一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛星標記引物及方法與流程

本發明屬于分子生物學領域，具體地涉及一種應用微衛星標記鑒定脊尾白蝦近交家系的方法。

背景技術：

脊尾白蝦屬于長臂蝦科、白蝦屬，俗稱白蝦、小白蝦和迎春蝦。主要分布于中國大陸沿岸和朝鮮半島西岸的淺海低鹽水域，以黃渤海產量最大，是我國重要的中小型經濟蝦類。脊尾白蝦具有環境適應性廣、食性雜、繁殖周期短、抗病力強等優點，大大降低了脊尾白蝦全人工室內繁殖的難度，同時，脊尾白蝦成蝦個體小，體色透明易于實驗操作。脊尾白蝦的這些特點使其具備成為甲殼類實驗動物的可能。

按遺傳學控制方法，根據基因純合程度，可將實驗動物分為近交系、突變系、雜交群、封閉群四類。其中近交系動物因其基因型的純合一致性，在實驗的可重復性和可比性上具有明顯的優勢，因此，在實驗動物的研究多集中在近交系動物。近交使一個種群達到接近完全純合程度，即所有同源染色體的相對位置都具有相同基因的狀態。在近交的過程中主要有以下幾方面的變化：第一，增多純合性，使基因位點變為純合子，使其表現型趨向一致性，第二，近交可將群體分離為不同基因型的品系；第三，近交可引起近交衰退，親緣接近的交配所產生的后代常常會出現生長、成活、生育、抗病、適應環境等能力的減退。如何克服和解決近交衰退的問題，是培育近交系動物的關鍵所在。

近交系實驗動物的顯著特點是其基因純合性及遺傳穩定性，但在培育、保種及繁殖生產過程中，存在著發生遺傳變異或遺傳污染的可能，所以需要對近交系進行嚴格、定時的遺傳檢測。對于脊尾白蝦而言，以培育理想的實驗動物為目的的高度近交系研究尚處于起步階段，因此近交系的遺傳檢測也是近交系培育工作的需要。有關實驗動物的國家標準規定了利用皮膚移植法、免疫標記基因檢測法和生化基因標記檢測法等進行常規檢測。近年來分子生物學技術發展迅速,可以直接檢驗動物基因組核酸的改變,為脊尾白蝦近交系的遺傳檢測提供了直接、客觀的途徑。

微衛星，是指少數幾個核苷酸為單位多次串聯重復的DNA序列，其廣泛分布于真核生物的基因組中，大約每隔10-15kb就存在一個微衛星標記。微衛星標記在近交系培育的過程中具有以下的優勢：采樣微量化、方便化；快速、高效、準確性高；可長期使用；可直接識別出任何個體的基因型，從而對群體中不期望存在的基因變異體淘汰。所以，用微衛星標記技術選出具品系特異性的多態位點，可準確、快速、靈敏地應用于近交系實驗動物培育過程中的鑒別、遺傳質量監測等方面。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題在于提供一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛星標記引物及方法，本發明方法應用2個微衛星標記鑒定脊尾白蝦近交家系。

本發明是通過如下技術方案來實現的：

一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛星標記引物，所述微衛星標記名稱為ES034、ES096，其引物分別如下：

ES034

正向引物：5'ACTTCATCCACAAGCAGAGGT 3'，

反向引物：5'GAAGAAGAGGAAGGTGGGGC3'；

ES096；

正向引物：5'GCAATTTGCCTGTTCGGTCT 3'，

反向引物：5'GGTAGGGGTAAGGGGGTGAT 3'。

利用上述引物進行脊尾白蝦近交家系鑒定的方法，具體步驟如下：

從待測脊尾白蝦群體中隨機抽樣得到待測樣本，以待測脊尾白蝦的基因組DNA為模板，利用具有由所述各個標記的一對引物進行PCR擴增，然后檢測待測樣本的PCR產物的片段大小，如果滿足如下(1)至(3)的所有標準，待測脊尾白蝦為候選的脊尾白蝦近交家系：

