一種球毛殼菌LJ?S2L1菌株及其應用的制作方法

本發明涉及生物技術領域，尤其是一種球毛殼菌lj-s2l1菌株及其應用。

背景技術：

枯萎病是近年來辣椒生產上發生嚴重的一類土傳病害，其致病菌尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)不僅寄主范圍廣泛，而且能在土壤中長期生存為害。隨著辣椒種植面積的擴大和復種指數的提高，辣椒枯萎病菌在田間逐年積累和蔓延，造成此病的普遍發生，嚴重時可減產70％～80％。不僅如此，枯萎病的發生使得辣椒植株本身病變后免疫減弱，使得其他土傳病原菌更加容易入侵，發病嚴重時甚至導致全田辣椒枯萎死亡。

目前以化學藥劑為主的防治方法側重于發病后治理，不能從根本上控制其危害，且藥劑過多使用產生的農藥殘留和病原抗藥性問題嚴重。隨著人們對環境保護、生態平衡、食品安全的重視，傳統的化學防治方法弊端愈加突出。生物防治作為能夠改善土壤環境，安全環保地控制病害發生的有效途徑之一而日益受到關注，且生防菌劑與有機肥混制而成的生物肥由于其防病和增肥的雙重功效逐漸成為生防菌應用研究方面的主要形式。也符合國家提出的減少化學農藥與肥料用量的“兩減”政策。

目前，生物防治枯萎病的方法主要包括植物提取物進行土壤消毒處理及利用生防真菌或生防細菌防治。例如，目前已報道在十字花科植物中提取的辣根素可以在一定程度上替代溴甲烷一類土壤熏蒸劑，以及國內外已經報道的用于防治枯萎病的生防真菌資源如木霉菌(trichodermaspp.)、鏈霉菌(streptomycesspp.)、菌根菌(mycorrhiza)、青霉菌(penicilliumspp.)及粘帚霉(gliocladiumspp.)等，以及生防細菌資源如熒光假單孢菌(psdeuomnodafluoerncnet)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)、粘質沙雷菌(serratiamarcescens)等。從國內針對枯萎病的研究報道來看，常見瓜類枯萎病的生物防治研究較多，而對辣椒枯萎病的相關研究卻很少。到2014年為止國內已經登記的376種微生物農藥有中，也少有專門針對辣椒枯萎病的生防菌劑。且目前生防菌篩選途徑大多集中在根際土及內生菌等資源中，利用糞生菌適生特點篩選生防菌應用于生物肥研究的報道還相對較少。

毛殼菌屬(chaetomium)真菌因能腐生于土壤、動物糞便、植物殘體等上，并能產生豐富的降解纖維素的酶和具有生理活性的次生代謝產物，且多對植物無毒害作用而被認為是具有潛在生物防治能力的類群。但目前研究的拮抗毛殼菌種類較少，兩株球毛殼菌雖已分離獲得并被用于防治人參和蘋果的真菌病害，中國專利：cn104694397a、cn104877919a，但是均未涉及分離自田間施用的農家肥中，也未報道對辣椒枯萎病及其他危害辣椒根部的土傳病害有防治作用。

技術實現要素：

本發明的目的是：提供一種球毛殼菌lj-s2l1菌株及其應用，它抗菌效果較好，對辣椒枯萎病病原真菌抑制率高，其發酵液及菌體均對尖孢鐮刀菌辣椒致病型有效，可作為辣椒枯萎病的生物防治菌劑使用，且培養要求簡單，成本低廉。

本發明是這樣實現的：球毛殼菌lj-s2l1菌株，該菌株的保藏編號為cctccm2016649。

球毛殼菌lj-s2l1菌株在防治辣椒枯萎病中的應用。

包括該菌株的發酵液與菌體在防治辣椒枯萎病中的應用。

本發明的球毛殼菌lj-s2l1菌株已保藏在中國典型培養物保藏中心(cctcc，地址：中國武漢武漢大學；郵編:430072)，其保藏編號是cctccm2016649，保藏日期為2016年11月17日，分類命名為球毛殼菌，拉丁文學名為chaetomiumglobosum。

