本發明涉及生物醫藥技術領域，具體而言，本發明涉及一種具有人體免疫功能增強功效的多肽類物質及其制備方法和醫藥用途。該多肽類物質為提取分離自藥用昆蟲美洲大蠊的活性物質。
背景技術：
美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)俗稱蟑螂，為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲。美洲大蠊入藥始載于《神農本草經》，其中把它列為中品，謂“味：咸、寒；治：血瘀癥堅寒熱、破積聚、喉咽閉、內寒無子”(孫星衍等，《神農本草經》，商務印書館，1955:90)。“蟑螂”為其俗名首見于《本草綱目拾遺》，也稱其為石姜、滑蟲；各地方有其不同的稱法，如：偷油婆、茶婆子、灶螞子等。蜚蠊科(Blattidae)是一個龐大的昆蟲家族，在地球上已生存了3.2億年，與恐龍屬同一時代出現的生物；無疑它是世界上生命力最強、最古老、至今繁衍最成功的昆蟲類群之一。1960年Princis曾報道蜚蠊在世界范圍內約有3500種，我國已有記錄的共253種(馮平章，郭予元，吳福禎，中國蟑螂種類及防治，北京：中國科學技術出版社，1997年4月)。其主要分布于熱帶、亞熱帶地區的室內或野外，美洲大蠊是其中少數幾種家居蜚蠊品種之一；主要棲息于廚房、食堂、倉庫等處損害食物、衣服、書籍等。美洲大蠊作為室內害蟲，取食并污染人的食物，傳播痢疾、傷寒、蛔蟲、蟯蟲等多種疾病。從廚房和倉庫等收集到的226只蟑螂體表及腸道內檢出致病菌25種，感染率高達99.9％(Pai H.H.等，Isolation of bacteria with antibiotic resistance from household cockroaches(Periplaneta americana and Blattella germanica)，Acta Tropica，2005，93(3):259)。蟑螂作為害蟲是城市衛生防疫部門和海關檢疫部門重點防治對象之一。然而，在科技日新月異的今天，面對上千種針對它的各種殺滅劑，這一昆蟲群體依然十分活躍，這表明其體內具有某些特殊的物質和其特有的作用機制，此引起了國內外一些學者的關注。
近幾年來隨著我國對傳統中醫藥資源研究開發的重視，有些學者對這一幾千年來無法根絕的害蟲進行了應用開發方面的研究，并取得了可喜的成就，發掘出了這一傳統意義上的害蟲的正面價值。以美洲大蠊醇提物制成的產品“康復新”，在燒傷、燙傷等外傷創面的良好療效；從美洲大蠊醇提物中精制而成的“心脈龍注射液”，具強心升壓，改善微循環，興奮呼吸，利尿，增加心、腦、肺、腎的血流量。“心脈龍注射液”主治：右心衰，也可治急慢性心衰、失血性休克、低血壓、室性早博、病竇性綜合癥、心腦缺血性疾病，為2004年通過中國國家食品藥品監督管理總局(CFDA)審批的國家二類新藥(中藥)。
藍江林等利用大腸桿菌、溴氫菊酯、昆蟲生理鹽水、紫外線、超聲波作為誘導源進行誘導，獲得具有抗菌活性的血淋巴，在經誘導的美洲大蠊血淋巴中提取分離得到抗菌肽成分。對經大腸桿菌誘導的美洲大蠊的血淋巴進行抑菌作用測試，結果發現大腸桿菌的數量在一定的測試時間內逐漸減少。該研究還通過電鏡觀察表明：經誘導的美洲大蠊學血淋巴中的抗菌肽首先使細菌的外層及細胞質膜損傷，形成開口，導致內容物外泄而死亡，最后菌體崩解成碎片。因此認為美洲大蠊抗菌肽對大腸桿菌不是一般的抑菌作用，而是直接殺滅作用。(藍江林，周先治，卓侃等，美洲大蠊(Periplaneta americana L.)抗菌肽殺菌作用初步觀察，福建農林大學學報(自然科學版)，2004，33(2):166)。對蜚蠊科昆蟲澳洲大蠊(Periplaneta australasie Fabricus)全蟲(去翅及足)的油狀醇提取物進行的體內篩選證明：澳洲大蠊提取物對S-180及人食管癌小鼠異種移植均有顯著的抗癌作用(黃厚聘，程才芬，李淑芳，蟑螂油的抗癌作用，中草藥，1981，12(1):35)。陳利銘發現蟑螂提取物AT2能增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，并能使脾臟重量增加，在體外可增加T淋巴細胞對刀豆蛋白A(Con A)的轉化反應(陳利銘，蟑螂提取物AT2抗癌作用的臨床及實驗研究，中西醫結合雜志，1986，(11):648)。