沙福芽孢桿菌YJC?4及其在防治煙草黑脛病和促生長中的應用的制作方法

本發明屬于生物防治技術領域，具體涉及一株沙福芽孢桿菌YJC-4及其在防治煙草黑脛病和促生長中的應用。

背景技術：

煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)是一種兼性寄生菌，會誘發煙草黑脛病(Tobacco Black Shank)，對煙草具有毀滅性危害。黑脛病菌喜高溫高濕，溫度在28-30℃，濕度達到80％以上時，會給病菌孢子囊的釋放和游動孢子的傳播創造有利條件，此時最易引起煙草黑脛病的流行與發生，引起煙株大面積死亡。煙草作為其寄主植物，在其團棵期到旺長期間發病達到高峰期，主要危害煙株根部和莖基部。另外，土地多年連作、與煙草青枯病、根結線蟲病混合發生，將加重危害煙株健康，導致煙葉減產和煙葉質量降低。

土壤中主要含有細菌、真菌和放線菌3類微生物，研究發現許多芽孢桿菌作為拮抗菌對煙草黑脛病具有良好的防治效果。國內外眾多研究表明，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)等通過抗生、溶菌、競爭、重寄生等作用機制對煙草黑脛病具有良好的防治效果。有些拮抗菌對煙株有促生作用，促進煙苗氮、磷、鉀吸收，可有效降低帶病煙苗的發病率和病情指數。

目前也有商品化的枯草芽孢桿菌，但是在防治煙草黑脛病及促生長方面仍有不足。

技術實現要素：

針對上述問題，本發明旨在提供一株沙福芽孢桿菌，能有效防治煙草的黑脛病，并能對煙草的生長產生明顯的促進作用。

一株沙福芽孢桿菌YJC-4，分類名為Bacillus safensis，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年4月15日，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No.12356。

進一步地，沙福芽孢桿菌YJC-4的菌體呈桿狀，革蘭氏染色顯陽性。

進一步地，所述沙福芽孢桿菌YJC-4的培養基組份為：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1L。

進一步地，所述沙福芽孢桿菌YJC-4的培養條件為：30-35℃、pH7-8恒溫震蕩培養24-72h。優選35℃、pH7.5恒溫震蕩培養60h。

上述沙福芽孢桿菌YJC-4在防治煙草黑脛病中的應用。

進一步地，沙福芽孢桿菌YJC-4在防治煙草黑脛病中應用的形式為菌液，應用方式為灌根，每株煙苗灌根量共1×10⁷-9×10⁷cfu。

更進一步地，灌根采用分三次灌根的形式，第一次在煙株生長到5-6片真葉時，以后每隔7天灌根一次。更進一步地，三次灌根量相同。

上述沙福芽孢桿菌YJC-4在促進煙草生長中的應用。

進一步地，沙福芽孢桿菌YJC-4在促進煙草生長中應用的形式為菌液，應用方式為灌根，每株煙苗灌根量共1×10⁷-9×10⁷cfu。

更進一步地，為使拮抗菌更好地定植在煙株的根部，煙苗在移栽至生長田中前在1×10⁶-9×10⁶cfu/mL的YJC-4菌液中浸根20-40min。

本發明從煙草根際土壤中分離篩選到1株對煙草黑脛病菌具有較好拮抗活性，且對煙株具有良好促生作用的沙福芽孢桿菌YJC-4，具有以下優勢：

(1)生防效果好：在盆栽試驗中，用YJC-4菌液處理接種煙草黑脛病菌的煙草植株，防治效果達到81.59％，顯著優于58％甲霜·錳鋅和生物制劑枯草芽孢桿菌的防治效果，在煙草黑脛病的生物防治方面具有潛在的應用價值，發展和應用前景良好。生物防治對環境友好、不易產生抗藥性、對人畜安全，為煙草綠色防控發展創造條件。

(2)促生效果好：YJC-4菌液對煙株的生物量及農藝性狀均具有顯著的促進效果，與對照組差異顯著。

附圖說明

圖1拮抗菌YJC-4對煙草黑脛病菌的抑制作用(A為對照、B為YJC-4菌株)；

圖2在掃描電子顯微鏡下，YJC-4拮抗菌的形態結構；

圖3溫度對YJC-4菌株生長量的影響；

圖4 pH對YJC-4菌株生長量的影響；

圖5培養時間對YJC-4菌株生長量的影響；

圖6 YJC-4的16S rDNA擴增條帶；

圖7拮抗菌YJC-4的16S rDNA序列系統發育樹；

圖8幾種不同處理的煙株生長情況。

沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)YJC-4，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2016年4月15日，保藏編號為CGMCC No.12356。