(1)所述方法中，從待測脊尾白蝦群體中隨機抽樣得到30尾以上待測樣本；

(2)所述脊尾白蝦待測樣本屬于F₈或F₈以上的世代；

(3)用標記ES034、ES096的每對引物檢測的待測脊尾白蝦群體時，群體內的所有樣品具有相同的基因型，且片段大小分別為146bp、263bp。

本發明與現有技術相比的有益效果：

本發明利用兩對微衛星引物對脊尾白蝦群體進行遺傳檢測，可以明確的區分出脊尾白蝦的近交系群體，維持脊尾白蝦近交系的純合性和同基因性，淘汰在脊尾白蝦近交系建立過程中發生遺傳變異或遺傳污染的群體。本發明方法不僅可以進行純合位點的判定，而且能對基因的變異情況進行分析，為近交系的遺傳檢測提供依據。

附圖說明

圖1脊尾白蝦野生群體在微衛星座位ES034的STR檢測結果；

圖2脊尾白蝦近交F₁代在微衛星座位ES034的STR檢測結果；

圖3脊尾白蝦近交F₇代在微衛星座位ES034的STR檢測結果；

圖4脊尾白蝦近交F₈代在微衛星座位ES034的STR檢測結果；

圖5脊尾白蝦近交F₉代在微衛星座位ES034的STR檢測結果；

圖6脊尾白蝦野生群體在微衛星座位ES096的STR檢測結果；

圖7脊尾白蝦近交F₁代在微衛星座位ES096的STR檢測結果；

圖8脊尾白蝦近交F₇代在微衛星座位ES096的STR檢測結果；

圖9脊尾白蝦近交F₈代在微衛星座位ES096的STR檢測結果；

圖10脊尾白蝦近交F₉代在微衛星座位ES096的STR檢測結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但不限定本發明。下述實施例中的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料如無特殊說明，均為常規生化試劑商店可以購買得到的。

實施例1

材料

研究對象脊尾白蝦近交家系群體F₇、F₈、F₉世代是由中國水產科學研究院黃海水產研究所李健課題組采用全人工室內培育的脊尾白蝦家系。脊尾白蝦野生群體采自于江蘇海域，F₁代群體為野生群體后代，每個群體隨機抽樣30尾。

引物

本實驗通過篩選獲得2對微衛星標記用于檢測鑒定脊尾白蝦家系。擴增微衛星座位ES034、ES096的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列為：

ES034

正向引物：5'ACTTCATCCACAAGCAGAGGT 3'，

反向引物：5'GAAGAAGAGGAAGGTGGGGC3'。

ES096

正向引物：5'GCAATTTGCCTGTTCGGTCT 3'，

反向引物：5'GGTAGGGGTAAGGGGGTGAT 3'。

基因組DNA從上述待測脊尾白蝦的肌肉組織中提取，提取方法參照傳統酚氯仿法，加以改進。以提取的基因組DNA為模板，在上述引物的引導下，分別進行PCR擴增，反應體系為20μL。其中模板為30-50ng，上下游引物各1μL，2×TSINGKE Master Mix(來自于北京擎科新業生物技術有限公司)為10μL，ddH₂O 6μL。反應條件為：先95℃,5min；然后95℃，40s，55℃，40s，72℃，50s，共計35個循環；72℃后延伸10min。擴增的產物取10μL在3730XL測序儀上檢測。結果如圖所示，峰值所對應位置為PCR產物的擴增大小。ES034、ES096在各個群體中的多態性信息含量見表1。

近交家系F₇、F₈、F₉世代群體、野生群體和F₁代群體的STR分型的比較結果表明ES034、ES096在近交系群體F₈、F₉中具有相同的特異等位基因，大小分別為146bp、263bp。而在其它群體中2個位點均表現為多態性,其中在野生群體中表現為較高的多態性。

因此本實驗方案實驗了脊尾白蝦近交家系快速的基因分型，可用于脊尾白蝦近交系培養過程中的遺傳質量檢測和品系的鑒定。

表1 ES034、ES096在群體中的多態性信息含量

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水產科學研究院黃海水產研究所

<120> 一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛星標記引物及方法

<130> 無

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工設計的引物ES034正向引物

<400> 1

acttcatcca caagcagagg t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工設計的ES034反向引物

<400> 2

gaagaagagg aaggtggggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ES096正向引物

<400> 3

gcaatttgcc tgttcggtct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ES096反向引物

<400> 4

ggtaggggta agggggtgat 20