與現有技術相比，本發明培養要求簡單，生長條件易控制且產率大，其抗菌效果較好，對辣椒枯萎病病原菌菌絲有吸附、消解的作用，且對毒力測定結果表明，菌株s2l1發酵液對辣椒枯萎病菌的抑制率在1000μl/ml時可以達到72.10％，抑制中濃度為300.63μl/ml；盆栽試驗防效能達到71.8％，與80％多菌靈500倍液效果相當。該菌株在辣椒枯萎病的防治方面有廣闊的應用前景，其發酵液和無菌發酵濾液均有很強的抑制作用，且適生于農家肥，可作為辣椒枯萎病的生防菌劑單獨使用或復配于有機肥形成生物肥使用。

附圖說明

圖1是本發明菌株在分離培養基上的培養特征；

圖2是本發明的生防菌株形態特征；

圖3是本發明菌株的its序列分析的系統發育進化樹；

圖4是本發明菌株對辣椒枯萎病病原真菌的抑制效果；

圖5是本發明菌株對辣椒枯萎病病原真菌菌絲的吸附作用；

lj-s2l1作用尖孢鐮刀菌的消解、斷裂菌絲(3d)；菌絲a為拮抗菌，菌絲p為病原菌；

圖6是本發明菌株發酵液對辣椒枯萎病病原菌的抑制效果；

圖7為是否滅菌對不同濃度發酵液處理比較結果。

具體實施方式

本發明的實施例1：球毛殼菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株的篩選：選擇辣椒枯萎病嚴重發生之后連續兩年以上施用農家肥的辣椒地塊，在農家肥腐熟后施用的第7d，利用五點法采集健康植株的根際糞土。然后利用稀釋分離法，每個土樣稱取10g放入裝有滅菌的玻璃珠和90ml無菌水的三角瓶中，160r/min振蕩30min得到10^-1樣品懸液。在無菌環境下將土樣懸液用無菌水依次稀釋成10^-2、10^-3、10^-4及10^-5個不同濃度。取后三個濃度的土壤懸浮液0.1ml分散滴于pda平板上，用滅菌的三角玻璃棒涂勻，靜置20min后放到25℃黑暗條件下倒置培養，每天觀察，一旦有菌落形成立即純化并保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(pda)配方為：馬鈴薯200g去皮切塊煮20min后，用紗布過濾收集濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂17g，融化混勻后定容至1000ml，自然ph，121℃，高壓滅菌20min備用。

菌種鑒定

(1)形態觀察：該菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(pda)平板上25℃培養時最初菌落呈淺黃色，氣生菌絲生長茂盛、呈棉絮狀，菌絲淺黃色，具明顯隔膜。菌落生長到后期顏色變深，能附著產生大量黑色子囊果，用1％葡萄糖溶液制成菌懸液臨時裝片后顯微觀察其特征為卵圓形，黑褐色，直徑160-270μm，周生較多附屬絲。子囊孢子褐色，檸檬形，兩端突起，少數橢圓形，8-11μm×6-8μm。

(2)its序列分析及系統發育樹的構建：pda平板活化菌株lj-s2l1，待菌落鋪滿培養皿后，用滅菌刀片刮取菌組織，采用2％ctab法提取基因組dna，用真菌通用引物：its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)對提取的dna進行pcr擴增^[12]。pcr反應體系(25μl)：2×estaqmastermix(北京天根生物技術有限公司)12.5μl、dna模板1μl、通用引物its1和its4各1μl、ddh2o9.5μl，對照加入ddh2o代替dna模板。pcr擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min。

擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工公司測序。lj-s2l1菌株its序列與genbank相近似真菌的its序列(表1)一起用于分子系統發育學分析。通過clustal-x1.81^[13]軟件包進行相似序列的比對，再運用bioeditversion5.0.6(tomhall,departmentofmicrobiology,northcarolinastateuniversity,raleigh,nc27695)對比對的結果進行手工校正，把上述處理的序列數據通過paup*4.0beta10進行分子系統發育分析，構建系統發育樹。

通過最大簡約法分析(maximumparsimonyanalysis)建立最大簡約樹，應用啟發式搜索法(heuristicsearch)作為獲得聚類樹的方法，應用樹二等分再連接法(tree-bisection-reconnection,tbr)作為啟發式搜索的算法。在系統進化分析中堿基序列間空缺(gaps)作為堿基缺失處理，把所有堿基狀態處理為無序并且不加權(equalweight)。通過1000步重復獲得的自展檢驗(bootstrap)數值標記在分支上。

