本發明屬于生物工程技術領域，涉及抗真菌藥物的微生物發酵，具體涉及紐莫康定B0的微生物發酵方法。
背景技術：
棘白菌素化合物發現于20世紀70年代，是一類具有六元環肽和不同脂肪酸側鏈的微生物次級代謝產物，能夠特異性地作用于真菌細胞壁，非競爭性地抑制真菌細胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶的活性，從而能夠起到抗菌效果，且不對人體產生影響。紐莫康定B0的半合成衍生物卡泊芬凈是首個被報道的棘白菌素類化合物，2001年被美國FDA批準用于曲霉菌感染的治療。目前，卡泊芬凈已成為全身用抗真菌藥市場的王牌藥物。
紐莫康定B0是由霉菌Glarea lozoyensis發酵合成的次級代謝產物。
紐莫康定B0 Cas：135575-42-7
Glarea lozoyensis的發酵產物主要有A0和B0兩種有效產物，除此之外，發酵過程中也會多種環狀六肽的結構類似物，其中C0的結構和B0最為接近，兩者的結構差異在于B0中的反式3-羥基脯氨酸，在C0中是反式4-羥基脯氨酸。在實際生產中，主要采用的是樹脂柱工藝對紐莫康定B0進行提純，柱層析應用于工業化生產時，費時，溶劑使用量大，易造成環境污染，且原料損耗大，使得生產成本大幅提高，C0是紐莫康定B0的異構體，在結構上的差異表現為一個羥基位置的不同；C0雜質不能在反相色譜中與紐莫康定B0分離，只有通過正相色譜分離。發酵液中的C0雜質一般10％，如果不能得到有效的控制，最后得到的是紐莫康定B0和C0的混合物。C0雜質能參與后續反應，嚴重影響醋酸卡泊芬凈的質量。
紐莫康定C0 Cas：144074-96-4
發酵過程中結構類似物的有效控制，能提高后期的分離效率，降低生產成本，因此如何提高B0效價同時降低副產物的比例，是研究人員關注的方向。
技術實現要素：
本發明提供一種新的紐莫康定B0的發酵方法，該方法在提高紐莫康定B0發酵單位的同時，還能降低發酵液中紐莫康定C0的含量，在該方法中使用的菌種為Glarea lozoyensis，所述發酵條件如下：
發酵培養基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七水合硫酸鎂0.05％，MES緩沖鹽1.5％，pH 5.3。
發酵過程中溫度24～26℃，起始通氣量0.5～1.0VVM，罐壓0.04～0.06Mpa。發酵過程中逐漸調高通氣量與轉速使溶氧不低于20％，轉速最大600轉，通氣量最大1.2VVM。
發酵24h后，開始流加氨水，控制pH5.0～5.4。
發酵48h后，開始補加維生素b5，按照培養基的體積，添加量為20～40mg/l。
發酵60h后，開始流加乳糖，流加速度為1.5～2.5％/天(質量體積比)，使發酵液總糖濃度控制在1～3％之間，直到發酵結束。
發酵72h后(通氣量與轉速已調至上限)，根據溶氧量變化調節pH控制范圍，直到發酵結束：溶氧量不低于45％時，控制pH5.0～5.4；溶氧量為35％～45％時，控制pH5.4～5.8；溶氧量為25％～35％時，控制pH5.8～6.2；溶氧量低于25％時，控制pH6.2～6.6。
發酵培養期共10天，10天后放罐。
本發明培養基采用稀配方，發酵過程中流加乳糖和氨水，能夠有效降低菌體粘度，提高通氣效果，同時在發酵過程中嚴格控制pH。
流加乳糖后，發酵液總糖濃度控制在1～3％之間，在這個范圍內菌絲的正常生長代謝是穩定的，過低則影響正常代謝，過高則不利于下一步的放罐提取。
且該方法在發酵液中補加維生素b5，使得紐莫康定C0的含量可由原來的約6％降至1.5％。
現有紐莫康定B0的發酵技術中，紐莫康定B0的發酵單位約為800～1000mg/l，本發明發酵方法可將發酵單位提高至2000～2500mg/l，且紐莫康定C0的含量大幅下降。
具體實施例
實施例1
發酵菌種：Glarea lozoyensis
發酵培養基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七水合硫酸鎂0.05％，MES緩沖鹽1.5％，pH 5.3。
50L發酵罐培養，培養基30L，121℃消毒30分鐘。種量1.5L，發酵液培養溫度25℃，起始通氣量0.9VVM，200轉，罐壓0.05Mpa，發酵過程中逐漸調高通氣量與轉速使溶氧不低于20，轉速最大600轉，通氣量最大1.2VVM。發酵24h后，開始流加氨水，控制pH5.0～5.4。發酵48h后，開始補加維生素b5，添加量為30mg/l。發酵60h后，開始流加乳糖，流加速度為2.0％/天(質量體積比)，使發酵液總糖濃度控制在1～3％之間，直到發酵結束。發酵72h后(此時通氣量與轉速已調至上限)，根據溶氧變化調節pH控制范圍，直到發酵結束：溶氧量不低于45％時，控制pH5.0～5.4，96h溶氧量為35％～45％，控制pH5.4～5.8，110h溶氧量為25％～35％，控制pH5.8～6.2，130h溶氧低于25％，控制pH6.2～6.6，144h溶氧回升至25％，控制pH5.8～6.2，168h溶氧回升至35％，并維持在35％～45％之間，控制pH5.4～5.8，240h發酵結束，放罐，測定紐莫康定B0的發酵單位為2345mg/l，紐莫康定C0的含量為1.5％。