具體實施方式

下面結合具體實施例及附圖對本發明做進一步詳細說明。

所有實施例中用到的材料如下：

主要試劑和材料如下：

DNA快速提取試劑盒Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit為全式金生物技術有限公司產品(貨號EE161-01)；

革蘭氏染色試劑盒為索萊寶產品(貨號G1060)；

58％甲霜·錳鋅可濕性粉劑為江蘇靈寶化學有限公司生產；

枯草芽孢桿菌可濕性粉劑由德強生物公司生產；

其他藥劑均為國藥分析純。

煙草品種：紅花大金元(易感品種)，由國家煙草改良中心提供。

煙草黑脛病菌(Phytophthora nicotianae)：由國家煙草改良中心提供。

拮抗菌分離、培養和測定所用的培養基如下：

拮抗菌的培養和分離選用營養瓊脂培養基NA(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1L，調節pH6.8)，和營養肉湯培養基NB(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，蒸餾水1L)。

抑菌活性測定選用燕麥培養基OA(燕麥片18g，瓊脂18.0g，蒸餾水1L，調節pH6.8)。

生理生化性狀測定選用運動型培養基(明膠80g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂4g，蒸餾水1L，調節pH6.8)。

檸檬酸鹽利用情況選用檸檬酸鹽瓊脂培養基(MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄H₂PO₄ 1g，K₂HPO₄，檸檬酸鈉2g，溴麝香草酚藍80mg，瓊脂15g，蒸餾水1L，調節pH6.8)。

厭氧生長情況選用葡萄糖肉湯培養基(營養肉湯8g，20％葡萄糖貯液50mL，蒸餾水950mL，調節pH7.0)。

實施例1沙福芽孢桿菌YJC-4的篩選及其對黑脛病菌的拮抗作用

1.1拮抗菌的分離和篩選：

從貴州開陽、清鎮，四川攀枝花、西昌，山東諸城、沂水、即墨等地共采集土壤87份，為獲得高效拮抗菌，選取5-10cm深處的黑脛病株根部土壤及相鄰健康植株根部土壤，做好標記后，保存于-20℃的冰箱中待用。

對采集的87份土壤分別進行以下處理：首先將土壤中的根、莖、葉等雜物除去，進行壓碎過20目篩。用電子天平稱取5g處理后的土壤，放進100mL錐形瓶中，并加水定容至50mL，震蕩均勻，取上清液1mL梯度稀釋至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍。用移液槍分別吸取各稀釋溶液200μL，并分別用涂布器均勻涂布在NA固體培養基上，封口后，倒置放于37℃培養箱恒溫培養48h。無菌水作為空白對照，3次重復。挑取生長性狀不同的單菌落324株，作為拮抗菌的候選菌，進行純化培養(用接種環挑取單菌落，在NA固體培養基上劃線，封口后，放于37℃培養箱恒溫培養48h，按照上述步驟重復1-2次，獲得純化的單菌落)。

1.2拮抗菌候選菌對黑脛病菌的拮抗作用：

運用對峙培養法，用滅菌的打孔器(直徑10mm)將煙草黑脛病菌接種到OA平板培養基的中心處，在煙草黑脛病菌塊平行兩側離中心點25mm處平行兩側劃兩條短線(用接種環沾取少量菌液后，在培養基上劃兩道，長度約0.5cm)，此為處理組，對照組采用不含候選菌的空白OA培養液。然后倒置放在28℃恒溫培養箱中培養4天，觀察黑脛病菌周圍有無抑制帶，并利用十字交叉法測量其抑菌直徑大小d(mm)。對照不接種候選菌，其他均相同。

抑菌率計算公式如下：

抑菌率(％)＝(對照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/處理組菌落直徑]×100％。

在324株候選菌中，有12株的抑菌直徑達到39.90-58.20mm，相對抑制率在46％-73％之間，見表1。其中YJC-4菌株對煙草黑脛病抑菌效果最好，其抑菌直徑達到58.20mm，相對抑制率達到72.30％，具有較好的抑菌效果，見圖1。

