本發明涉及小花清風藤中一種新化合物的制備方法及應用，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
小花清風藤為清風藤科清風藤屬藤本植物小花清風藤Sabia parviflora Wall.ex Roxb.的干燥莖。貴州產小花清風藤為布依族、苗族的民間藥，主要分布在貴州的興義市、安龍縣、冊亨縣、望謨縣等地，其根莖、葉均可入藥，有祛風除濕、消炎止痛的作用，治療甲型和乙型病毒性肝炎療效顯著，且副作用小。其相關品種，臨床多用于肝臟部位的相關疾病，然而，目前小花清風藤中主要活性成分不明，其肝部疾病的作用物質仍不清楚。
技術實現要素：
本發明的目的是對小花清風藤的化學成分進行深入研究，提供一種新化合物的制備方法及應用。
小花清風藤中一種新化合物：2,2,7-三甲基-2,7,8,9-四氫-7-羥甲基-2H-萘并(2,3-b)吡喃-6-酮，其結構式如下：
小花清風藤中一種新化合物的制備方法，包括以下步驟：
(1)取干燥的小花清風藤藥材，加入12倍重量的濃度70％乙醇提取三次，時間分別為5小時、3小時、3小時，過濾，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，得到提取物；
(2)取步驟(1)的提取物加入濃度為20-50％乙醇增溶，用離心機離心除去不溶物，得到上清液；
(3)取步驟(2)得到的上清液上大孔樹脂柱，先用30％乙醇-水洗脫5個柱體積，得到流份1，再用50％乙醇-水洗脫5個柱體積，濃縮，干燥，得到流份2，取流份2經200-300目的硅膠柱層析，用二氯甲烷和甲醇的混合液依次按體積比20:1、10:1、5:1、2:1梯度洗脫，每個濃度梯度洗脫4個柱體積，每個柱體積接4個流份，每個流份500ml，共得到16個流份，取二氯甲烷和甲醇的混合液體積比為20:1洗脫的4個流分，合并，經凝膠柱層析，用甲醇洗脫10次，依次得到10個流份，每個流份50ml，取流份3-8合并，再經ODS中低壓柱層析，用甲醇和水的混合液依次按體積比1:9、3:7、1:1、7:3、1:0洗脫，取甲醇和水的混合液體積比為1:0洗脫得到的流份，最后用制備高效液相色譜，色譜條件為：ODS色譜柱，甲醇-水55：45為流動相，保留時間37min，最后分離得到純的化合物。
其中，步驟(1)中所述的提取方法為冷浸法、滲漉法、微波提取法、超聲提取法、回流提取法或連續回流提取法。
本發明提供了小花清風藤中一種新化合物在制備保肝藥物中的應用。
本發明提供了一種藥物組合物，其包括治療有效量的小花清風藤中一種新化合物及其藥學上可接受的載體，制備成片劑、膠囊劑、注射劑、粉針劑、顆粒劑、脂肪乳劑、微囊、滴丸、軟膏劑或透皮控釋貼劑。
附圖說明
圖1為本發明提供的小花清風藤中一種新化合物的結構示意圖；
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好的理解本發明。
實施例1
小花清風藤中一種新化合物的制備方法，包括以下步驟：
(1)取干燥的小花清風藤藥材100kg，加入12倍重量的濃度70％乙醇提取三次，時間分別為5小時、3小時、3小時，過濾，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，得到提取物；
(2)取步驟(1)的提取物加入濃度為20-50％乙醇增溶，用離心機離心除去不溶物，得到上清液；
(3)取步驟(2)得到的上清液上大孔樹脂柱，先用30％乙醇-水洗脫5個柱體積，得到流份1，再用50％乙醇-水洗脫5個柱體積，濃縮，干燥，得到流份2，取流份2經200-300目的硅膠柱層析，用二氯甲烷和甲醇的混合液依次按體積比20:1、10:1、5:1、2:1梯度洗脫，每個濃度梯度洗脫4個柱體積，每個柱體積接4個流份，每個流份500ml，共得到16個流份，取二氯甲烷和甲醇的混合液體積比為20:1洗脫的4個流分，合并，經凝膠柱層析，用甲醇洗脫10次，依次得到10個流份，每個流份50ml，取流份3-8合并，再經ODS中低壓柱層析，用甲醇和水的混合液依次按體積比1:9、3:7、1:1、7:3、1:0洗脫，取甲醇和水的混合液體積比為1:0洗脫得到的流份，最后用制備高效液相色譜，色譜條件為：ODS色譜柱，甲醇-水55：45為流動相，保留時間37min，最后分離得到純的化合物(收率：780mg，純度：99.1％)，結構式圖如附圖1所示。
化合物的結構解析：
主要利用光譜技術，包括紫外、紅外、質譜、核磁共振(1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR)鑒定其結構，再經TOF高分辨質譜精確確定其分子量及分子式。
其波譜數據如下：
