本發明涉及微生物資源應用的技術領域，尤其是涉及一種發酵培養基、菌糠發酵菌劑及發酵方法。
背景技術：
菌糠，是指栽培食用菌后所產生的培養基廢棄物，主要由粗纖維、粗蛋白和粗脂肪構成。隨著食用菌行業的飛速發展，食用菌生產后產生的菌糠也越來越多。目前，中國已是世界第一香菇生產大國，年產干菇1.68×107kg。香菇產業在帶來經濟效益的同時也帶來了資源浪費與環境污染問題。每收獲100kg的鮮菇后，會產生60kg的菌糠，這些菌糠營養物質豐富，易腐敗變質，由于對菌糠的認識不足，大量菌糠未能合理開發利用而廢棄荒野，這既造成大量的資源的浪費，又污染了環境。
香菇菌糠不僅含有豐富氨基酸、菌類多糖及Fe、Cu、Zn、Mg等微量元素，以及一些微生物代謝產物，如微量酚性物、少量的生物堿、黃酮及其甙類，而且還含有肌酸、多肽、皂甙植物甾醇及置萜皂甙等化學營養物質，具有松軟、氣味芳香和安全無毒的優點，可以作為飼料來源的新途徑。但因自身木質素、纖維素、半纖維素等難以被家畜直接消化利用的碳水化合物含量過高，限制了它的進一步資源化利用。
木質素是由苯丙烷結構單元通過醚鍵和碳－碳鍵聯結而成的復雜的、近似球形的無定形芳香族高聚物，溶解性差，并難以被酸水解。由于具有各種生物學穩定的復雜鍵型而不易被微生物降解，進而阻礙了纖維素的降解利用，木質素是影響菌糠粗纖維消化率的關鍵限制因子。反芻動物瘤胃中存在大量纖維素分解菌，包括細菌、真菌、纖毛蟲等，但缺少分解木質素的微生物及其酶類。因此，要提高纖維素降解效率，必須首先解決木質素的降解問題。
針對這一難題，國內外使用了不同的處理方法，包括物理法、化學法和微生物處理，這些方法在一定程度上能夠軟化飼料，破壞細胞壁結構，降低纖維素和半纖維素含量。微生物處理是被普遍接受和廣泛使用的一種方法，因為微生物處理既能降低粗纖維含量，又符合環保要求，但存在一個共同問題，就是降解率低，發酵時間長，木質素的降解相當微小。
因此，開發一種利用微生物處理，能夠有效降解木質素，發酵時間短且降解率高的發酵培養基、菌糠發酵菌劑及發酵方法尤為重要。
有鑒于此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明的第一個目的在于提供一種發酵培養基，以緩解現有技術中培養白腐真菌及黑曲霉時產生的酶活性較低的技術問題；
本發明的第二個目的在于提供一種菌糠發酵菌劑，以緩解現有技術中存在的發酵時間長，木質素的降解率低的技術問題；
本發明的第三個目的在于提供一種菌糠的發酵方法，以緩解現有技術中存在的菌糠利用率低的技術問題。
本發明提供的一種發酵培養基，所述發酵培養基由以下重量份的組分組成：糊精3－8份，豆餅粉0.1－1份，酵母粉1－5份，Na2PO4 0.1－0.7份，KCl 0.1－0.4份，MgSO4·7H2O 0.01－0.1份，FeSO4·7H2O 0.01－0.1份，NH4Cl 0.1－0.5份，CaCO3 0.2－0.8份，維生素營養液5－10份，谷物水解液1－10份，水60－90份。
進一步地，所述發酵培養基由以下重量份的組分組成：糊精6份，豆餅粉0.5份，酵母粉3份，Na2PO4 0.4份，KCl 0.2份，MgSO4·7H2O 0.05份，FeSO4·7H2O 0.05份，NH4Cl 0.3份，CaCO3 0.5份，維生素營養液8份，谷物水解液6份，水75份。
進一步地，所述維生素營養液由肌醇25－35g，維生素B1 0.5－2g，維生素B6 0.5－2g，葉酸1－3g，生物素0.01－0.1g溶于1000mL蒸餾水中制成；
優選地，所述維生素營養液由肌醇30g，維生素B1 1g，維生素B6 1g，葉酸2g，生物素0.05g溶于1000mL蒸餾水中制成。
進一步地，所述谷物水解液由谷物，水和鹽酸組成，所述谷物，水和鹽酸的質量比為5：25：1。
進一步地，所述谷物水解液的制備如下：將質量比為5：25：1的谷物，水和鹽酸，在65℃，0.05－0.08MPa壓力下，水解60－90分鐘。
進一步地，所述谷物為蕎麥面。