表1拮抗細菌對煙草黑脛病的平板拮抗效果

注:數字后不同的小寫英文字母表示差異顯著(P＜0.05),下同。

1.3菌株YJC-4的形態學鑒定

在NA培養基上，YJC-4菌落均呈乳白色，表面光滑，不透明。

通過電子掃描顯微鏡觀察YJC-4菌株的形態、結構，步驟如下：(1)取樣：將YJC-4菌株接種到NB培養基中進行震蕩恒溫培養48h，取其菌液樣品進行離心(3000rpm)，去除上清液后，加入pH為7.0，0.01mol/L的PBS緩沖液充分清洗。(2)固定：用2.5％的戊二醛和2％鋨酸進行固定，PBS清洗。(3)脫水處理：用乙醇的PBS溶液按30％，50％，70％，90％濃度梯度進行樣品處理，后經過100％乙醇充分脫水，再經乙醇和叔丁醇混合液脫水10min，最后放置叔丁醇中脫水處理。(4)冷凍干燥。(5)噴施Pt粉后，在電子掃描顯微鏡上觀察其形態結構。圖2顯示，菌株YJC-4的菌體為桿狀，內生芽孢，大小為0.2-0.4×1.0-2.0μm。

1.4生理生化性狀鑒定

參考《植病研究方法》(方中達編著，中國農業出版社出版)，鑒定YJC-4菌株的革蘭氏染色陽性/陰性，運動性，氧化酶，在葡萄糖培養基中厭氧生長狀況，是否水解淀粉，檸檬酸鹽利用情況，V.P.測驗，7％氯化鈉生長狀況等鑒定。

結果顯示，YJC-4菌株在顯微鏡中觀察革蘭氏染色顯紫色，為革蘭氏陽性菌，具有一定的運動性，氧化酶顯陰性，V.P.測驗顯陽性，可以利用檸檬酸鹽，不能水解淀粉，在葡萄糖培養基中厭氧條件下不能生長，在7％氯化鈉中生長。

1.5菌株YJC-4的最適培養條件

1.5.1溫度對菌株YJC-4生長量的影響：以5％接種量將YJC-4菌株接種到pH7.0的液體NB培養基中，震蕩均勻，分別放在20℃、25℃、27.5℃、30℃、32.5℃、35℃、40℃、45℃的恒溫培養箱中120r/min培養2d，通過紫外分光光度計測定拮抗菌的濃度，來反映其生長量的大小。

如圖3所示：隨著溫度的增加，YJC-4拮抗菌的生長量總體呈“先迅速增加后迅速減少”的趨勢，最適溫度為35℃，其次為32.5℃。在高溫低溫條件下，生長均受到嚴重抑制。

1.5.2pH對菌株YJC-4生長量的影響：以5％接種量將YJC-4菌株接種到液體NB培養基中，初始pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，震蕩均勻，在30℃培養箱中120r/min發酵2d，測定拮抗菌的濃度。

如圖4所示：隨著pH的增加，YJC-4拮抗菌的生長量總體呈“先迅速增加后迅速減少”的趨勢，最適pH為7.5，其次為7.0，當pH<5.5時，菌落幾乎不生長；在pH>9.0時，菌落生長量減少嚴重，表明YJC-4拮抗菌不耐強酸強堿。處理間不同pH對YJC-4拮抗菌的生長量存在顯著性差異，表明pH是YJC-4拮抗菌生長的重要因素。

1.5.3發酵時間對菌株YJC-4生長量的影響：以5％接種量將YJC-4菌株接種到液體NB培養基中，在30℃培養箱中120r/min震蕩培養，分別于0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取樣拮抗菌的濃度。