AT2治療原發性肝癌49例，臨床觀察表明：其具有緩解癥狀、使甲胎蛋白下降、延長患者生存期的功效。在臨床應用方面，蟑螂活蟲提取物治療原發性肺癌有良好效果。廖劍英以“康復新”治療惡性纖維組織細胞瘤，取得良好效果(廖劍英，康復新治療惡性纖維組織細胞瘤1例，大理學院學報，2003，2(3):92)。有相關報道表明蟑螂提取物在抗腫瘤的同時具有一定的增強免疫功能的作用(羅志宏，占漢章，李艷紅等，中藥康復新在頭頸部惡性腫瘤治療中的作用觀察，中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜，1998，6(3):132；嚴奉祥等，中藥康復新的在體免疫藥理學特征，大理醫學院學報，1991，3(1):21)。
對美洲大蠊在制藥方面的研究多集中于美洲大蠊中的粗提物，李樹楠等從美洲大蠊的醇提物中除去油脂，用二氧化碳吸附后除去色素和過敏成分，用于治療心血管疾病(國家發明專利CN 1067243C)；劉耀北等用乙酸提取蟑螂提取物，對肝癌細胞BEL7404和BEL7721進行癌細胞增殖抑制試驗，發現粗提物可以有明顯抑制癌細胞生長的作用(國家發明專利CN 1199991C)；廖吉等報道了用6號提取液從蜚蠊蟲體中制備降脂、調節膽固醇、調節血糖、防治腫瘤和預防心血管疾病、抗風濕作用的保健食品(國家發明專利CN 1230183C)；嚴少宏等闡述了一種美洲大蠊粗浸膏的優化提取方式(國家發明專利CN 1255117C)；徐燕和公開了一種類似的粗浸膏制備方法(國家發明專利CN 1548058A)；嚴少宏等公開了一種美洲大蠊粗浸膏綜合利用的的提取方式(國家發明專利CN 1593467A)。
發明人所在研究團隊對蟑螂進行了十余年的研究，所研發的“康復新”、“心脈隆注射液”、“肝龍注射液”取得了3項國家新藥證書，產品已經上市銷售。在我們對美洲大蠊的后續研究中發現：用醇水混合溶劑提取美洲大蠊蟲體具有體外抗單純皰疹病毒的功效(王曉雨，劉光明，宋麗艷等，國家發明專利ZL 200810060885.9)；用濾孔小于5000道爾頓(即<5KDa)的超濾膜進行分離，能得到新的抗單純皰疹病毒和光譜抗菌活性部位(戴志明，楊榮新，張成桂等，國家發明專利ZL 201210137422.4；錢金栿，楊榮新，高鵬飛等，國家發明專利ZL 201210137410.1)。
目前，由于工業發展帶來的環境污染等問題，人類的生存環境質量不斷下降，腫瘤疾病的發病率和致死率也不斷上升。然而目前臨床所用的細胞毒性抗腫瘤藥物和傳統化療藥物在治療惡性腫瘤時，會損傷機體正常組織，并對機體的免疫功能造成損傷，引起機體免疫監視減弱，有利于腫瘤細胞在體內的生長及轉移；另外，此類藥物引起免疫防御減弱增加了外來病原體對機體的入侵，使機體營養消耗進一步增加，從而加重病情。此外，細胞毒性抗腫瘤藥物的治療方式以誘導腫瘤細胞凋亡為主，但長期腫瘤治療可引起腫瘤細胞凋亡通路被修飾，產生耐藥性腫瘤細胞，而此類腫瘤細胞往往具有交叉耐藥性，導致傳統藥物治療效果欠佳。因此，尋找和開發高效低毒副作用的抗腫瘤藥物迫在眉睫。
近年來研究發現，腫瘤患者體內具有殺傷腫瘤作用的免疫細胞如CTL和NK細胞含量降低且功能失調，對腫瘤細胞的識別殺傷能力減弱，與腫瘤的惡化密切相關。多肽類物質作為近年來研究較多的抗腫瘤物質，其前景可觀，一些肽類物質已被證實能夠改善機體免疫，增強機體免疫系統對腫瘤細胞的識別殺傷能力。在發明人團隊對美洲大蠊的深入研究中發明設計了適用于動物藥材活性物質提取分離的方法，從而發現了一個分子量為1355.66道爾頓的短肽化合物；該肽類化合物能夠抑制腫瘤的生長，無明顯毒副作用，與傳統抗腫瘤藥物CTX相比，能增加小鼠體重、脾指數和胸腺指數，增加外周血和脾臟中淋巴細胞、T細胞及NK細胞含量。即，該肽類化合物為一種具有抗腫瘤和免疫調節多種重要生物活性的免疫調節肽。
查新結果顯示，以往均無由藥用昆蟲美洲大蠊得到的本發明涉及的免疫調節肽的相關報道。發明人將該免疫調節肽全序列結構經蛋白數據庫進行搜索比對，未發現有與本發明的免疫調節肽相同的多肽。從而構成本發明。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種從美洲大蠊中提取的免疫調節肽及其制備方法；