(1)白色無定形粉末，高分辨質譜ESI-TOF-MS：287.1272[M-H]-。其分子式可能為C17H20O4，NMR譜中δC:202.03(C-6),表明結構中存在羰基；δC：18.89,28.76,28.80，δH:1.16,1.43,1.42(each 3H,s,-CH3)，為三個甲基信號，δC：117.39(C-10),143.82(C-9a),159.61(C-1a),126.32(C-5),126.67(C-6a),121.45(C-4a),δH:7.61(1H,s,H-5),6.61(1H,s,H-10),提示結構中含一四取代的苯環，δC：122.61(C-4),132.33(C-3),δH:5.74(1H,d,J＝10.2Hz,H-3),6.41(1H,d,J＝9.6Hz,H-4)，表明結構有一個順式雙鍵。δC:73.81(C-8),δH:4.22(1H,dd,J＝3.7,4.7Hz,H-8),δC:35.32(C-9),δH:3.01(1H,dd,J＝4.9,17.5Hz,H-9a),3.24(1H,dd,J＝3.5,17.7Hz,H-9b),提示結構中含有-CH-CH2-結構基團，結合HMBC,HSQC,等二維核磁共振波譜數據，最終確定化合物的結構，如附圖1所示。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δH:1.16,(3H,s,-CH3),1.43,1.42(each 3H,s,-CH3),5.74(1H,d,J＝10.2Hz,H-3),6.41(1H,d,J＝9.6Hz,H-4),6.61(1H,s,H-5),22(1H,dd,J＝3.7,4.7Hz,H-8),3.01(1H,dd,J＝4.9,17.5Hz,H-9a),3.24(1H,dd,J＝3.5,17.7Hz,H-9b),6.61(1H,s,H-10),3.81(1H,d,J＝10.8Hz,H-11a),3.97(1H,d,J＝10.8Hz,H-11b).13C NMR(150MHz,CD3OD)δC:28.80,159.61(C-1a),78.88(C-2),132.33(C-3),122.61(C-4),121.45(C-4a),126.32(C-5),202.03(C-6),126.67(C-6a),52.25(C-7),73.81(C-8),35.32(C-9),143.82(C-9a),117.39(C-10),66.06(C-11),28.80(C-12),18.89(C-13),28.76(C-14).
實施例2藥效實驗研究
一、實驗材料與動物
1.藥物和試劑
谷丙轉氨酶測定試劑盒(R1、R2)(日本和光純藥工業株式會社)、谷草轉氨酶測定試劑盒(R1、R2)(日本和光純藥工業株式會社)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)；四氯化碳(分析純)，臨用前用花生油配制成0.1％的花生油溶液；D-氨基半乳糖(上海潤成生物科技有限公司)，臨用前用生理鹽水配成10％的水溶液；雙環醇片(北京協和藥廠)，臨用前磨成細粉用0.5％CMC-Na制成1.25mg/ml混懸液。
2.實驗動物
清潔級ICR小鼠，體重18-22g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(湘)2013-0004。
3.實驗儀器
日立7180型全自動生化分析儀(日立公司)，AL204型電子分析天平(Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)，HC-3018R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，MTV—100型多管漩渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司),KQ-4000B型超聲清洗機(鞏義市予華儀器有限責任公司)。
4.受試藥物及處理方法
取實施例1制備得到的化合物，加水稀釋成濃度為1.5mg/ml,陽性藥為雙環醇，臨用前磨成細粉用0.5％CMC-Na制成所需濃度的混懸液。
二、實驗方法
1.對CCl4致小鼠急性肝損傷的影響
取ICR雄性小鼠48只，隨機分成4組：空白對照組、模型組、陽性藥雙環醇組(25mg·kg-1·d-1)、實施例1制備得到的化合物組(30mg·kg-1·d-1)。空白對照組和模型組給予等量蒸餾水，給藥組灌胃給藥，連續7d，于末次給藥后2h，除空白對照組外，其余各組腹腔注射0.1％CCl4花生油溶液10mL·kg-1；空白對照組腹腔注射同體積的生理鹽水，禁食不禁水，16h后眼眶取血。所取得血液，以3000r·min-1離心10min，取上清液，按試劑盒操作方法測定CCl4致肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量。取血后處死小鼠，迅速取肝臟、將周圍結締組織剔除后放入冰冷的生理鹽水中清洗血污，取部分肝臟，制成10％肝勻漿，按照試劑盒說明測定MDA含量及SOD活力。
2.對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的影響
取ICR雄性小鼠48只，隨機分成4組：空白對照組、模型組、陽性藥雙環醇組(25mg·kg-1·d-1)、實施例1制備得到的化合物組(30mg·kg-1·d-1)。空白對照組和模型組給予等量蒸餾水，給藥組灌胃給藥，連續7d，于末次給藥后2h，除空白對照組外，其余各組腹腔注射10％D-氨基半乳糖溶液10mL·kg-1；空白對照組腹腔注射同體積的生理鹽水，禁食不禁水，16h后眼眶取血。所取得血液，以3000r·min-1離心10min，取上清液，按試劑盒操作方法測定D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量。取血后處死小鼠，迅速取肝臟、將周圍結締組織剔除后放入冰冷的生理鹽水中清洗血污，取部分肝臟，制成10％肝勻漿，按照試劑盒說明測定MDA含量及SOD活力。
