免疫應答的引發的制作方法
本申請是國際申請日為2009年11月20日、國際申請號為pct/dk2009/050310、進入國家階段的申請號為200980154924.4、發明名稱為“免疫應答的引發”的pct申請的分案申請。
本申請中引用的所有專利和非專利參考文獻在此通過引用整體并入。
本發明涉及使用恒定鏈連接的抗原的引發免疫應答的技術和方法（當這些用于引發使用任何合適疫苗的后續加強免疫接種時）。
背景技術：
疫苗接種是給受試者施用抗原材料（疫苗），以便產生對疾病或狀況的免疫。當用于刺激免疫應答時，抗原被稱為免疫原，并且該過程被稱為免疫接種。疫苗接種涉及一種或多種免疫原的施用，這可以以幾種形式施用。
疫苗接種要求實體免疫應答的建立。由感染或疫苗接種激活的免疫應答依賴于幾種細胞類型例如t、b和抗原呈遞細胞，以及幾種不同分子主要是抗原、mhc分子、t和b細胞受體及許多其他的相互作用。
常規疫苗或第一代疫苗基于被殺死或減毒的致病菌株。這些通常具有減少的傳染力，并且它們通常是無足夠的免疫原性的，導致來自疫苗接種的不充分保護。
基于來自致病生物的個別抗原蛋白質的第二代疫苗或亞單位疫苗的開發已揭示純肽或碳水化合物趨于是弱免疫原。
dna疫苗或第三代疫苗具有誘導較廣泛范圍的免疫應答類型的能力，但維持在人中具有低免疫原性的潛在缺點。
對于所有類型的疫苗，疫苗接種程序面對關于增加疫苗效力的未滿足需要，以克服上述局限性且提供在疫苗接種過程中刺激免疫系統的更經濟方法。
本發明目標在于通過提供用于增加疫苗效力的解決方案來解決與疫苗的低免疫原性相關的問題。
本發明目標在于通過提供用于引發免疫應答的解決方案來解決與疫苗的低免疫原性相關的問題。
本發明因此涉及用核酸構建體引發免疫系統，所述核酸構建體包括mhcii類結合的恒定鏈/cd74（本文被稱為恒定鏈或ii）或其變體，且編碼至少一種抗原蛋白質或所述抗原蛋白質的片段，隨后為后續加強疫苗接種，以增加所述疫苗的效力。
根據本發明的疫苗可以涉及致病性抗原或癌抗原。
本文呈現的數據顯示使用包括恒定鏈或其變體的核酸構建體開發引發-加強方案并不簡單。
令人驚訝的是，本發明公開了可以改變來自恒定鏈的ii-key（包括lrmk氨基酸殘基）和/或ii-clip結構域的部分，而不減少所述免疫引發的效應。
不充分地解決這個問題的現有技術參考文獻在下文討論：
wo2007/062656（holst等人）涉及開發改良dna疫苗，以這樣的方式刺激免疫應答，所述方式增加應答的動力學，同時伴隨擴大且改善應答。holst等人發現抗原與恒定鏈的融合通過cd4+t細胞獨立機制顯著增強隨后的抗病毒cd4+和cd8+t細胞應答。
holmes等人（jclinoncol.2008，jul10；26（20）:3426-33）描述了ii-key雜合肽疫苗的首次人i期試驗，其中ii-key包括lrmk4氨基酸序列，恒定鏈蛋白質的中心部分。
kallinteris等人的發現（expertopin.biol.ther.2006，6（12）:1311,1321）也涉及利用包括lrmk氨基酸的ii-key部分用于增強疫苗效力。
us2008/0095798（humphreys等人）公開了用于增加疫苗針對病原體的效力的方法，通過首先用包括所述ii-key肽的lrmk殘基的ii-key雜合肽構建體引發受試者的免疫系統，并且隨后施用針對病原體的疫苗以加強在引發步驟中產生的免疫應答。
技術實現要素：
本發明顯示用核酸構建體引發免疫系統，所述核酸構建體包括至少一種mhcii類結合的恒定鏈/cd74（本文被稱為恒定鏈或ii）或其變體，且編碼至少一種抗原蛋白質或所述抗原蛋白質的片段，隨后為后續加強疫苗接種增加所述疫苗的效力。
根據本發明的疫苗可以涉及致病性抗原或癌抗原。
令人驚訝的是，本發明公開了ii-key結構域（包括lrmk氨基酸殘基）和/或ii-clip結構域的部分可以從恒定鏈中部分置換或省略，而不降低所述引發的作用。
因此，本發明已解決了通過采用二步引發-加強方案的疫苗接種而產生的充分刺激免疫應答的問題，由此首先用包括恒定鏈或其變體的核酸構建體引發免疫系統，隨后為以這樣的方式使用任何類型的合適疫苗的后續加強免疫接種，所述方式增加應答的動力學，同時伴隨擴大且改善應答。特別地，在此可提供用于直接、特異和快速刺激免疫系統的新型系統，以便改善所有動物例如人的疫苗接種方案。
這個問題通過在權利要求中表征的本發明的實施方案得到解決。通過本發明，發現用基于ii鏈的核酸構建體的引發顯著增加在用疫苗后續加強后的抗原特異性cd8+t細胞、cd4+t細胞和/或b細胞生成。
