一種應用于草莓上的CRISPR/Cas9載體的構建方法與流程

本發明涉及植物分子生物學領域，尤其涉及一種應用于草莓上的CRISPR/Cas9載體的構建方法。

背景技術：

CRISPR/Cas9技術是自2013年興起的一種高效簡便的基因組編輯技術，目前已在動物、模式植物中得到廣泛應用。CRISPR/Cas9載體主要由Cas9和sgRNA兩個核心部分構成，其中Cas9蛋白主要負責對DNA雙鏈的切割，sgRNA負責對靶序列的識別并引導Cas9蛋白進入切割位點。能夠在植物上應用的CRISPR/Cas9載體中，Cas9基因主要由雙CaMV 35S啟動子或泛素(Ubiquitin)基因啟動子等組成型啟動子啟動，sgRNA片段則由U6 snRNA或U3 snRNA的啟動子啟動。由于物種之間的相對獨立性，不同物種的U6、U3或Ubi啟動子等在其它物種內的啟動強度可能出現不同程度的下降，這在親緣關系較遠的物種間尤為顯著，而Cas9和sgRNA的表達水平與CRISPR/Cas9的編輯效果緊密相關，因此，針對不同物種分別采用物種特異性的啟動子能夠收到更好的效果。

目前，擬南芥的U6-1、U6-26、U6-29啟動子，水稻的U6、U3啟動子，小麥的U3啟動子，玉米的U6、Ubi啟動子等已先后被應用于各自的CRISPR/Cas9載體中，同時根據不同物種的密碼子偏好性分別對Cas9基因序列進行了優化，以盡可能提高Cas9和sgRNA的表達水平，取得了極好的編輯效果。然而，能夠特異性作用于草莓的CRISPR/Cas9載體還未見報道。

技術實現要素：

為克服現有技術存在的上述技術問題，本發明提供了一類能夠特異性應用于草莓上的CRISPR/Cas9載體的構建方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種應用于草莓上的CRISPR/Cas9載體的構建方法，其包括：

S1：構建基礎載體

以pUC19載體為骨架，采用森林草莓的U6 snRNA基因的啟動子和終止子，轉錄sgRNA片段，獲得目標片段序列為SEQ ID NO.1所示的pSG01載體；

以pUC19載體為骨架，采用栽培草莓的U6 snRNA基因的啟動子和終止子，轉錄sgRNA片段，獲得目標片段序列為SEQ ID NO.2所示的pSG02載體；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301載體為骨架，采用森林草莓基因的密碼子偏好性優化Cas9基因序列，以雙CaMV 35S啟動子和NOS終止子轉錄該基因，獲得目標片段序列為SEQ ID NO.3所示的pCCF001載體；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301載體為骨架，采用森林草莓基因的密碼子偏好性優化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi啟動子和NOS終止子轉錄該基因，獲得目標片段序列為SEQ ID NO.4所示的pCCU001載體；

S2：靶序列退火復性：合成互補的Oligo DNA，將合成的Oligo序列進行退火復性獲得DNA雙鏈序列，并稀釋；

S3：pSG01和/或pSG02質粒的酶切：采用限制性內切酶BbsI酶切pSG01和/或pSG02載體，酶切產物經超薄產物純化試劑盒進行回收；

S4：連接和轉化：配置連接體系，將S2獲得的稀釋后的DNA雙鏈序列與S3獲得的酶切產物進行連接反應，將獲得的全部連接產物采用熱激法轉化至大腸桿菌JM109中；

S5：重組質粒的鑒定和提取：分別挑單菌落于LB/Amp液體培養基中振蕩培養，分別以M13 fwd和Oligo-R為引物進行菌液PCR鑒定，將驗證正確的菌液轉接到新鮮的LB/Amp液體培養基中，培養后進行質粒的提取，得到重組質粒；

S6：重組質粒和pCCF001或pCCU001質粒的雙酶切：將S5得到的重組質粒和S1構建的pCCF001或pCCU001質粒進行雙酶切，酶切產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒分別回收目標片段；

S7：連接、轉化和鑒定：配置連接體系，將S6獲得的酶切回收目標片段進行連接反應，將獲得的全部連接產物采用熱激法轉化至大腸桿菌JM109中，挑單菌落于LB/Kan液體培養基中震蕩培養，并進行菌液PCR鑒定，將陽性菌液轉接到新鮮的LB/Kan液體培養基中培養，提取質粒，即獲得構建好的CRISPR/Cas9載體。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，在所述步驟S2中，合成一對互補的Oligo DNA，即序列為SEQ ID NO.5所示的Oligo-F，序列為SEQ ID NO.6所示的Oligo-R。

