一種提高MTSase和MTHase產量的方法與流程

本發明涉及一種提高mtsase和mthase產量的方法，屬于發酵工程和酶工程技術領域。

背景技術：

海藻糖(trehalose)是一種常見的天然糖類，具有獨特的理化性質和生物功能，對生物分子具有特殊的保護作用。目前海藻糖的制備方法包括天然生物提取法、微生物發酵法、化學合成法、基因工程法和酶轉化合成法。其中，酶法制備海藻糖研究的最多，應用的也最廣泛。

生物體內存在著不同的海藻糖合成途徑及其相關的酶系，可以通過提取生物體內的酶系或將這些酶系的基因進行異源克隆表達，并利用這些酶系催化底物生成海藻糖，實現海藻糖的大規模制備。酶法制備海藻糖的方法通常包括磷酸化酶法、海藻糖合酶單酶法、mtsase和mthase雙酶法三種方法。

雙酶法是由麥芽糖基海藻糖合成酶(mtsase)和麥芽糖基海藻糖水解酶(mthase)共同作用于直鏈淀粉或麥芽糊精生成海藻糖，反應產物主要為海藻糖，以及少量副產物(如葡萄糖、麥芽糖等)。其以淀粉為原料，生產成本低，且副產物少，易于產物的分離純化，適合工業化生產。但是在實際應用過程中，兩種酶的分別發酵就需要投入雙倍的生產資源，大大的增加了生產成本。因此尋求一種節約生產成本的方法就成了雙酶法應用中需解決的問題。關于mtsase和mthase的來源，目前已報道的文獻中，主要包括嗜熱硫礦硫化葉菌，芝田硫化葉菌，嗜酸熱硫礦硫化葉菌，分支節桿菌，微黃短桿菌，根瘤菌，谷氨酸棒狀桿菌等。從耐熱古菌芝田硫化葉菌、嗜酸熱硫化葉菌中克隆了trey、trez用大腸桿菌來表達，獲得了具有相應酶活的蛋白，但活性不高，部分蛋白以不溶性包涵體形式存在；用ptrc99a做表達載體，在e.colibl21(de3)中異源表達出sulfolobussolfataricus來源的mtsase和mthase，活性分別為31.3u/g(wetcell)和400u/g(wetcell)。以e.colibl21(de3)為宿主表達谷氨酸棒桿菌來源的mtsase，其發酵液酶活力為45.09u/ml。現有報道的mtsase或mthase的生產菌株酶活難以滿足工業化需求，因此，為了盡快推進海藻糖的工業化生產，急需高mtsase和mthase酶活及產量。

技術實現要素：

本發明第一個目的是提供一種產mtsase和/或mthase的重組大腸桿菌，是以大腸桿菌為宿主，表達來源于arthrobacterramosus的編碼麥芽糖基海藻糖合成酶和/或麥芽糖基海藻糖水解酶的基因。

在本發明的一種實施方式中，所述基因來源于arthrobacterramosuss34。

在本發明的一種實施方式中，所述編碼麥芽糖基海藻糖合成酶的基因序列如seqidno.1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述編碼麥芽糖基海藻糖水解酶的基因序列如seqidno.2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21、e.colibl21(de3)、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10中的任意一種。

在本發明的一種實施方式中，所述基因是以pet-24a或petdue-1為載體進行表達。

本發明第二個目的是提供一種表達mtsase和/或mthase的重組大腸桿菌的構建方法，是將編碼mtsase和/或mthase與載體連接，轉化至大腸桿菌中。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是以pet-24a或petdue-1為載體。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是以e.colibl21(de3)為宿主。

在本發明的一種實施方式中，所述方法還可以以e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10中的任意一種為宿主。

在本發明的一種實施方式中，所述構建方法具體如下：

1)將seqidno.1或seqidno.2所示目的基因連接到載體pet-24a上，轉化e.colijm109，涂布具有抗性的lb平板，pcr、雙酶切驗證陽性轉化子，獲取重組質粒pet-24a-trey或pet-24a-trez；

2)將重組質粒pet-24a-trey或pet-24a-trez轉化進入大腸桿菌中，涂布具有抗性的lb平板，pcr、雙酶切驗證陽性轉化子。

在本發明的一種實施方式中，所述構建方法具體如下：

(1)將目的基因seqidno.1連接到載體petduet-1的第一個多克隆位點上獲取重組質粒petduet-1-trey，再將目的基因seqidno.2連接到載體petduet-1-trey上的第二個多克隆位點上，獲得重組質粒petduet-1-treytrez；

(2)將兩種重組質粒分別轉入到e.colibl21(de3)中，得到重組菌株e.colibl21(de3)/petduet-1-treytrez。

在本發明的一種實施方式中，所述構建方法具體如下：

(1)將目的基因seqidno.2連接到載體petduet-1的第一個多克隆位點上獲取重組質粒petduet-1-trez，再將目的基因seqidno.1連接到載體petduet-1-trez上的第二個多克隆位點上，獲得重組質粒petduet-1-treztrey；