因此，本發明的一個方面是提供包括這樣的序列的核酸構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，其中所述核酸構建體能夠引發免疫系統，以增強在受試者中施用后續疫苗后的免疫接種。
在一個實施方案中，本發明提供了包括這樣的序列的核酸構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，其中通過在受試者中施用后續疫苗，所述核酸構建體能夠引發免疫接種。
在一個實施方案中，在本發明的核酸構建體中包括的恒定鏈可以由其野生型序列加以改變，而不減少ii的效應。
因此，在一個實施方案中，包括lrmk氨基酸殘基的ii-key結構域已通過缺失或置換例如突變加以改變。
在另一個實施方案中，ii-clip結構域的部分已通過缺失或置換例如突變加以改變。ii-clip結構域可以具體地通過將在位置91和99上的甲硫氨酸置換為丙氨酸而改變；這令人驚訝地增加mhcii呈遞。
在另一個實施方案中，ii可以具體地通過缺失ii的前17個氨基酸而改變；這令人驚訝地增加記憶應答。
由此可見這些改變各自可以分開或組合發生。
在一個實施方案中，當用于引發針對病毒、微生物例如細菌或寄生蟲的疫苗的免疫應答時，在本發明的核酸構建體中包括的恒定鏈由其野生型序列加以改變。
在另一個實施方案中，當用于引發癌癥疫苗或針對異常生理學應答的疫苗的免疫應答時，在本發明的核酸構建體中包括的恒定鏈可以由或不由其野生型序列加以改變。
在另一個實施方案中，用于引發免疫應答的核酸構建體和用于加強免疫應答的后續疫苗的至少一個部分是等同的。引發物和加強物（booster）的所述至少一個等同部分可以是ii或其變體、抗原肽或抗原肽的部分、或遍在的輔助t細胞表位。
同樣本發明的一個目的是提供包括如本文詳述的核酸構建體的遞送媒介物（vehicle），其中所述遞送媒介物是基于rna的媒介物、基于dna的媒介物/載體、基于脂質的媒介物、基于聚合物的媒介物或病毒衍生的或dna或rna媒介物。
在一個優選實施方案中，所述遞送媒介物包括脂質體的形成、生物可降解聚合物微球體的形成、核酸構建體包被到膠體金顆粒上或摻入病毒衍生的dna或rna載體內。
在另外一個優選實施方案中，所述核酸構建體或所述遞送媒介物借助于針注射、基因槍、射流注射（jetinjection）、電穿孔、超聲或水動力遞送進行施用。
因此，本發明的一個方面是提供通過包括這樣的序列的核酸構建體刺激免疫應答的方法，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體。
一個進一步目的提供刺激在這些中的任何或這些中的任何的任何部分內編碼的核酸構建體或蛋白質的細胞內散布的裝置（means）。
本發明的另外一個目的是提供如由本文描述的核酸構建體編碼的嵌合蛋白質。
本發明的一個進一步方面是提供識別由本文描述的核酸構建體編碼的嵌合蛋白質的抗體。
本發明的一個方面是提供用于改善疫苗效力的方法，其包括施用如本文詳述的核酸構建體。
與本發明特別相關的是包括這樣的序列的核酸構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，其適合于引發免疫應答。
本發明的另外一個方面是提供部分試劑盒（kitinparts），所述試劑盒包括如本文描述的核酸構建體連同施用所述核酸構建體的醫療器械或其他裝置，和/或合適疫苗，和另外關于如何使用部分試劑盒的說明書。
因此可見本發明提供了通過給動物施用如本文下文詳述的核酸構建體用于加強動物中的免疫應答的方法。
本發明涉及下列內容：
“權利要求1.一種核酸構建體，其包括編碼下述的序列：
a.與b可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，
b.至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段，
其中所述核酸構建體用于癌癥疫苗的引發，和/或所述恒定鏈或其變體不包括前17個氨基酸，和/或所述恒定鏈或其變體不包括key區域的lrmk氨基酸殘基，和/或所述恒定鏈包括clip區域的變體；
2.根據權利要求1的核酸構建體，其用作用于刺激免疫應答的引發物，從而增加后續施用的疫苗的效力；
3.根據權利要求1的核酸構建體，其中至少一種恒定鏈或其變體是生物特異性的；
4.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中至少一種恒定鏈或其變體是人源的；