本發明的另一目的是提供了從美洲大蠊中提取的免疫調節肽用于制備藥物、日化用品和/或醫療器械的用途；
本發明的又一目的是提供了一種藥物組合物，其特征為該藥物組合物含有治療有效量的從美洲大蠊中提取的免疫調節肽及可藥用輔料；所述藥物組合物可制備成為多種制劑形式，包括水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑。
根據本發明人深入的研究，發現美洲大蠊免疫調節肽可以通過如下方法制備得到：本發明人采用水或水醇溶劑提取得到的美洲大蠊提取物輔以孔徑大小一定的超濾膜進行超濾，得到分子量小于3000道爾頓的有效部位(<3KDa部位)；再以高效液相色譜儀(HPLC)分離得到一種單鏈多肽，該多肽序列為：精氨酸-精氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-亮氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸(NH2-RRNLLAASLLND-COOH)。本發明的美洲大蠊免疫調節肽還可以通過人工合成的方法制備得到。
本發明中的動物藥材可以是藥用昆蟲美洲大蠊(Periplaneta americana)頭、身、翅，也可以是它們的混合物，優選全蟲。可以是干燥全蟲，也可以是未經干燥的全蟲或活體全蟲。
本發明得到的美洲大蠊免疫調節肽具有重要的生物活性，其在7.8毫克/公斤體重時對荷瘤小鼠(MFC胃癌細胞)的腫瘤生長抑制率即已達到46.2％，超過美洲大蠊粗提物(400毫克/公斤)的31％和美洲大蠊經大孔樹脂柱層析富集的抗腫瘤有效部位(400毫克/公斤、200毫克/公斤)的33.11％、42.88％；美洲大蠊免疫調節肽能顯著增加荷瘤小鼠的體重，升高白細胞總數、淋巴細胞及單核細胞，并能升高脾指數及胸腺指數、增加脾淋巴細胞總數及NK細胞比例、增加脾T細胞比例等，提示美洲大蠊免疫調節肽具有增強機體免疫功效的作用。
美洲大蠊免疫調節肽可以與藥學上常用的輔料或載體結合，制備得到具有增強人體免疫功能作用的水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑，還可以采用現代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。以上說明本發明所提供的美洲大蠊免疫調節肽與現有技術相比，具有開發成為創新型抗腫瘤藥物或免疫調節藥物的新穎性及巨大潛力，據此完成本發明。
本發明的有益之處在于：本發明提供的美洲大蠊免疫調節肽既可以從美洲大蠊蟲體中分離純化得到，也可以通過人工合成方法制備得到，其原料來源方便易得、制備步驟簡便、生產成本低廉、利于產業化。得到的產物具有顯著的抗腫瘤及免疫調節的藥效活性，對于開發市場廣大的抗腫瘤、免疫調節類藥物、日化用品、醫療器械提供了新的物質基礎，通過規范化養殖蟑螂又能給連片特困地區的農民增加收入、脫貧，具有潛在的社會效益和經濟效益。
具體實施方案
為了更好地理解本發明的實質，下面分別用本發明的美洲大蠊醇免疫調節肽的藥理實驗結果，說明其藥效作用和有益效果。若無特別說明，本發明的百分比指的是重量百分比。必須說明，本發明的實施例是用于說明本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬于本發明要求保護的范圍。
實施例1：美洲大蠊免疫調節肽(樣品HFDT1)的制備
主要儀器與試劑：乙腈(Fisher公司，色譜純，批號：134752)、甲醇(Amethyst Chemical公司，色譜純，批號：135586)、三氟乙酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純，批號：20130424)；AJY-2001-U超純水儀(艾科浦國際有限公司)、高效液相色譜儀(Agilent1100，包括：自動進樣器、DAD檢測器、色譜工作站)、Seppak小柱(Waters公司)、離心機、超濾膜(Amicon Ultra Milipore公司，MW＝3KDa)、渦旋混合器。
1.1美洲大蠊醇提物的制備