本發明還提供了一種菌糠發酵菌劑，將活菌密度為5×105－5×106CFU/mL的白腐真菌加入上述的發酵培養基中，150r/min，30℃培養24h后，再向所述發酵培養基中加入活菌密度為5×105－5×106CFU/mL的黑曲霉，經150r/min，30℃培養24h后得到菌糠發酵菌劑。
進一步地，所述白腐真菌的活菌密度為1×106CFU/mL，所述黑曲霉活菌密度為1×106CFU/mL。
另外，本發明還提供了一種菌糠的發酵方法，將菌糠干燥粉碎后，向粉碎后的菌糠中加入上述的菌糠發酵菌劑，調節調節pH為6.2－6.6，溫度為36－41℃，進行發酵，發酵時間為24－48h。
進一步地，所述菌糠為香菇菌糠。
本發明提供的發酵培養基，在培養白腐真菌及黑曲霉時，能夠有效刺激孢子的萌發和菌體的生長，且保證白腐真菌產生的木質素降解酶酶活性較高，黑曲霉產生的纖維素酶酶活性較高。本發明提供的菌糠發酵菌劑，利用本發明提供的發酵培養基培養白腐真菌和黑曲霉搭配的優化組合，能夠有效降解香菇菌糠，使纖維素和木質素長鏈易于斷裂，有利于微生物降解，加快了降解過程，縮短了降解時間。本發明提供的菌糠的發酵方法，利用本發明提供的菌糠發酵菌劑對菌糠進行發酵，操作簡便，易于實施，經濟實用。
具體實施方式
為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例對本發明做進一步的說明。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑、工具或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
本發明提供了一種發酵培養基，發酵培養基由以下重量份的組分組成：糊精3－8份，豆餅粉0.1－1份，酵母粉1－5份，Na2PO4 0.1－0.7份，KCl 0.1－0.4份，MgSO4·7H2O 0.01－0.1份，FeSO4·7H2O 0.01－0.1份，NH4Cl 0.1－0.5份，CaCO3 0.2－0.8份，維生素營養液5－10份，谷物水解液1－10份，水60－90份。
其中糊精例如可以為，但不限于3份，4份，5份，6份，7份或8份；豆餅粉例如可以為，但不限于0.1份，0.2份，0.3份，0.4份，0.5份，0.6份，0.7份，0.8份，0.9份和1.0份；酵母粉例如可以為，但不限于1份，2份，3份，4份和5份；Na2PO4例如可以為，但不限于0.1份，0.2份，0.3份，0.4份，0.5份，0.6份和0.7份；KCl例如可以為，但不限于0.1份，0.2份，0.3份和0.4份；MgSO4·7H2O例如可以為，但不限于0.01份，0.02份，0.03份，0.04份，0.05份，0.06份，0.07份，0.08份，0.09份和0.1份；FeSO4·7H2O例如可以為，但不限于0.01份，0.02份，0.03份，0.04份，0.05份，0.06份，0.07份，0.08份，0.09份和0.1份；NH4Cl例如可以為，但不限于0.1份，0.2份，0.3份，0.4份和0.5份；CaCO3例如可以為，但不限于0.2份，0.3份，0.4份，0.5份，0.6份，0.7份和0.8份，維生素營養液例如可以為，但不限于5份，6份，7份，8份，9份和10份；谷物水解液例如可以為，但不限于1份，2份，3份，4份，5份，6份，7份，8份，9份和10份。
在一個優選的實施方式中，發酵培養基由以下重量份的組分組成：糊精6份，豆餅粉0.5份，酵母粉3份，Na2PO4 0.4份，KCl 0.2份，MgSO4·7H2O 0.05份，FeSO4·7H2O 0.05份，NH4Cl 0.3份，CaCO3 0.5份，維生素營養液8份，谷物水解液6份，水75份。
其中，糊精作為發酵培養基中的碳源，豆餅粉和酵母粉作為發酵培養基中的有機氮源，NH4Cl作為發酵培養基中的無機氮源，Na2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和CaCO3用以補充菌體生長所需要微量元素類無機營養物，維生素營養液用以補充菌體生長所需要的維生素，谷物水解液富含纖維素，能夠促進白腐真菌及黑曲霉的生長和產酶。