5.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述至少一種恒定鏈的至少一個區域、肽或結構域加入、去除或置換所述至少一種恒定鏈的區域、肽或結構域；
6.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述至少一種恒定鏈的key區域的lrmk氨基酸殘基中的1、2、3或4個由其他氨基酸殘基置換；
7.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述至少一種恒定鏈的key區域的lrmk氨基酸殘基中的1、2、3或4個由丙氨酸置換；
8.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述至少一種恒定鏈的key區域的lrmk氨基酸殘基中的1、2、3或4個是缺失的；
9.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述至少一種恒定鏈的clip區域在位置91和99上的甲硫氨酸氨基酸殘基由其他氨基酸殘基置換；
10.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述至少一種恒定鏈的clip區域在位置91和99上的甲硫氨酸氨基酸殘基由丙氨酸置換；
11.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述至少一種恒定鏈的前17個氨基酸是缺失的（δ17ii）；
12.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述恒定鏈包括與來自另一種蛋白質的三聚結構域偶聯的氨基酸殘基編號50–118；
13.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述至少一種恒定鏈或其片段引起以cd4+t細胞依賴性和/或不依賴性方式的mhc-i和/或mhc-ii依賴性免疫應答；
14.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段選自：致病性生物、癌癥特異性多肽和與異常生理學應答相關的蛋白質或肽；
15.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中來自致病性生物的所述至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段選自包括下述的病原體：病毒、微生物和寄生蟲；
16.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段來自哺乳動物生物，優選人病原體；
17.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段來自癌癥特異性多肽；
18.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段來自選自下述的癌癥特異性多肽：hpv衍生的病毒癌基因e5、e6、e7和l1；存活素、bcl-xl、mcl-1和rho-c；
19.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段是與權利要求14–18所述抗原中的任何至少85％等同的抗原肽或蛋白質；
20.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中在所述恒定鏈或其變體和所述抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段之間的操作接頭選自：直接連接或由間隔區介導的連接；
21.根據權利要求20的核酸構建體，其中所述操作接頭是間隔區；
22.根據權利要求21的核酸構建體，其中所述間隔區編碼關于mhcii類分子的至少一個輔助表位；
23.根據權利要求21的核酸構建體，其中所述間隔區編碼至少一個蛋白酶切割位點；
24.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中至少一種恒定鏈與至少2種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接；
25.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中使得所述構建體能夠表達的啟動子在所述至少一種可操作地連接的恒定鏈或其變體和至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段編碼序列前；