3.對乙醇致小鼠肝損傷的影響
取ICR雄性小鼠48只，隨機分成4組：空白對照組、模型組、陽性藥雙環醇組(25mg·kg-1·d-1)、實施例1制備得到的化合物組(30mg·kg-1·d-1)。空白對照組小鼠給予生理鹽水10ml/kg，2次，間隔4h。模型組小鼠給予生理鹽水10ml/kg，間隔4h后，給予50％乙醇5ml/kg。陽性藥組小鼠給予雙環醇藥物，間隔4h后，給予50％乙醇5ml/kg。實施例1制備得到的化合物組小鼠給予實施例1制備得到的化合物，間隔4h后，給予50％乙醇5ml/kg。按照以上分組方法，生理鹽水、酒精以及雙環醇、實施例1制備得到的化合物的給予方式均為經口灌胃，每天一次，連續20d。末次灌胃24h后眼眶取血。所取得血液，以3 000r·min-1離心10min，取上清液，按試劑盒操作方法測定酒精致肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量。取血后處死小鼠，迅速取肝臟、將周圍結締組織剔除后放入冰冷的生理鹽水中清洗血污，取部分肝臟，制成10％肝勻漿，按照試劑盒說明測定MDA含量及SOD活力。
4.統計學處理
各組實驗數據均以表示，采用統計軟件SPSS 19.0，肝損傷試驗血清中各指標測定的數據采用方差分析組間比較t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。
三、實驗結果
1、本化合物對CCl4致小鼠急性肝損傷的影響
CCl4肝損傷模型組與正常組比較，小鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)；本發明的化合物、雙環醇組與模型組比較，均不同程度地使肝損傷小鼠血清ALT、AST降低(P<0.01)；本化合物具有降低肝組織MDA水平，升高肝組織SOD水平的功效；具體實驗結果見表1。
表1本化合物對CCl4致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝臟SOD、MDA的影響(mean±SD，n＝12)
注：*代表與模型組相比較，差異顯著(*P<0.05)，**代表與模型組相比較，差異極顯著(**P<0.01)。
2、本化合物對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的影響
D-氨基半乳糖肝損傷模型組與正常組比較，小鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)；實施例1制備得到的化合物組和雙環醇組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠血清ALT、AST降低(P<0.01)；實施例1制備得到的化合物組和雙環醇組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠組織MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)。具體實驗結果見表2。
表2本化合物對D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝臟SOD、MDA的影響(mean±SD，n＝12)
注：*代表與模型組相比較，差異顯著(*P<0.05)，**代表與模型組相比較，差異極顯著(**P<0.01)。
3、本化合物對乙醇致小鼠急性肝損傷的影響
乙醇致肝損傷模型組與正常組比較，小鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)；實施例1制備得到的化合物組、雙環醇組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠血清ALT、AST降低(P<0.05)；實施例1制備得到的化合物組和雙環醇組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠組織MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)。具體實驗結果見表3。
表3化合物對乙醇致肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝臟SOD、MDA的影響(mean±SD，n＝12)
注：*代表與模型組相比較，差異顯著(*P<0.05)，**代表與模型組相比較，差異極顯著(**P<0.01)。
以上實驗結果表明，本發明提供的化合物可顯著降低CCl4、D-氨基半乳糖和乙醇所致肝損傷模型小鼠血清ALT、AST含量、肝組織MDA含量，增強肝臟SOD活性。
因此，本發明制備得到的新的化合物有望開發成為新一代安全有效，用于防治肝損傷的藥物或保健品。