此外，本發明的發酵培養基中還可加入抗生素，如兩性霉素B，以抑制目的細菌白腐真菌和黑曲霉之外的其他細菌生長。
在本發明中，維生素營養液由肌醇25－35g，維生素B1 0.5－2g，維生素B6 0.5－2g，葉酸1－3g，生物素0.01－0.1g溶于1000mL蒸餾水中制成。
在一個優選的實施方式中，維生素營養液由肌醇30g，維生素B1 1g，維生素B6 1g，葉酸2g，生物素0.05g溶于1000mL蒸餾水中制成。
在本發明中，谷物水解液由谷物，水和鹽酸組成，所述谷物，水和鹽酸的質量比為5：25：1。
在本發明中，谷物水解液的制備如下：將質量比為5：25：1的谷物，水和鹽酸，在65℃，0.05－0.08MPa壓力下，水解60－90分鐘。
在一個優選的實施方式中，谷物水解液的制備如下：將質量比為5：25：1的谷物，水和鹽酸，在65℃，0.06MPa壓力下，水解75分鐘。
其中，谷物可以是小麥粒、大麥、玉米、芥麥面、薏米面、高粱米、黑米中的一種或兩種以上。
在一個優選的實施方式中，谷物為蕎麥面。
本發明還提供了一種菌糠發酵菌劑，將活菌密度為5×105－5×106CFU/mL的白腐真菌加入上述的發酵培養基中，150r/min，30℃培養24h后，再向所述發酵培養基中加入活菌密度為5×105－5×106CFU/mL的黑曲霉，經150r/min，30℃培養24h后得到菌糠發酵菌劑。
在一個優選的實施方式中，加入白腐真菌的活菌密度為1×106CFU/mL，黑曲霉活菌密度為1×106CFU/mL。
另外，本發明還提供了一種菌糠的發酵方法，將菌糠干燥粉碎后，向粉碎后的菌糠中加入上述的菌糠發酵菌劑，調節調節pH為6.2－6.6，溫度為36－41℃，進行發酵，發酵時間為24－48h。
在一個優選的實施方式中，調節pH為6.4，溫度為37℃，進行發酵，發酵時間為36h。
在本發明中，菌糠干燥粉碎的方法為：將無霉變的菌糠風干，過1mm篩。
在本發明中，加入菌糠發酵菌劑的質量為菌糠干重的15％。
在本發明中，菌糠為香菇菌糠。
在上述條件下，本發明提供的發酵培養基，在培養白腐真菌及黑曲霉時，能夠有效刺激孢子的萌發和菌體的生長，且保證白腐真菌產生的木質素降解酶酶活性較高，黑曲霉產生的纖維素酶酶活性較高。本發明提供的菌糠發酵菌劑，利用本發明提供的發酵培養基培養白腐真菌和黑曲霉搭配的優化組合，能夠有效降解香菇菌糠，使纖維素和木質素長鏈易于斷裂，有利于微生物降解，加快了降解過程，縮短了降解時間。本發明提供的菌糠的發酵方法，利用本發明提供的菌糠發酵菌劑對菌糠進行發酵，操作簡便，易于實施，經濟實用。
下面結合優選實施例對本發明做進一步的說明。本發明實施例中，白腐真菌受贈于山東大學，黑曲霉購自于中國菌種保藏中心，香菇菌糠來源于普通種植戶。
實施例1
一種發酵培養基，由以下重量份的組分組成：
糊精6份，豆餅粉0.5份，酵母粉3份，Na2PO4 0.4份，KCl 0.2份，MgSO4·7H2O 0.05份，FeSO4·7H2O 0.05份，NH4Cl 0.3份，CaCO3 0.5份，維生素營養液8份，谷物水解液6份，水75份。
其中，維生素營養液由肌醇30g，維生素B1 1g，維生素B6 1g，葉酸2g，生物素0.05g溶于1000mL蒸餾水中制成。谷物水解液由蕎麥面，水和鹽酸按質量比為5：25：1組成，在65℃，0.06MPa壓力下，水解75分鐘。
一種菌糠發酵菌劑，將活菌密度為1×106CFU/mL的白腐真菌加入本實施例提供的發酵培養基中，150r/min，30℃培養24h后，再向發酵培養基中加入活菌密度為1×106CFU/mL的黑曲霉，經150r/min，30℃培養24h后得到菌糠發酵菌劑。