進一步，在所述步驟S2中，合成兩對互補的Oligo DNA，即序列為SEQ ID NO.7所示的Oligo1-F、序列為SEQ ID NO.8所示的Oligo1-R、序列為SEQ ID NO.9所示的Oligo2-F、序列為SEQ ID NO.10所示的Oligo2-R。

進一步，在步驟S2中，將所述合成的Oligo DNA序列進行退火復性的反應程序為：95℃變性5min，每30s降溫1℃，降溫至25℃，并于4℃保存。

進一步，在步驟S3中，采用限制性內切酶BbsI酶切pSG01或pSG02載體，反應體系100μL，37℃反應過夜，65℃反應20min獲得相應的酶切產物。

進一步，在步驟S3中，采用限制性內切酶BbsI酶切pSG01和pSG02載體，反應體系100μL，37℃反應過夜，65℃反應20min獲得相應的酶切產物。

進一步，在所述步驟S5中，所得到的重組質粒為pSG01-CZ或pSG02-CZ；在所述步驟S6中，將步驟S5中得到的pSG01-CZ或pSG02-CZ重組質粒、pCCF001或pCCU001質粒分別采用KpnI和XbaI進行雙酶切，37℃酶切3h后65℃反應20min，獲得相應的酶切產物。

進一步，在所述步驟S5中，所得到的重組質粒為pSG01-CZ和pSG02-CZ；在所述步驟S6中，將步驟S5中得到的pSG01-CZ重組質粒采用BamHI和KpnI進行雙酶切，pSG02-CZ重組質粒采用XbaI和BamHI進行雙酶切；將pCCF001或pCCU001質粒采用KpnI和XbaI進行雙酶切，37℃酶切3h后65℃反應20min，獲得相應的酶切產物。

進一步，在所述步驟S7中，所述菌液PCR鑒定以M13rev和Oligo-R為引物。

進一步，在所述步驟S7中，所述菌液PCR鑒定以Oligo1-F和Oligo2-R為引物。

與現有技術相比，本發明提供的應用于草莓上的CRISPR/Cas9載體的構建方法可獲得能夠特異性作用于草莓的CRISPR/Cas9載體，該載體不僅能夠作用于單個靶位點，而且能夠同時作用于兩個靶位點，用于草莓的遺傳轉化試驗。

附圖說明

圖1為pSG01載體的圖譜；

圖2為pSG02載體的圖譜；

圖3為pCCF001載體的圖譜；

圖4為pCCU001載體的圖譜；

圖5為本發明提供的應用于草莓上的CRISPR/Cas9載體的構建方法的流程圖。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請的實施例及實施例中的特征可以相互組合。

本實施例的目的在于提供一類能夠特異性應用于草莓上的CRISPR/Cas9載體，為實現此目標，該類CRISPR/Cas9載體由以下部分構成，具體包含以下內容：

1.pSG01載體：以pUC19載體為骨架，采用森林草莓的U6 snRNA基因的啟動子和終止子，轉錄sgRNA片段。該載體圖譜如圖1所示，其目標片段序列如下(SEQ ID NO.1)：

其中分別是M13 fwd和M13 rev引物序列，是FvU6 promoter序列，是guide序列，是sgRNA scaffold序列，是FvU6 terminator序列。

2、pSG02載體：以pUC19載體為骨架，采用栽培草莓的U6 snRNA基因的啟動子和終止子，轉錄sgRNA片段。該載體圖譜如圖2所示，其目標片段序列如下(SEQ ID NO.2)：

其中分別是M13 fwd和M13 rev引物序列，是FaU6 promoter序列，是guide序列，是sgRNA scaffold序列，是FaU6 terminator序列。

3、pCCF001載體：以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301載體為骨架，采用森林草莓基因的密碼子偏好性優化Cas9基因序列，以雙CaMV 35S啟動子和NOS終止子轉錄該基因。該載體圖譜如圖3所示，其目標片段序列如下(SEQ ID NO.3)：

其中是M13 rev引物序列，是2x35S promoter序列，是多克隆位點(MCS)序列，是根據森林草莓基因的密碼子偏好性優化的Cas9序列，是NOS terminator序列。

4、pCCU001載體：以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301載體為骨架，采用森林草莓基因的密碼子偏好性優化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi啟動子和NOS終止子轉錄該基因。該載體圖譜如圖4所示，其目標片段序列如下(SEQ ID NO.4)：

其中是M13 rev引物序列，是森林草莓Ubi promoter序列，是多克隆位點(MCS)序列，是根據森林草莓基因的密碼子偏好性優化的Cas9序列，是NOS terminator序列。

