本發明涉及化合物提取分離領域，特別涉及一種野八角新苯甲酸衍生物及其制備方法、應用和藥物組合物。
背景技術：
野八角（Iliicium simonsii Maxim）為八角屬（Illicium L.）植物，產于我國貴州西北部至西南部、四川和云南以及印度、緬甸。葉、果實入藥，味辛，性熱；有鎮嘔、行氣止痛、生肌接骨、滅虱殺蟲之效，可治胃寒作嘔、膀胱疝氣、胸前脹痛、疥瘡等功效。
腦卒中（cerebral apoplexy）是導致全球人類致殘的首要病因，全球第二大死因。在一些國家和城市，卒中甚至已經超過心血管病，成為第一位死因。根據中國生物技術發展中心抽樣調查的數據顯示，中國城鄉腦血管病的年發病率平均為200/10萬，患病率為400~700/10萬，全國每年新發腦血管病病例250 萬，死亡率為130/10萬，是我國人口總死亡第二位原因，在北京已經超過心血管疾病和腫瘤，成為第一位死亡原因。全國每年用于治療腦血管病的費用達100億元以上，加上間接經濟損失超過200億元。由此可見，腦血管病已經成為嚴重影響我國民生的重要公共衛生問題。2010年世界卒中日發布的主題是“六分之一”， 即全世界每6個人中有1人可能在一生中罹患卒中；每6s就有1人死于卒中；而每6min就有1人因卒中而永久致殘。腦卒中是當今世界重大疾病之一。來源于中草藥的有效成分是抗腦卒中新藥的研究熱點。
技術實現要素：
野八角乙醇提取物具有神經保護作用，從有效部位中分離得到1個新苯甲酸衍生物，藥效學評價顯示其具有很好的神經保護的作用。
本發明目的之一在于提供了一個新苯甲酸衍生物。
本發明目的之二在于提供了新苯甲酸衍生物的制備方法。
本發明目的之三在于提供了一種新苯甲酸衍生物在制備預防或治療腦血管疾病的藥物的應用。
本發明目的之四在于提供一種藥物組合物，其含有新苯甲酸衍生物。
本發明是通過以下技術方案實現的：野八角新苯甲酸衍生物具有化合物1所示結構
1。
野八角新苯甲酸衍生物制備方法，每制備化合物1，5 mg包括以下步驟：
a.干燥的野八角果實10.50 kg，粉碎，用95% EtOH 80 L浸泡2 h后，加熱回流提取3次，每次2小時，提取液減壓濃縮，得到261.2 g浸膏；
b.將浸膏溶解于甲醇中，吸附于500 g硅藻土，干燥，裝入索氏提取器，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇索氏回流提取；
c.各提取液分別減壓濃縮得石油醚部位44.2 g，乙酸乙酯部位75.0 g和甲醇部位133.6 g；
d.對乙酸乙酯部位用二氯甲烷-甲醇（二氯甲烷:甲醇= 50:1；25:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:100）梯度洗脫分離得到流份Fr1-Fr7；
e.對Fr4(8g)通過中壓柱色譜法（10 – 90 %的甲醇梯度洗脫10小時）分為50個流份（500 ml為1份），通過制備液相從Fr.10得到一個新苯甲酸衍生物類化合物1（5mg）。
化合物1在制備預防或治療腦血管疾病藥物中的應用。所述腦血管疾病藥物為神經保護藥物。所述腦血管疾病為腦卒中、癡呆、神經炎癥、重金屬中毒、神經毒劑中毒。所述腦卒中為缺血性腦卒中或出血性腦卒中。
一種藥物組合物，其中，含有權利要求1中所示的化合物以及藥效學上可接受的載體。
根據本發明的思路，對野八角新苯甲酸衍生物進行了神經保護相關的藥理實驗。氧化應激是導致神經元凋亡丟失的重要原因，是缺血性腦卒中的特征。引起氧化應激的原因有很多種，如腦缺血，神經炎癥，興奮性遞質釋放重攝取機制障礙，重金屬暴露，神經毒性劑暴露等，表現為細胞內自由基增加，引起脂質過氧化，線粒體功能障礙繼而激活凋亡通路等。谷氨酸，H2O2雖然引發神經元凋亡丟失的機制不一，但都是近年來許多國內外學者倡導的神經元損傷模型的誘發劑。研究認為，腦內興奮性遞質谷氨酸過量通常引起神經元膜上NMDA受體過度激活，從而導致神經元發生氧化應激并丟失，而H2O2是一種過氧化物，以其誘導神經細胞氧化應激損傷模型為基礎，揭示了臨床有效的藥物作用機制，可作為體外篩選抗氧化藥物的一種可靠的藥理細胞模型，其發生機制，病理生理改變與腦卒中患者腦內表現具有相似性。應用谷氨酸，H2O2制作神經元損傷模型條件要求低，技術易于掌握，可靠性強，重復性好，因此在本研究中，H2O2損傷原代神經元模型、谷氨酸誘導原代神經元凋亡模型2個體外模型作為評價手段。
新苯甲酸衍生物在體外谷氨酸，H2O2誘發的大鼠大腦皮層神經元死亡的試驗中均顯示出優良的神經保護作用。
陽性對照藥物為依達拉奉（edaravone），依達拉奉是以自由基清除為主要作用機制的神經保護藥物，能有效抑制因腦缺血導致的腦細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化應激損傷。