美洲大蠊藥材3公斤，加75％乙醇10000毫升，室溫浸泡提取，提取3次，每次24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。
1.2采用3KDa超濾膜過濾制備樣品A
美洲大蠊水提物300毫克，用3000毫升超純水及微量氫氧化鈉溶液(濃度：4摩爾/毫升)溶解；調制其pH值為11后，傾入置有孔徑為3KDa的超濾膜(Milipore公司產品)的超濾裝置中，以4500r/min轉速超濾30分鐘。濾液真空干燥，即得分子量<3KDa多肽樣品A(43毫克)，收率：14.33％。
1.3采用固相萃取Sep-Pak小柱制備多肽組分A2
稱取40毫克的樣品A，加入超純水10毫升，渦旋、振蕩使其完全溶解，分別采用超純水(洗脫液為A1組分)、3％乙腈(洗脫液為A2組分)、30％乙腈(洗脫液為A3組分)和100％乙腈作為洗脫液依次洗脫，每一組洗脫液的體積為10毫升，收集A2組分，冷凍干燥。
1.4采用HPLC方法分離純化目標化合物HFDT1
稱取一定量的A2組分，加入超純水溶解，采用微孔濾膜過濾。以乙腈和水作為流動相，采用C18色譜柱(YMC-Pack ODS-A 150mm×4.6mm S-5μm,12nm)進行HPLC分離。通過條件摸索，半制備富集目標化合物，采用檢測波長：254nm、乙腈(A相)和水(B相)為流動相(洗脫梯度如表1所示)、收集保留時間為45-46分鐘的峰，冷凍干燥。將干燥樣品加水溶解，進一步用半制備HPLC純化樣品，得純度超過99％的目標化合物HFDT1。
表1 A2組分HPLC分離梯度洗脫表
1.5目標化合物HFDT1的結構解析
將純度符合要求的HFDT1樣品委托上海中科新生命生物科技有限公司，進行相對分子質量和氨基酸序列分析。其中相對分量的分析采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(4800MALDI-TOF/TOF)對供試品進行分析，氨基酸序列的測定采用PPSQ-33A全自動蛋白質多肽測序儀(SHIMADZU公司)對經Edman降解法處理的樣品進行多肽蛋白質N端的氨基酸排列順序解析。經檢測，HFDT1的氨基酸序列為：精氨酸-精氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-亮氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸(NH2-RRNLLAASLLND-COOH)。
實施例2：美洲大蠊免疫調節肽對MFC荷瘤小鼠免疫的影響
2.1材料和儀器
2.1.1實驗動物及細胞株：6～8周齡SPF級BALB/c小鼠，每只20克左右，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(SYXK(湘)2013-0004)；小鼠胃癌細胞(MFC細胞株)，購于中國科學院上海細胞生物所。
2.1.2實驗儀器：血細胞分析儀(BC-2800Vet，Mindray)，低速離心機(LC-4012，科大創新)，流式細胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)，電子天平(MJ-500，日本Chyo)，CO2培養箱(MCO-18AIC，日本SANYO)，細胞網篩(Cell Strainer，BD Falcon)。
2.1.3主要藥物及試劑：根據實施例1提供的氨基酸序列人工合成短肽HFDT1(經驗證，其分子量為1355.66道爾頓(1.3KDa)，氨基酸序列為：精氨酸-精氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-亮氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸)。環磷酰胺(CTX)(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，FCS(Gibco公司)，RPMI-1640培養基(Gibco公司)，CD3-FITC(Cat：553062，美國BD公司)，CD45-PE(Cat：553090，美國BD公司)，血細胞稀釋液(Sysmex公司)，紅細胞裂解液(新鮮配制：取NH4Cl 41.5克和KHCO3 5克，溶于400毫升去離子水中，用HCl調pH至7.3，定容至500毫升，0.22μm醋酸纖維素膜過濾至無菌容器)。