具體地，CRISPR/Cas9載體的構建方法如圖5所示，包括：

S1：構建基礎載體

以pUC19載體為骨架，采用森林草莓的U6 snRNA基因的啟動子和終止子，轉錄sgRNA片段，獲得目標片段序列為SEQ ID NO.1所示的pSG01載體；

以pUC19載體為骨架，采用栽培草莓的U6 snRNA基因的啟動子和終止子，轉錄sgRNA片段，獲得目標片段序列為SEQ ID NO.2所示的pSG02載體；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301載體為骨架，采用森林草莓基因的密碼子偏好性優化Cas9基因序列，以雙CaMV 35S啟動子和NOS終止子轉錄該基因，獲得目標片段序列為SEQ ID NO.3所示的pCCF001載體；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301載體為骨架，采用森林草莓基因的密碼子偏好性優化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi啟動子和NOS終止子轉錄該基因，獲得目標片段序列為SEQ ID NO.4所示的pCCU001載體；

S2：靶序列退火復性：合成互補的Oligo DNA，將合成的Oligo序列進行退火復性獲得DNA雙鏈序列，并稀釋；

S3：pSG01和/或pSG02質粒的酶切：采用限制性內切酶BbsI酶切pSG01和/或pSG02載體，酶切產物經超薄產物純化試劑盒進行回收；

S4：連接和轉化：配置連接體系，將S2獲得的稀釋后的DNA雙鏈序列與S3獲得的酶切產物進行連接反應，將獲得的全部連接產物采用熱激法轉化至大腸桿菌JM109中；

S5：重組質粒的鑒定和提取：分別挑單菌落于LB/Amp液體培養基中振蕩培養，分別以M13 fwd和Oligo-R為引物進行菌液PCR鑒定，將驗證正確的菌液轉接到新鮮的LB/Amp液體培養基中，培養后進行質粒的提取，得到重組質粒；

S6：重組質粒和pCCF001或pCCU001質粒的雙酶切：將S5得到的重組質粒和S1構建的pCCF001或pCCU001質粒進行雙酶切，酶切產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒分別回收目標片段；

S7：連接、轉化和鑒定：配置連接體系，將S6獲得的酶切回收目標片段進行連接反應，將獲得的全部連接產物采用熱激法轉化至大腸桿菌JM109中，挑單菌落于LB/Kan液體培養基中振蕩培養，并進行菌液PCR鑒定，將陽性菌液轉接到新鮮的LB/Kan液體培養基中培養，提取質粒，即獲得構建好的CRISPR/Cas9載體。

實施方式1

本實施方式給出了作用于單個位點的CRISPR/Cas9載體制備過程：

(1)靶序列退火復性。根據選定的靶序列，合成一對互補的Oligo DNA，序列為(SEQ ID NO.5)：Oligo-F：CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，Oligo-R(SEQ ID NO.6)：AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。將合成的Oligo序列按照表1進行退火復性，反應程序為：95℃變性5min，1℃/30s降溫至25℃，4℃保存。將得到的DNA雙鏈序列稀釋至0.1μM。

表1靶序列退火復性的反應體系

(2)pSG01或pSG02質粒的酶切。采用限制性內切酶BbsI酶切pSG01或pSG02載體，反應體系100μL，如表2，，37℃反應過夜，65℃反應20min，酶切產物經超薄產物純化試劑盒進行回收，并使用核酸蛋白儀測定濃度。

表2 BbsI酶切pSG01或pSG02載體的反應體系

(3)連接和轉化。按照表3配置連接體系，16℃反應30min后4℃反應過夜。將全部連接產物采用熱激發轉化至大腸桿菌JM109中。

表3復性產物與pSG01或pSG02酶切片段的連接反應體系

(4)重組質粒的鑒定和提取。挑單菌落于800μl的LB/Amp液體培養基中，37℃振蕩培養，以M13 fwd和Oligo-R為引物進行菌液PCR鑒定，將驗證正確的菌液轉接到新鮮的LB/Amp液體培養基中，培養后進行質粒的提取，得到重組質粒pSG01-CZ或pSG02-CZ。

(5)pSG01-CZ或pSG02-CZ和pCCF001或pCCU001質粒的雙酶切。將得到的pSG01-CZ或pSG02-CZ重組質粒、pCCF001或pCCU001質粒分別采用KpnI和XbaI進行雙酶切，37℃酶切3h后65℃反應20min。酶切產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒分別回收目標片段，并用核酸蛋白儀測定濃度。