如圖5所示：隨著培養時間的增加，YJC-4拮抗菌的生長量總體呈“先迅速增加后基本保持不變”的趨勢，60h表現生長量最高，其次為48h。

1.6菌株YJC-4的16S rDNA鑒定

(1)根據DNA快速提取試劑盒的要求與步驟，取過夜培養的YJC-4菌液1mL，通過Resuspension Buffer11、Lysis Buffer將細胞裂解，再經過RNase A、Binding Buffer11、Clean Buffer、Wash Buffer去除雜質，最后通過Elution Buffer洗脫，得到菌株YJC-4的基因組DNA，-20℃保存。(2)以菌株YJC-4的基因組DNA為模板，以799F(5'-AACAGGATTAGATACCCTG-3')和R1492(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')作為引物擴增其16S rDNA序列；50μL擴增體系：模板1μL，正反向引物各1μL，2×EasyPCR Super Mix 25μL，超純水22μL；PCR反應程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35個循環，72℃10min。PCR產物經過1.5％的TAE瓊脂糖凝膠電泳并EB染色，得到明亮的條帶，右側為YJC-4的16S rDNA條帶，條帶顯示分子大小為750bp，如圖6所示。(3)PCR產物委托青島擎科生物技術有限公司進行序列測定，測得該菌的16S rDNA核苷酸序列長度為670bp，序列信息見序列表中SEQ ID No.3，GenBank登錄號為KX663830；(4)測序結果利用BLAST軟件進行同源性比較，用MEGA5.1的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。由圖7可知，YJC-4與沙福芽孢桿菌Bacillus safensis(JF411315.1)進化關系最近，同源性達到99％。根據平板抑菌效果、形態學鑒定、生理生化性狀分析、最適生長條件探究和16S rDNA序列同源性分析，由此推斷，YJC-4鑒定為沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)。

實施例2沙福芽孢桿菌YJC-4防治煙草黑脛病的盆栽試驗

取三株生長到5-6片真葉的紅花大金元煙草植株盆栽，分別在相同條件下接種黑脛病菌：用小刀輕輕劃傷煙株的根基部，將培養好的黑脛病菌接種到傷口處。

圖8所示的為三種不同處理的煙株生長情況：1號為接種黑脛病菌后，立即灌根20mL(2±0.5)×10⁶cfu/mL YJC-4拮抗菌液后7天的生長狀況；2號為黑脛病菌接種后3天，未使用YJC-4拮抗菌，煙株發病狀況；3號為黑脛病菌接種后7天，未使用YJC-4拮抗菌，煙株發病狀況。表明拮抗菌液對黑脛病具有較好的防治效果，有利于進行下一步深入研究。

實施例3沙福芽孢桿菌YJC-4防治煙草黑脛病防效的盆栽試驗

將搖培好的YJC-4菌液，菌液濃度約(2±0.5)×10⁸cfu/mL，稀釋100倍后，對盆栽生長到5-6片真葉的紅花大金元煙草植株進行灌根處理，同時將煙株在相同條件下接種黑脛病菌：用小刀輕輕劃傷煙株的根基部，將培養好的黑脛病菌接種到傷口處。每隔7天施一次藥劑，共施3次。對照藥劑用58％甲霜·錳鋅可濕性粉劑和1000億/g枯草芽孢桿菌粉劑分別500倍液噴霧接種黑脛病菌的煙株，空白對照用等量的無菌水處理，其他均相同，具體操作見表2。每個處理20株，3次重復。于第三次施藥處理后7天調查發病率(％)、病情指數和相對防治效果(％)。分級標準按照中華人民共和國煙草行業標準(YC/T39—1996)規定執行。

發病率＝病株數/煙株總數×100％。

病情指數＝100×∑(各級病株數×各級代表值)/(調查總株數×最高級代表值)。

以株為單位分級調查。

0級：全株無病。

1級：莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3以下葉片凋萎。

3級：莖部病斑環繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2葉片輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑。

5級：莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環繞莖圍，或1/2～2/3葉片凋萎。

7級：莖部病斑全部環繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎。

9級：病株基本枯死。

相對防治效果(％)＝(對照組病情指數—處理組病情指數)/對照組病情指數×100％。

以上數據采用DPS數據處理系統Duncan新復極差法進行方差分析計算。

表2藥劑試驗具體操作表

表3的盆栽試驗結果表明，在第三次施藥處理7天后，YJC-4拮抗菌具有較好的防治效果，YJC-4拮抗菌處理的煙株，發病率為11.13％，病情指數為5.32，防治效果達到81.59％；與58％甲霜·錳鋅相比，YJC-4處理的菌株發病率略高，但差異不顯著，處在同一水平上；YJC-4處理的煙株病情指數最小，防治效果最高，與58％甲霜·錳鋅和1000億/g枯草芽孢桿菌處理的煙株差異不顯著。說明YJC-4拮抗菌對黑脛病的防治效果最好，與58％甲霜·錳鋅可濕性粉劑和1000億/g枯草芽孢桿菌防治效果相當，表明YJC-4拮抗菌具有較好的推廣價值。

表3菌株YJC-4對煙草黑脛病的溫室防治效果

標注：數據表示平均值±標準誤，數據采用Duncan氏新復極差法，不同小寫字母和大寫字母分別表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