(2)將兩種重組質粒分別轉入到e.colibl21(de3)中，得到重組菌株e.colibl21(de3)/petduet-1-treztrey。

本發明的第三個目的是提供一種利用所述的重組大腸桿菌生產麥芽糖基海藻糖合成酶和/或麥芽糖基海藻糖水解酶的方法，是將所述重組大腸桿菌接種至發酵培養基中，37℃培養8～14h,以0.1-0.8g·l^-1·h^-1的流速流加乳糖，并在27～37℃誘導10～20h。

在本發明的一種實施方式中，所述誘導是在27～32℃進行誘導。

在本發明的一種實施方式中，所述方法具體如下：將在-80℃的甘油管中保藏的菌種以2‰的接種量接種到lb培養基中，并于37℃、200rpm的條件培養10小時；之后，以5％的接種量轉接到發酵培養基中，37℃培養8～14h后，加入誘導劑進行誘導并改變溫度，繼續發酵；發酵培養結束后離心，收集菌體，破壁，離心所得上清液即為所需粗酶液。

在本發明的一種實施方式中，所述破壁采用超聲破碎儀或高壓勻漿機。

在本發明的一種實施方式中，所述發酵培養基每l含有：磷酸氫二氨4.0g，磷酸二氫鉀13.5g，檸檬酸1.7g，七水硫酸鎂1.4g，蛋白胨1.2g，酵母膏2.4g，甘油8.0g，金屬離子液10ml，加氨水調ph至6.5～7.5。

金屬離子液：以5mhcl為母液，feso4·7h2o10g/l，znso4·7h2o2.25g/l，cuso4·5h2o1.0g/l，mnso4·4h2o0.5g/l，na2b4o7·10h2o，0.23g/l，cacl22.0g/l，(nh4)6mo7o240.1g/l。

本發明的第四個目的是提供一種制備海藻糖的方法，是將所述重組大腸桿菌添加至液化的玉米淀粉底物中，控制重組大腸桿菌中胞內mtsase和mthase的酶活分別≥7.5u/g底物，再加入4～8u/g普魯蘭酶于42～45℃反應30～40h。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是將所述重組大腸桿菌進行發酵，將發酵后的菌體破壁取上清添加至液化的玉米淀粉底物中，控制所加入mtsase和mthase的酶活分別≥7.5u/g底物，再加入5u/g普魯蘭酶于45℃反應30～40h。

本發明還提供一種編碼麥芽糖基海藻糖合成酶的基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本發明還提供一種編碼麥芽糖基海藻糖水解酶的基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發明還提供所述重組菌在食品、生物、化工領域生產發酵食品中的應用。

有益效果：本發明首次將athrobacterramosuss34來源的mtsase和mthase基因在e.colibl21(de3)中表達，且經發酵優化酶產量較高，未將其他來源的mtsase和mthase基因在e.colibl21(de3)中進行表達。同時創造性地將mtsase和mthase同時在一株菌中表達，并且經過發酵優化共表達菌株中mtsase的表達量能夠達到與mtsase單表達的表達量相持平的水平。重組兩種酶共同作用生產海藻糖，原料來源廣泛，生產成本較低。

附圖說明

圖1：不同誘導濃度下mtsase發酵菌濃；

圖2：不同誘導濃度下mtsase發酵過程酶活；

圖3：不同誘導溫度下mtsase發酵菌濃；

圖4：不同誘導溫度下mtsase發酵過程酶活；

圖5：不同誘導濃度下mthase的生長情況；

圖6：不同誘導濃度下mthase的酶活；

圖7：不同誘導溫度下mthase的生長情況；

圖8：不同誘導溫度下mthase的酶活；

圖9：不同mtsase添加量下海藻糖的轉化率；

圖10：不同mthase添加量下海藻糖的轉化率；

圖11：不同誘導濃度下mthase發酵菌濃；

圖12：不同誘導濃度下mthase發酵過程酶活；

圖13：不同誘導溫度下mthase發酵菌濃；

圖14：不同誘導溫度下mthase發酵過程酶活；

圖15：不同誘導溫度下的mtsase酶活性；

圖16：不同誘導溫度下的mthase酶活性；

具體實施方式

mtsase和mthase酶活測定

1)mtsase酶活力測定：用20mmol·l^-1ph6.0的磷酸-檸檬酸緩沖液，將麥芽五、六糖配成10g/l的溶液，取0.19ml該溶液，加入10μlmtsase粗酶液，50℃反應2h，100℃沸水中煮10min終止反應取100ul反應液，加入900ul水和1mldns溶液，沸水浴7min，加水定容至10ml，540nm測吸光度。根據麥芽六糖濃度標準曲線計算酶活單位。mtsase的酶活單位定義為每1min水解1μmol麥芽五糖生成麥芽四糖基海藻糖所需的酶量。dns試劑配置：準確稱取6.5g3,5-二硝基水楊酸(dns)于500ml燒杯中，用少量蒸餾水溶解，加入2molnaoh(21.0g)溶液262ml，再加到含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加入5ml預先在熱水浴中溶化的苯酚和5.0g無水亞硫酸鈉，攪拌直至完全溶解后定容至1l，并存儲于棕色瓶中，放置一周后即可使用。

2)mthase酶活力測定：用20mmol·l^-1ph6.0的磷酸-檸檬酸緩沖液，將麥芽六糖配成。

sequencelisting

<110>江南大學

<120>一種提高mtsase和mthase產量的方法

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<170>patentinversion3.3

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