(6)連接、轉化和鑒定。按照表4配置連接體系，16℃反應30min后4℃反應過夜。將全部連接產物采用熱激法轉化至大腸桿菌JM109中；挑單菌落于800μl的LB/Kan液體培養基中，37℃振蕩培養；以M13rev和Oligo-R為引物進行菌液PCR鑒定，將陽性菌液轉接到新鮮的LB/Kan液體培養基中培養，提取質粒，-20℃保存。該質粒即為構建好的作用于單個位點的CRISPR/Cas9載體，可用于下一步的草莓遺傳轉化試驗。

表4酶切回收片段的連接反應體系

實施方式2

本實施方式給出了作用于兩個位點的CRISPR/Cas9載體制備過程：

(1)靶序列退火復性。根據選定的靶序列，合成兩對互補的Oligo DNA，序列為：Oligo1-F：CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID NO.7)，Oligo1-R：AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID NO.8)，Oligo2-F：CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID NO.9)，Oligo2-R：AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID NO.10)。將合成的Oligo序列分別按照表5進行退火復性，反應程序為：95℃變性5min，1℃/30s降溫至25℃，4℃保存。將得到的DNA雙鏈序列稀釋至0.1μM。

表5靶序列退火復性的反應體系

(2)pSG01和pSG02質粒的酶切。采用限制性內切酶BbsI分別酶切pSG01和pSG02載體，反應體系100μL，如表6所示，37℃反應過夜，65℃反應20min，酶切產物經超薄產物純化試劑盒進行回收，并使用核酸蛋白儀測定濃度。

表6 BbsI酶切pSG01或pSG02載體的反應體系

(3)連接和轉化。按照表7分別配置連接體系，16℃反應30min后4℃反應過夜，將全部連接產物采用熱激法轉化至大腸桿菌JM109中。

表7復性產物與pSG01或pSG02酶切片段的連接反應體系

(4)重組質粒的鑒定和提取。分別挑單菌落于800μl的LB/Amp液體培養基中，37℃振蕩培養；分別以M13 fwd和Oligo-R為引物進行菌液PCR鑒定，將驗證正確的菌液轉接到新鮮的LB/Amp液體培養基中，培養后進行質粒的提取，得到重組質粒pSG01-CZ和pSG02-CZ。

(5)pSG01-CZ、pSG02-CZ和pCCF001或pCCU001質粒的雙酶切。將得到的pSG01-CZ重組質粒采用BamHI和KpnI進行雙酶切，pSG02-CZ重組質粒采用XbaI和BamHI進行雙酶切；將pCCF001或pCCU001質粒采用KpnI和XbaI進行雙酶切，37℃酶切3h后65℃反應20min。酶切產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒分別回收目標片段，并用核酸蛋白儀測定濃度。

(6)連接、轉化和鑒定。按照表8配置連接體系，16℃反應30min后4℃反應過夜；將全部連接產物采用熱激法轉化至大腸桿菌JM109中；挑單菌落于800μl的LB/Kan液體培養基中，37℃振蕩培養；以Oligo1-F和Oligo2-R為引物進行菌液PCR鑒定，將陽性菌液轉接到新鮮的LB/Kan液體培養基中培養，提取質粒，-20℃保存。該質粒即為構建好的作用于兩個位點的CRISPR/Cas9載體，可用于下一步的草莓遺傳轉化試驗。

表8酶切回收片段的連接反應體系

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川農業大學

<120> 一種應用于草莓上的CRISPR/Cas9載體的構建方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 838

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtaaaacgac ggccagtgaa ttgggatccg gtaccaggag aagagagatg gtgttgaaca 60

gctatgtagc ggtaagagta gcaaacatgt cggcatacgc gtgtcaatac atagcttgca 120

atcccgagag attgagtagc gaccaagttc tgtacctcct cttctgcttc ccgttccttc 180

aactccgtcg cttcctcctc aacttccgac gacgaccctc cccttgattc cttgtaattt 240

cactctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctca tgtatcaaag catacgattc 300

tctactttgt tgtttcctga attcaagatc taggatatct gagatccatg ccatttcgaa 360

tttgaccaag gccctgttat gactttattg tgctcaaatc tataacagat tgcaaacgcc 420

tctcaggccc aaacagtccc caactcttaa agagcaaagg ctacgaaata atcccacatc 480

ggaaacctct gtctacaagg acttctttat atacaattga ctcccatcta agcttgggtc 540

ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 600

aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct ttttttgcaa ttttttgcaa ttttttgctt 660

gatcttctgc tgtattaact atcactatat gtctgtatta agtaaccttt tcttgcaatt 720

tttggcttga tcttctgctg tataaactat cggtgtgttt ctagagggat ccctagagat 780

taatcgtcga cctgcaggca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctg 838

