鈣調節pH值；制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏備用。

進一步地，步驟2)中超聲處理是在108W和20.024kHz的超聲波作用下反應20～40min。

進一步地，步驟2)中分離是在3000r/min離心分離10～15min。

進一步地，步驟2)中上清液于25～40℃干燥5d得污泥蛋白粉。

進一步地，步驟3)中每0.5克木質纖維素生物質中加入5～10mL的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

進一步地，步驟3)中檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的濃度為0.075mol/L，pH值為4.8。

與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：

1、本發明方法采用污泥蛋白作為酶解助劑，污泥蛋白的加入降低了木質素對纖維素酶的非特異性吸收，節省了纖維素酶的用量；同時污泥蛋白還能降低酶的熱失活，保證酶的活性；此外，在污泥蛋白表面活性的作用下，大大降低了酶與氣液界面的接觸，避免了纖維素酶的損耗。2、在強化木質纖維素酶解糖化的同時，也實現了污泥的資源化利用，使其變廢為寶，減少了環境污染，有效的解決了污泥處理處置問題。3、通過污泥蛋白的加入，在達到強化木質纖維素酶解糖化效率的同時，還簡化了生物質的預處理工序與成本。并且污泥蛋白加入后，可在更短的時間內(＜50h)達到較高的效率，而目前的研究均要在90h甚至100h以上才能達到相同高度的酶解率，本方法縮短了反應時間，有效降低了水解單糖因過度水解而造成的損失。本發明以污泥蛋白作為酶解助劑，強化木質纖維素酶解糖化作用，不僅實現了污泥的資源化利用，還提高了污泥蛋白的附加值，同時更降低了木質纖維素酶解糖化成本，這對解決能源危機將具有重要意義。

【附圖說明】

圖1是本發明實施例1酶解時間對還原糖得率的影響。

圖2是本發明實施例2酶解時間對還原糖得率的影響。

圖3是本發明實施例3酶解時間對還原糖得率的影響。

【具體實施方式】

下面結合附圖對本發明做進一步詳細說明。

本發明方法通過如下步驟進行的：

1)城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過大體積雜物；木質纖維素生物質選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過篩(40～80目)，將過篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時間1～4h，抽濾分離出木屑粉。雜交楊木屑可用任何木質纖維素生物質代替。

2)將選好城市污泥用氧化鈣或氫氧化鈣調節pH為9～12，取300～500mL調節好pH的污泥置于1L反應器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應20～40min。然后將反應物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離10～15min。取出上清液于25～40℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。

3)將步驟1)中分離得到的木屑粉作為底物，取0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入5～10mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合，得到混合溶液，然后再分別向燒瓶中加入纖維素酶和污泥蛋白粉，充分混合，其中，纖維素酶的添加量為5～20FPU/g底物；污泥蛋白粉和混合溶液的質量體積比為(0.5～2.5)mg：1mL。酶解反應在恒溫震蕩培養箱(160r/min)中進行，溫度35～50℃，反應時間25～48h。在一定的反應時間間隔后，取出樣品進行還原糖與酶活性分析。

本發明提供了一種利用污泥蛋白為酶解助劑促進木質纖維素酶解糖化的方法，首先將城市污泥超聲破解制備污泥蛋白粉，然后將制得的污泥蛋白粉與纖維素酶一起作用于經過預處理的生物質，具有新穎、獨特、成本低等特點，克服現有技術酶活性低、效率低、成本高等缺陷。

下面通過實施例對本發明進行詳細描述。

實施例1

(1)城市污泥、生物質的取樣：

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過大體積雜物；木質纖維素生物質選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過篩(40目)，將過篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時間1h。

(2)污泥蛋白的制備：

將選好城市污泥用氧化鈣調節pH為9，取300mL調節好pH的污泥置于1L反應器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應20min。然后將反應物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離10min。取出上清液于25℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。