對H2O2誘發大鼠大腦皮層神經元凋亡的保護作用體外研究中，將本發明化合物與依達拉奉（300μM）用神經元培養基稀釋，和大鼠大腦皮層神經元溫孵24小時后，MTT法測定細胞存活率，同時進行正常對照組和陽性對照組試驗。實驗結果表明，正常對照組加入H2O2后570 nm處吸光度值（OD570）明顯降低，陽性對照組和本發明化合物OD570明顯回升，與依達拉奉（edaravone）的細胞存活率相當，新化合物組的細胞存活率與依達拉奉組相當。
對谷氨酸誘發大鼠大腦皮層神經元凋亡的保護作用體外研究中，將本發明化合物與谷氨酸（20 mM）用完全培養基稀釋，和大鼠大腦皮層神經元溫孵24小時后，MTT法測定細胞存活率，同時進行正常對照組和陽性對照組試驗。實驗結果表明，正常對照組加入谷氨酸后570 nm處吸光度值（OD570）明顯降低，陽性對照組和本發明化合物OD570明顯回升，與依達拉奉（edaravone）的細胞存活率相當，新化合物組的細胞存活率與依達拉奉組相當。
本發明的有益效果：化合物1體現了神經保護活性，即在H2O2 損傷原代神經元模型中均具有良好的神經保護活性，其活性優于依達拉奉。因此本發明的化合物在可用于制備預防或治療腦血管疾病的藥物。優選的神經退行性疾病選自腦卒中、癡呆、神經炎癥、重金屬中毒、神經毒劑中毒。優選的腦卒中選缺血性腦卒中和出血性腦卒中。
附圖說明
圖1 野八角果實的提取流程圖。
具體實施方式
下面的實施例及藥理活性實驗進一步說明本發明，但并不意味著對本發明的任何限制。
實施例1：野八角新苯甲酸衍生物制備方法，每制備化合物1，5 mg包括以下步驟：提取分離實驗（見附圖1）干燥的野八角果實10.50 kg，粉碎，用95% EtOH 80 L浸泡2 h后，加熱回流提取3次，每次2小時，提取液減壓濃縮，得到261.2 g浸膏。將浸膏溶解于甲醇中，吸附于500 g硅藻土，干燥，裝入索氏提取器，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇索氏回流提取。各提取液分別減壓濃縮得石油醚部位44.2 g，乙酸乙酯部位75.0 g和甲醇部位133.6 g。對乙酸乙酯部位用二氯甲烷-甲醇（二氯甲烷:甲醇= 50:1；25:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:100）梯度洗脫分離得到流份Fr1-Fr7。對Fr4(8g)通過中壓柱色譜法（10 – 90 %的甲醇梯度洗脫10小時）分為50個流份（500 ml為1份），通過制備液相從Fr. 10得到一個新苯甲酸衍生物（5mg）。
實施例2：化合物1在制備預防或治療腦血管疾病藥物中的應用。所述腦血管疾病藥物為神經保護藥物。所述腦血管疾病為腦卒中、癡呆、神經炎癥、重金屬中毒、神經毒劑中毒。所述腦卒中為缺血性腦卒中或出血性腦卒中。
新苯甲酸衍生物的理化、波譜數據如下:為無色油狀物; [α]20D +50.6(c 0.50 MeOH); UV (MeOH) λmax (logε): 254 (3.24); IR光譜給出羥基 (3383 cm-1) 和羧基(1693 cm-1) 等官能團的振動吸收; ESIMS m/z 289 [M + Na]+; HRESIMS m/z 289.1412 [M + Na]+ (calcd for C15H22NaO4, 289.1410)。1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) 和13C-NMR (CD3OD，125 MHz）見下表
表 11H and 13C NMR data of compound 1 in CD3OD
藥理實驗
試驗材料 1、受試藥：本發明單體化合物。2、陽性對照藥：依達拉奉，由中國食品藥品檢定研究院提供。HPLC檢測純度 >98%。3、細胞：出生當天大鼠大腦皮層神經元。4、培養基：DMEM，FBS，美國Gibco公司生產；ES，美國Hyclone公司生產。5、H2O2由和谷氨酸由北京化工廠提供。
本發明化合物對大鼠大腦皮層神經元存活狀態的影響以及在H2O2誘發的神經元凋亡模型中的保護作用。
化合物對神經元存活狀態的影響研究中，將原代培養大鼠皮層神經元 (DIV-9)分為對照組和給藥組 (10 μM)，n=6；在化合物對H2O2誘發神經元凋亡模型的保護作用研究中，將原代培養大鼠皮層神經元 (DIV-7)分為對照組，H2O2 (300μM)造模組，H2O2 (300μM)+依達拉奉 (100 μM)給藥組，H2O2 (300μM)+化合物 (10μM)給藥組，n=6。給藥后，細胞置于細胞孵箱中繼續培養24小時，MTT法 (570nm)測定細胞存活率。以對照組吸光度為標準，計算各組吸光度與對照組的比值。