本發明菌株編號lj-s2l1，分類命名為：球毛殼菌chaetomiumglobosum，結果見圖1-3。

本發明的實施例2：糞生球毛殼菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株對辣椒枯萎病病原的抑制作用

采用平板對峙法篩選生防菌并測定抑制率：用打孔器分別打取直徑為5mm的靶標病原菌與待測菌菌餅，將兩菌餅相距5.5cm分別接于同一pda平板的兩側，每組三次重復，以不接待測菌為對照，置于25℃培養7d，測量病原菌朝向待測菌的菌落半徑，計算待測菌的抑制率。挑選出對辣椒枯萎病病原菌有明顯抑制作用的菌株進行復篩。生長抑制率(％)＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑/對照菌落直徑-5mm)×100。

抑菌圈法驗證：用無菌水洗脫試管斜面中培養了5d的尖孢鐮刀菌制成1×10⁶個/ml的孢懸液，然后吸取5ml加入150ml冷卻至50℃左右的pda培養基中，倒平板備用，然后將初篩有抑制效果菌株的5mm菌餅接入平板中央，放于25℃箱中黑暗倒置培養。5d后觀察并記錄抑菌圈直徑。

結果如表1和圖4、5所示，從辣椒根際農家肥分離到的76株真菌中，共篩選出對辣椒枯萎病菌有拮抗作用的菌株13株，其中抑菌率超過50％的菌株有5個，效果最好的菌株標記為lj-s2l1(表1)，其抑制率可達到71.67％，復篩試驗產生的抑菌圈直徑第5d時也能達到32mm。在lj-s2l1菌株與尖孢鐮刀菌對峙培養第3d的兩菌株交界處，顯微觀察發現，尖孢鐮刀菌絲出現隘縮、彎曲、部分膨大甚至斷裂的現象。

表1球毛殼菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株對辣椒枯萎病菌的抑制作用

注:表中數據為平均值±標準差。同列數據后不同小寫字母表示經duncan新復極差法檢驗在p＜0.05水平差異顯著。

本發明的實施例3：球毛殼菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株發酵液對辣椒枯萎病病原的抑制作用

發酵液制備：將活化好的菌株lj-s2l1接種到pdb培養基中，25℃160r/min培養7d后，用雙層無菌紗布過濾菌液，然后把濾液放入10000r/min的離心機離心3min，得到的上清液分為兩份，一份經過高壓滅菌處理，另一份不做任何處理。以辣椒枯萎病菌為指示菌，用下列兩種方法測定菌株lj-s2l1兩種發酵液的抑菌特性。

菌落直徑法：將菌株lj-s2l1的兩種發酵液分別按體積1﹕4的比例加入冷卻至50℃左右的pda培養基，混勻制成含生防菌發酵液的平板，隨后在平板中央接種直徑5mm的病原真菌菌餅，置于25℃下黑暗暗培養7d。以普通pda平板為對照。用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，統計時去除菌餅直徑，然后計算菌落生長抑制率，每處理設3次重復。菌落生長抑制率方法同實施例2。

紙片擴散法：根據上述菌落直徑法中的方法制得lj-s2l1菌株的滅菌發酵液，然后設置濃度梯度為10、20、30、40、50μl分別依次滴于滅菌濾紙片，吹干后放入含有指示菌的平板，25℃下暗培養7d觀察記錄病原菌菌落直徑，然后計算菌落生長抑制率，計算方法同實施例2，每處理設3個重復(夏麗娟等，2014)。

結果如表2所示，菌落直徑法測定的lj-s2l1菌株滅菌與未滅菌的發酵液對辣椒枯萎病菌都具有抑制作用。滅菌的lj-s2l1菌株發酵液對尖孢鐮刀菌的抑菌率較未滅菌發酵液的抑菌率低，雖兩者差異顯著，但滅菌發酵液的抑菌率仍然能達到50％以上，指示菌的菌落也明顯變薄，菌絲呈溶解狀，見圖6。

滅菌與未滅菌發酵液的濾紙片在不同濃度的處理間對指示菌抑制效果存在明顯差異。含量10μl滅菌發酵液的濾紙片幾乎沒有產生抑菌圈，含量20μl時開始出現抑制作用，隨著濾紙片中滅菌發酵液的濃度增大，抑菌圈直徑逐漸增大，濃度為50μl時抑菌圈直徑能達到30.3mm。同樣，未滅菌發酵液濾紙片的抑菌作用與發酵液濃度呈正相關，濃度為10μl時即開始產生抑菌作用，50μl時抑菌圈最大能達42.5mm，見圖7。