2.2實驗方法
2.2.1腫瘤細胞體外培養及荷瘤小鼠模型建立：取MFC細胞株常規復蘇，用10％FCS-RPMI-1640完全培養基培養至對數生長期，用PBS將細胞濃度調整為1×107/毫升，0.2毫升/只接種于小鼠腹腔，1周后取小鼠腹腔積液，PBS調整細胞濃度為1×107/毫升，0.2毫升/只接種于實驗組小鼠右側腋下。
2.2.2分組及給藥：于接種腫瘤后次日，將荷瘤小鼠隨機分為模型組、環磷酰胺組、HFDT1組，另設正常對照組。每組12只小鼠，雌性8只，雄性4只。模型組及正常組給予生理鹽水灌胃，20毫升/公斤，1次/天；HFDT1組給予人工合成短肽HFDT1(7.8毫克/公斤，10毫升/公斤)腹腔注射，1次/天；CTX組給予CTX(45毫克/公斤，10毫升/公斤)，隔日腹腔注射1次。連續處理10天。
2.2.3小鼠外周血細胞測定：小鼠末次給藥24小時后，經眼部內眥靜脈取血，迅速量取20微升全血加入到2毫升血細胞稀釋液中，混勻后用血細胞分析儀計數外周血中白細胞、淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、紅細胞及血小板。
2.2.4小鼠抑瘤率及脾、胸腺指數測定：頸椎脫臼處死小鼠后，稱重，無菌取腫瘤、脾臟及胸腺，計算抑瘤率、脾指數及胸腺指數。抑瘤率(％)＝(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100％；脾指數＝脾重(毫克)/小鼠體重(克)×10；胸腺指數＝胸腺重(毫克)/小鼠體重(克)×10。
2.2.5脾細胞熒光抗體染色：將脾臟置于細胞網篩，用10毫升注射器芯部輕柔研磨，制成脾單細胞懸液，離心棄上清，加1毫升紅細胞裂解液，1分鐘后加4毫升3％FCS-PBS洗滌細胞2次，在流式反應管中加入1×106個細胞，加入CD3-FITC和CD45R-PE混合抗體液，4℃避光反應30分鐘，加3％FCS-PBS洗滌2次，FACS Calibur流式細胞儀檢測。
2.2.6統計分析：所有數據均采用SPSS 19.0軟件進行分析，各組數據均以均值±標準差表示。用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P<0.05認為差異具有統計學意義。
3實驗結果
3.1抑瘤率測定
陽性對照(CTX)和試驗藥物(HFDT1)對小鼠MFC腫瘤模型均有抑制作用(P<0.05)(見表2)。
表2小鼠平均瘤重及抑瘤率的比較
a.與模型組比較，P<0.05。
3.2外周血細胞變化
HFDT1組的白細胞總數、淋巴細胞及單核細胞均明顯高于模型組及陽性對照CTX組(P<0.05)(見表3)。
表3小鼠外周血免疫細胞分析(109/升)
a.與正常組比較，P<0.05；b.與模型組比較，P<0.05；c.與陽性對照CTX比較，P<0.05。
3.3體重、脾及胸腺指數測定
HFDT1組小鼠體重，脾及胸腺指數明顯高于陽性對照CTX組(P<0.05)(見表4)。
表4小鼠體重、脾及胸腺指數
a.與正常組比較，P<0.05；b.與模型組比較，P<0.05；c.與陽性對照CTX比較，P<0.05。
3.4脾臟淋巴細胞的分析
流式細胞儀檢測結果顯示：HFDT1組脾淋巴細胞明顯高于陽性對照CTX組(P＜0.05)；與模型組相比，HFDT1組T細胞升高；HFDT1能夠提高脾臟中NK細胞比例(P<0.05)，而陽性對照CTX組中NK細胞則明顯下降(P<0.05)。
4實驗結果
本實施例的實驗結果證實：美洲大蠊免疫調節肽HFDT1能夠抑制腫瘤的生長，無明顯毒副作用，與傳統抗腫瘤藥物CTX相比，能增加小鼠體重、脾指數和胸腺指數，增加外周血和脾臟中淋巴細胞、T細胞及NK細胞含量。因此，美洲大蠊免疫調節肽HFDT1具有顯著的抗腫瘤及提高機體免疫力的作用。實驗結果說明，HFDT1具有進一步開發成為肽類抗腫瘤藥物和/或免疫調節藥物的巨大潛力。
在上述說明書闡述本發明時，同時提供了實施例的目的是舉例說明本發明的實際操作過程和本發明的意義。在進入本發明權利要求和其等同物范圍內時，本發明的實際應用包括所有一般變化、配合，或改進。