一種香菇菌糠的發酵方法，將無霉變的香菇菌糠風干，過1mm篩后，向粉碎后的香菇菌糠中加入本實施例提供的菌糠發酵菌劑，加入菌糠發酵菌劑的質量為本實施例香菇菌糠干重的15％，調節pH為6.4，溫度為37℃，進行發酵，發酵時間為36h。
實施例2
一種發酵培養基，由以下重量份的組分組成：
糊精3份，豆餅粉0.1份，酵母粉1份，Na2PO4 0.1份，KCl 0.1份，MgSO4·7H2O 0.01份，FeSO4·7H2O 0.01份，NH4Cl 0.1份，CaCO3 0.2份，維生素營養液5份，谷物水解液1份，水60份。
其中，維生素營養液由肌醇25g，維生素B1 0.5g，維生素B6 0.5g，葉酸1g，生物素0.01g溶于1000mL蒸餾水中制成。谷物水解液由蕎麥面，水和鹽酸按質量比為5：25：1組成，在65℃，0.05MPa壓力下，水解60分鐘。
一種菌糠發酵菌劑，將活菌密度為5×105CFU/mL的白腐真菌加入本實施例提供的發酵培養基中，150r/min，30℃培養24h后，再向發酵培養基中加入活菌密度為5×105CFU/mL的黑曲霉，經150r/min，30℃培養24h后得到菌糠發酵菌劑。
一種香菇菌糠的發酵方法，將無霉變的香菇菌糠風干，過1mm篩后，向粉碎后的香菇菌糠中加入本實施例提供的菌糠發酵菌劑，加入菌糠發酵菌劑的質量為本實施例香菇菌糠干重的15％，調節pH為6.2，溫度為36℃，進行發酵，發酵時間為24h。
實施例3
一種發酵培養基，由以下重量份的組分組成：
糊精8份，豆餅粉1份，酵母粉5份，Na2PO4 0.7份，KCl 0.4份，MgSO4·7H2O 0.1份，FeSO4·7H2O 0.1份，NH4Cl 0.5份，CaCO3 0.8份，維生素營養液10份，谷物水解液10份，水90份。
其中，維生素營養液由肌醇35g，維生素B1 2g，維生素B6 2g，葉酸3g，生物素0.1g溶于1000mL蒸餾水中制成。谷物水解液由蕎麥面，水和鹽酸按質量比為5：25：1組成，在65℃，0.08MPa壓力下，水解90分鐘。
一種菌糠發酵菌劑，將活菌密度為5×106CFU/mL的白腐真菌加入本實施例提供的發酵培養基中，150r/min，30℃培養24h后，再向發酵培養基中加入活菌密度為5×106CFU/mL的黑曲霉，經150r/min，30℃培養24h后得到菌糠發酵菌劑。
一種香菇菌糠的發酵方法，將無霉變的香菇菌糠風干，過1mm篩后，向粉碎后的香菇菌糠中加入本實施例提供的菌糠發酵菌劑，加入菌糠發酵菌劑的質量為本實施例香菇菌糠干重的15％，調節pH為6.6，溫度為41℃，進行發酵，發酵時間為48h。
對比例1
一種發酵培養基，由以下重量份的組分組成：
葡萄糖6份，蛋白胨3份，NaCl 0.4份，MgSO4 0.05份，FeSO4·7H2O 0.05份，NaNO30.5份，30％肌醇溶液10份，水80份。
一種菌糠發酵菌劑，將活菌密度為1×106CFU/mL的白腐真菌加入本對比例提供的發酵培養基中，150r/min，30℃培養24h后，再向發酵培養基中加入活菌密度為1×106CFU/mL的黑曲霉，經150r/min，30℃培養24h后得到菌糠發酵菌劑。
一種香菇菌糠的發酵方法，將無霉變的香菇菌糠風干，過1mm篩后，向粉碎后的香菇菌糠中加入本對比例提供的菌糠發酵菌劑，加入菌糠發酵菌劑的質量為本對比例香菇菌糠干重的20％，調節pH為6.5，溫度為37℃，進行發酵，發酵時間為96h。
菌體生長情況及酶活性
分別向100mL實施例1、實施例2、實施例3和對比例1提供的發酵培養基中，按相應條件加入白腐真菌和黑曲霉，并進行震蕩培養。振蕩培養7天后發現，白腐真菌和黑曲霉在不同培養基中的生長情況出現明顯差異：實施例1、實施例2和實施例3提供的發酵培養基中生長的白腐真菌和黑曲霉的生物量均明顯大于對比例1提供的發酵培養基中白腐真菌和黑曲霉的生物量。說明實施例1、實施例2和實施例3提供的發酵培養基中充足的營養物質可以有效的刺激孢子的萌發和菌體的生長。其中，以實施例1提供的發酵培養基中白腐真菌和黑曲霉的生物量最大。