化合物在谷氨酸誘發的大鼠皮層神經元凋亡模型中的保護作用
將原代培養大鼠皮層神經元 (DIV-9)分為對照組，谷氨酸 (20 mM)造模組，谷氨酸 (20 mM)+依達拉奉 (100 μM)給藥組，谷氨酸 (20 mM)+化合物 (10 μM)給藥組，n=6，于細胞孵箱中繼續培養24小時后，MTT法測定細胞存活率。以對照組吸光度為標準，計算各組吸光度與對照組的比值。
表2化合物對大鼠皮層神經元存活狀態的影響
表3 新化合物在H2O2和谷氨酸誘導的原代神經元細胞損傷模型中的神經保護作用
注：* p<0.05 vs mod，** p<0.01 vs mod，*** p<0.001vs mod，## P ＜ 0.01vs control.
實施例3：一種藥物組合物，其中，含有權利要求1中所示的化合物以及藥效學上可接受的載體。
本發明還涉及以本發明化合物作為活性成分的藥物組合物。該藥物組合物可根據本領域公知的方法制備。可通過將本發明化合物與一種或多種藥學上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結合，制成適于人或動物使用的任何劑型。本發明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量%。
本發明的化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜、直腸等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w 型、w/o 型和復乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑( 包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉) 霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。
本發明的化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統。
為了將本發明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯聚乙烯吡咯烷酮、交聯羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。
還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆粒或微丸，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發明化合物的膠囊劑。
為將本發明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領域常用的增溶劑、助溶劑、pH 調劑劑、滲透壓調節劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環糊精等；pH 調劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調節劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。
為達到用藥目的，增強治療效果，本發明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發明化合物的每天的合適劑量范圍為0.001-150mg/Kg 體重，優選為0.1-100mg/Kg 體重，更優選為1-60mg/Kg 體重，最優選為2-30mg/Kg 體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫生的臨床經驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。
本發明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對癥藥物合并使用。當本發明的化合物與其它治療藥物存在協同作用時，應根據實際情況調整它的劑量。
實驗結果表明：對已經鑒定的化合物進了初步的細胞模型篩選，化合物1體現了神經保護活性，即在H2O2 損傷原代神經元模型中均具有良好的神經保護活性，其活性優于依達拉奉。
以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。