<210> 2

<211> 812

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtaaaacgac ggccagtgaa ttgggatccg gtaccaggag aagagagatg gtgttgaaca 60

gctatgtagc ggtaagagta gcaaacatgt cggcatacgc gtgtcaatac atagcttgca 120

atcccgagag attgagtagc gaccaagttc tgtacctcct cttctgcttc ccgttccttc 180

aactccgtcg cttcctcctc aacttccgac gacgaccctc cccttgattc cttgtaattt 240

cactctctct ctctctcatg tatcaaagca tacgattctc tattttgttg tttcctgaat 300

tcaagatcta ggatatctga gatccatgcc atttcgaatt tgaccaaggc cctgctatga 360

ctttattgtg ctcaaatcta taacagattg caaacgcctc tcaggcccaa acagtcccca 420

acctttaaag agcaaaggct acgaaataat cccacatcgg aaacctctgt ctacaaggac 480

ttctttatat acaattgact cccatctaag ctcgggtctt cgagaagacc tgttttagag 540

ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag 600

tcggtgcttt tttttgcaat tttttgcttg atcttctgct gtattaacta tcactatatg 660

tctgtattaa gtaacctttt cttgcaattt ttggcttgat cttctgctgt ataaactatc 720

ggtgtgttaa gaatctagag ggatccctag agattaatcg tcgacctgca ggcatgcaag 780

cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tg 812

<210> 3

<211> 5499

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 60

tcgacctgca ggcatgcaag cttttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga 120

gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc 180

tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 240

tatctgtcac ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca 300

ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg 360

acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca 420

agtggattga tgtgataaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa 480

agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg 540

aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa 600

ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc 660

ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 720

agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag 780

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cactaggcgc aagaaccgca tttgctatct tcaggagatc ttctctaatg agatggccaa 1320

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cccaactatt taccatcttc gcaagaaact tgtcgattct actgacaagg ctgatcttag 1500

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agatcttaac ccagataact ctgatgtcga caagttgttc attcagcttg tgcagactta 1620

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ttctgccagg ctttccaagt ctcgcaggct tgagaacctt attgctcagc ttccaggtga 1740

gaaaaagaac ggtttgttcg gtaatcttat tgccctttct cttggtctta cacctaactt 1800

caagtctaac ttcgatcttg ctgaggatgc caagttgcag ctttctaagg acacttacga 1860

tgacgatctt gataacttgc ttgcccagat tggtgatcag tatgccgatt tgttccttgc 1920

agctaagaac ctttctgatg ccatcttgct ttctgatatt cttagggtca acactgagat 1980

tactaaggcc ccactttctg cctctatgat taagaggtac gatgagcatc atcaggatct 2040

tactcttctt aaggcccttg tcaggcagca gcttccagag aagtacaagg agattttctt 2100

tgatcagtct aagaacggtt acgccggtta cattgatggt ggagcctctc aggaagagtt 2160

ctacaagttc attaagccta ttcttgagaa gatggatggt actgaagagt tgcttgtcaa 2220

gttgaacagg gaggatttgc ttcgcaagca gaggactttc gacaacggtt ctattccaca 2280

tcagattcat cttggagagc ttcatgccat tcttaggcgc caggaggatt tctacccatt 2340

ccttaaggat aacagggaga agattgagaa gattcttaca ttcaggattc catactatgt 2400

cggtccactt gccaggggta actctaggtt cgcttggatg actaggaagt ctgaggaaac 2460

tattactcct tggaacttcg aggaagtcgt ggataagggt gcctctgccc agtccttcat 2520

tgagaggatg actaacttcg acaagaacct tccaaacgag aaggtccttc ctaagcattc 2580

tcttttgtac gagtacttca ctgtctacaa cgagcttact aaggtcaagt acgtcactga 2640

gggtatgagg aagccagcct tcctttctgg tgagcagaag aaagccattg tcgatctttt 2700

gttcaagact aacaggaagg tcactgtcaa gcagcttaag gaggattact tcaagaaaat 2760

tgagtgcttc gattctgtcg agatttctgg tgtcgaggat aggttcaatg cctctcttgg 2820

tacttaccat gatttgctta agatcattaa ggacaaagac ttccttgata acgaagagaa 2880

cgaggatatt cttgaggata ttgtccttac attgactctt ttcgaggatc gcgagatgat 2940

tgaagagagg cttaagactt acgcccatct tttcgatgac aaggtcatga agcagcttaa 3000

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taagcagtct ggtaagacta ttcttgattt cttgaagtct gatggtttcg ccaatcgcaa 3120

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