(3)酶解反應：

取(2)中浸泡后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入5mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入5FPU/g的纖維素酶和0.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應在恒溫震蕩培養箱(160r/min)中進行，溫度35℃，反應時間48h。在一定的反應間隔后，取出樣品進行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實施例中在污泥蛋白的作用下，纖維素酶活性由8750U提高到了12145U，酶活性得到了顯著提高。

對于酶解糖化效率，見圖1，由圖可知，在酶解48h后，還原糖得率即已達到519.11mg/g，而Jin等在相關研究中，當Ca(OH)₂劑量為1.75％(w/v)，預處理溫度160℃，酶載量120FPU/g，酶解時間96h，還原糖得率才達到500mg/g以上，Jin Shuguang,Bioresource Technology，2016，205。

實施例2

(1)城市污泥、生物質的取樣：

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過大體積雜物；木質纖維素生物質選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過篩(50目)，將過篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時間2h。

(2)污泥蛋白的制備：

將選好城市污泥用氧化鈣調節pH為10.5，取350mL調節好pH的污泥置于1L反應器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應25min。然后將反應物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離11min。取出上清液于30℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。

(3)酶解反應：

取(2)中浸泡后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入6mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入7FPU/g的纖維素酶和1mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應在恒溫震蕩培養箱(160r/min)中進行，溫度40℃，反應時間48h。在一定的反應間隔后，取出樣品進行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實施例中在污泥蛋白的作用下，纖維素酶活性由8750U提高到了16584U，酶活性得到了顯著提高。

對于酶解糖化效率，見圖2，由圖可知，在酶解48h后，還原糖得率達530.35mg/g。

實施例3

(1)城市污泥、生物質的取樣：

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過大體積雜物；木質纖維素生物質選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過篩(60目)，將過篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時間2.5h。

(2)污泥蛋白的制備：

將選好城市污泥用氧化鈣調節pH為11，取400mL調節好pH的污泥置于1L反應器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應30min。然后將反應物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離12min。取出上清液于35℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。

(3)酶解反應：

取(2)中浸泡后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入7mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入10FPU/g的纖維素酶和1.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應在恒溫震蕩培養箱(160r/min)中進行，溫度45℃，反應時間48h。在一定的反應間隔后，取出樣品進行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實施例中在污泥蛋白的作用下，纖維素酶活性由8750U提高到了18489U，酶活性得到了顯著提高。

對于酶解糖化效率，見圖3，由圖可知，在酶解48h后，還原糖得率達到525.76mg/g。

實施例4

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過大體積雜物；木質纖維素生物質選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過篩(70目)，將過篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時間3h。將選好城市污泥用氧化鈣調節pH為11.5，取450mL調節好pH的污泥置于1L反應器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應35min。然后將反應物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離13min。取出上清液于37℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。取浸泡后的木屑0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入8mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入15FPU/g的纖維素酶和2mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應在恒溫震蕩培養箱(160r/min)中進行，溫度48℃，反應時間48h。

實施例5

城市污泥取自城市污水處理廠，除去污泥中過大體積雜物；木質纖維素生物質選擇雜交楊木屑，首先取一定量的雜交楊木屑，挑出異物，將選好的雜交楊木屑粉碎過篩(80目)，將過篩后的木屑粉浸泡于去離子水中，浸泡時間4h。將選好城市污泥用氧化鈣調節pH為12，取500mL調節好pH的污泥置于1L反應器中，在超聲波(108W，20.024kHz)作用下反應40min。然后將反應物冷卻至室溫，于3000r/min離心分離15min。取出上清液于40℃干燥5d得污泥蛋白粉，將制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃貯藏，備用。取浸泡后的木屑0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入10mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后在分別向燒瓶中加入20FPU/g的纖維素酶和2.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反應在恒溫震蕩培養箱(160r/min)中進行，溫度50℃，反應時間48h。

上述方法既增強了酶活性、節省了酶載量、降低了成本、又提高了生物質還原糖得率，同時也實現了污泥的資源化利用；此外，污泥蛋白的加入顯著地縮短了反應時間，進一步降低了水解單糖因過度水解而造成的損失。

以上述及內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所作的任何等效變換，均應屬于本發明的保護范圍。