實施例4沙福芽孢桿菌YJC-4的促生試驗

為驗證YJC-4拮抗菌對煙株的促進生長作用，首先，將生長到5-6片真葉的煙苗從假植盤中移出，在預先配制好的供試拮抗菌液(1×10⁶cfu/mL)中浸根，30min后取出并移栽于裝有滅菌土的花盆中。移栽緩苗3d后，用拮抗菌液分別對煙株灌根處理，10mL/株，每次重復10株，3次重復，空白對照用等量的清水進行處理。在溫度為28℃，濕度約為80％的溫室條件下培養觀察。分別于移栽后15d、30d、45d，從30棵中隨機選取10株煙草并記錄促生指標，測量整株鮮質量、整株干質量、根部鮮重、根部干重，分析拮抗菌對煙株生物量的促生效果；測量其平均株高、平均根長、最大葉長、最大葉寬，分析拮抗菌對煙株農藝性狀的促進效果。

YJC-4拮抗菌對煙株生物量的促生作用：

如表4所示，隨著煙株的生長發育，探究拮抗菌對其生物量的促生作用，分別于移栽后15、30、45天調查了拮抗菌對整株鮮質量、整株干質量、根鮮重、根干重的影響。研究表明，拮抗菌對煙株生物量的促進作用顯著。

9月24日(移栽后15天)調查，YJC-4拮抗菌能促進煙株生物量的生長，其中對根干重的促進作用最為明顯，YJC-4與CK相比差異性極顯著，增長率達到38.46％。其他指標促生作用差異性不顯著，表明移栽后15天，拮抗菌對煙株生物量的促進作用不明顯。

10月09日(移栽后30天)調查，與對照相比，YJC-4拮抗菌對煙株的整株鮮質量、整株干質量、根鮮重、根干重的促進作用明顯，均達到極顯著性差異。YJC-4拮抗菌對根干重的促進作用明顯，增長率為38.46％。

10月24日(移栽后45天)調查，與對照相比，YJC-4拮抗菌對煙株的整株鮮質量，整株干質量、根鮮重、根干重的促進作用明顯，均達到極顯著性差異，YJC-4拮抗菌對整株干質量、根干重的促進作用最明顯，增長率分別為50.00％、62.09％，拮抗菌對煙株生物量的促生作用明顯，可以有效促進煙株的物質積累。

表4拮抗菌對煙株生物量的促生作用

注:同列數據上標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)，下同。

YJC-4拮抗菌對煙株農藝性狀的促生作用：

如表5所示，探究拮抗菌對其農藝性狀的促生作用，分別于移栽后15、30、45天調查了拮抗菌對株高，根長、最大葉長、最大葉寬的影響。研究表明，拮抗菌對煙株農藝性狀的促進作用顯著。

9月24日(移栽后15天)調查，YJC-4拮抗菌能明顯促進煙株的農藝性狀，其中對根長、最大葉長和最大葉寬的促進作用最為明顯，與CK相比差異性極顯著，株高與CK相比差異性顯著。

10月09日(移栽后30天)調查，YJC-4拮抗菌對煙株的株高、根長、最大葉長和最大葉寬的促進作用明顯，均達到極顯著性差異，其中YJC-4拮抗菌對株高和最大葉長的促進作用最明顯，對株高的增長率為17.03％，對最大葉長的增長率為17.88％。

10月24日(移栽后45天)調查，YJC-4拮抗菌對煙株的株高、根長、最大葉長和最大葉寬的促進作用明顯，均達到極顯著性差異，且YJC-4拮抗菌對根長的促進作用明顯，增長率為25.59％。表明YJC-4拮抗菌對煙株的生物性狀有明顯促生作用。

表5拮抗菌對煙株農藝性狀的促生作用

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省煙草科學研究院；中國農業科學院煙草研究所；貴州省煙草公司貴陽市公司

<120> 沙福芽孢桿菌YJC-4及其在防治煙草黑脛病和促生長中的應用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 799F

<400> 1

aacaggatta gataccctg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1492

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 670

<212> DNA

<213> Bacillus safensis

<400> 3

cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 60

ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 120

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 180

cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag ggctttccct tcggggacag agtgacaggt 240

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 300

aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 360

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 420

gtgctacaat ggacagaaca aagggctgca agaccgcaag gtttagccaa tcccataaat 480

ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 540

tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 600

ccacgagagt ttgcaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttatggaccc cccccccaaa 660

gggggggcaa 670