表2球毛殼菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株發酵液對辣椒枯萎病菌的抑制作用

注:表中數據為平均值±標準差。同列數據后不同小寫字母表示經duncan新復極差法檢驗在p＜0.05水平差異顯著。

本發明的實施例4：球毛殼菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株發酵液的室內毒力測定

參照實施例3的方法制備無菌發酵濾液。將無菌濾液與熔化冷卻至50℃左右的pda培養基混合，制成菌液含量分別為1000、500、250、125和62.5μl/ml的平板。選用80％多菌靈可濕性粉劑，同上法制成多菌靈含量分別為500、250、125、62.5和31.3μg/ml的含藥平板作為對照藥劑平板。用pdb液體培養基代替培養液作為對照平板。然后將直徑為5mm的辣椒枯萎病菌菌餅接到各平板中央，28℃恒溫培養7d后，測量各培養基平板上菌落的直徑，計算拮抗菌培養液的抑制能力。抑菌率計算同實施例2，每處理3次重復。采用dps軟件和excel統計分析數據。以菌液濃度的對數值為自變量，抑菌率的概率值為因變量，建立毒力回歸方程，求出lj-s2l1菌及對照藥劑的有效抑制濃度(ec50)。

結果如表3所示，室內毒力測定結果(表3)顯示，菌株lj-s2l1滅菌發酵液對辣椒枯萎病菌的ec50為300.63μl/ml，明顯高于多菌靈，說明要達到相同抑制率，需用到的lj-s2l1滅菌發酵液原液較多，且其抑菌作用隨著用量的增加而加強，pda平板發酵液處理濃度為1000μl/ml時對辣椒枯萎病菌的抑制率最高，達到72.10％。因此本結論也為進一步的有效成分確定與發酵液濃縮提供理論依據。

表3球毛殼菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株與多菌靈的抑菌效果對比

本發明的實施例5：糞生球毛殼菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株對辣椒枯萎病的防治效果

首先按實施例3中方法準備菌株lj-s2l1的含菌發酵液，并將孢子濃度調為1×10⁸cfu/ml。準備4～5片真葉的辣椒植株，通過灌施和噴施的方式將lj-s2l1發酵液接種于植株根部土壤周圍并將其定植到裝有經兩次高壓濕熱滅菌育苗土的花盆中，7d后，通過灌根法接種辣椒枯萎病菌，然后將接種后的辣椒植株放于溫度28℃，濕度90％，白天光照，晚上黑暗的氣候箱中培養。以無菌水和80％多菌靈500倍液處理為對照，每個處理20株，重復3次，7d后每天觀察并記錄不同處理辣椒苗的生長與發病情況，并對結果進行統計分析。

結果如表4所示，單接辣椒枯萎病致病菌的無菌水對照處理的病情指數達到71.1％，而接種菌株lj-s2l1及多菌靈的處理病情指數明顯降低。從防效上看，菌株lj-s2l1防效能達到71.8％，略低于多菌靈對照的防效，但兩者在0.1％水平差異不顯著。

表4生防菌株lj-s2l1對辣椒枯萎病的盆栽防治效果

注:表中數據為平均值±標準差。同列數據后不同大、小寫字母表示經duncan新復極差法檢驗在p＜0.1及p＜0.05水平差異顯著。

本發明的球毛殼菌lj-s2l1是一株從施有農家肥的的辣椒根際處糞土中分離得到糞生生防菌株，對辣椒枯萎病病菌尖孢鐮刀菌萎蔫專化型(f.oxysporumf.sp.vasinfectum)有較好的抑制作用，且進一步的對峙試驗表明其對辣椒其他土傳病害也有一定拮抗作用，具體結論待進一步結果分析。結合生防菌株lj-s2l1在農家肥上的適生性，該菌株可作為生物肥研發的優勢生防菌。其優點在于菌株的含菌發酵液及無菌發酵液對辣椒枯萎病病原菌均有抑制作用，且培養要求簡單，生長條件易控制且產率大。該菌株在辣椒枯萎病的綠色防控方面具有廣闊的應用前景。