木質素降解酶活性定義為1分鐘內氧化1μL藜蘆醇的酶量為1個酶活性單位。利用紫外分光光度計測定在波長為310nm處2.5分鐘內吸光度值的變化率。
纖維素酶活性采用3，5－二硝基水楊酸法測定，酶活性定義為1mg纖維素酶每分鐘催化纖維素水解生成葡萄糖μg數定為一個活力單位。利用紫外分光光度計測定在波長為550nm處1分鐘內吸光度值的變化率。
由實驗結果可以發現，在實施例1提供的發酵培養基中培養36h時出現了酶活性最大值，木質素降解酶的酶活性為297U/L，纖維素酶的酶活性為335U/L，相比于實施例2和實施例3提供的發酵培養基，酶活性有所提高，相比于對比例1提供的發酵培養基，酶活性均顯著提高。
香菇菌糠各組分含量的測定
應用實施例1、實施例2、實施例3和對比例1提供的菌糠發酵菌劑，按相應條件，對香菇菌糠進行發酵，并參照飼料質量檢測技術，對發酵后的香菇菌糠中，中性洗滌纖維(NDF)，酸性洗滌纖維(ADF)，纖維素，半纖維素，粗灰分，粗蛋白，水溶性碳水化合物，酸性洗滌木質素的含量進行測定，同時設未經任何處理的香菇菌糠為空白組，設不利用菌糠發酵菌劑進行發酵的香菇菌糠為對照組。測定結果見表1。
由表1中的結果可以看出，通過微生物發酵處理的香菇菌糠的化學組成能夠明顯改善。在各項成分中，相對于空白組和對照組，實施例1、實施例2、實施例3提供的菌糠發酵菌劑均能夠明顯降低香菇菌糠中酸性洗滌木質素的含量，并且能夠明顯降低香菇菌糠的纖維素、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和半纖維素的含量，而顯著提高水溶性碳水化合物和粗蛋白的含量。由此可知，本發明實施例1提供的菌糠發酵菌劑，利用本發明提供的發酵培養基培養白腐真菌和黑曲霉搭配的優化組合，能夠有效降解香菇菌糠，使纖維素和木質素長鏈易于斷裂，有利于微生物降解，加快了降解過程，縮短了降解時間。
表1香菇菌糠各組分含量的測定
香菇菌糠中各種氨基酸的含量的測定
應用實施例1、實施例2、實施例3和對比例1提供的菌糠發酵菌劑，按相應條件，對香菇菌糠進行發酵，并參照飼料質量檢測技術對發酵后的香菇菌糠中，6種必需氨基酸和9種非必須氨基酸的含量進行測定，同時設未經任何處理的香菇菌糠為空白組，設不利用菌糠發酵菌劑進行發酵的香菇菌糠為對照組。測定結果見表2。
表2香菇菌糠中各種氨基酸的含量的測定
由表2的實驗結果可以看出，任何發酵處理均會提高香菇菌糠的氨基酸含量，其中，應用實施例1提供的菌糠發酵菌劑對香菇菌糠進行發酵，氨基酸總量提高最顯著，應用實施例2和實施例3提供的菌糠發酵菌劑對香菇菌糠進行發酵，氨基酸含量同樣有所提高，且提高程度均高于對比例1提供的菌糠發酵菌劑對香菇菌糠進行發酵的氨基酸含量。因此可以推斷，實施例1提供的菌糠發酵菌劑具有將非蛋白氮轉化成氨基態氮的能力。
飼喂實驗
為了驗證應用本發明方法發酵的菌糠代替日糧對牛的飼用效果，發明人在養殖戶牛場進行了為期三個月的飼喂試驗。將100頭體重接近，健康狀況良好的肉牛隨機分為5組，每組20只。實驗組飼料為應用實施例1、實施例2、實施例3和對比例1提供的方法發酵的菌糠分別替代50％正常飼料，對照組飼喂正常飼料。三個月后對肉牛的生長性能進行檢測，檢測結果見表3。
表3肉牛的生長性能
由以上實驗結果可知，以實施例1、實施例2、實施例3和對比例1提供的方法發酵的菌糠分別替代50％正常飼料飼喂肉牛，不影響肉牛的日增重，并且能夠起到降低發病率，提升肉質口感的作用。由此推算，以飼喂雜交肉牛為例，日飼喂量5kg/頭，一年1500kg/頭左右，若按日糧價格1元/kg計算，一年可節省飼料費用1500kg×1元/kg×50％＝750元/頭。若每年能利用130萬噸菌糠作飼料，就相當于多生產了70萬噸的玉米。因此，利用本發明提供的菌糠發酵菌劑對菌糠進行發酵，操作簡便，易于實施，經濟實用，提高了菌糠的利用率，將菌糠回收再利用，作為節糧型飼料具有很好的社會效益。
最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。