26.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其中所述啟動子選自組成型啟動子、誘導型啟動子、生物特異性啟動子、組織特異性啟動子和細胞類型特異性啟動子、cmv啟動子、sv40啟動子和rsv啟動子；
27.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其包括與抗原呈遞和/或細胞內散布有關的基因；
28.根據前述權利要求中任一項的核酸構建體，其包括編碼佐劑的基因；
29.一種遞送媒介物，其包括根據前述權利要求中任一項的核酸構建體；
30.根據權利要求29的遞送媒介物，其中所述媒介物選自：基于rna的媒介物、基于dna的媒介物/載體、基于脂質的媒介物、基于聚合物的媒介物和病毒衍生的dna或rna媒介物；
31.根據權利要求30的遞送媒介物，其中所述遞送媒介物是聚乙二醇化的載體或媒介物；
32.根據權利要求30的遞送媒介物，其中所述基于脂質的媒介物是脂質體；
33.根據權利要求30的遞送媒介物，其中所述基于聚合物的媒介物由選自下述的陽離子聚合物dna載體形成：聚乙烯亞胺（pei）、聚乙二胺和聚丙胺樹狀聚體、聚烯丙胺、陽離子右旋糖酐、殼聚糖、陽離子蛋白質（聚賴氨酸、魚精蛋白和組蛋白）、陽離子肽、多肽、脂多糖和多糖；
34.根據權利要求33的遞送媒介物，其中所述遞送媒介物是生物可降解聚合物微球體；
35.根據權利要求30的遞送媒介物，其中所述遞送媒介物包括將所述核酸構建體包被到膠體金顆粒上；
36.一種用于施用根據權利要求29–35中任一項的遞送媒介物的方法，其中所述施用選自針注射、基因槍、射流注射、電穿孔、超聲和水動力遞送；
37.一種用于施用根據權利要求29–35中任一項的核酸構建體的方法，其中所述施用選自針注射、基因槍、射流注射、電穿孔、超聲和水動力遞送；
38.一種細胞，其包括如權利要求1–28中任一項中定義的核酸構建體；
39.一種嵌合蛋白質，其包括至少一種可操作地連接的恒定鏈或其變體和至少一種抗原蛋白質或肽，編碼其的序列如通過權利要求1–28中任一項中的核酸構建體中的任何定義的；
40.一種抗體，其可以識別如權利要求39中定義的嵌合蛋白質；
41.根據權利要求40的抗體在用于檢測所述抗體與之結合的蛋白質的測定中的用途；
42.一種組合物，其包括編碼下述的核酸序列：
a.與b可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，
b.至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段；
43.一種用作藥物的組合物，其包括編碼下述的核酸序列：
a.與b可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，
b.至少一種多肽；
44.根據權利要求42和43中任一項的組合物，其包括如權利要求1–28中任一項中定義的核酸構建體；
45.根據權利要求42-44中任一項的組合物，其中所述組合物包括至少2種載體；
46.一種組合物，其包括根據權利要求39的至少一種嵌合蛋白質，如通過權利要求1–28中任一項中的核酸構建體中的任何定義的；
47.根據權利要求42-46中任一項的組合物，其中所述組合物包括佐劑；
48.一種部分試劑盒，其包括：
a.包括根據權利要求1–28中任一項的核酸構建體的組合物，
b.用于施用所述組合物的醫療器械或其他裝置，
c.關于如何使用所述部分試劑盒的說明書；
49.根據權利要求48的部分試劑盒，其中所述試劑盒包括第二種活性成分；
50.根據權利要求49的部分試劑盒，其中所述第二種活性成分是合適疫苗；
51.一種用于增加疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供根據權利要求1–28中任一項的核酸構建體、或根據權利要求42–47中任一項的組合物，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體或組合物引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答；
52.根據權利要求51的方法，其中用于引發免疫應答的所述核酸構建體的至少一部分和用于加強所述免疫應答的所述疫苗是等同的；
53.根據權利要求52的方法，其中所述等同部分是所述抗原肽或蛋白質的部分；
54.根據權利要求52的方法，其中所述等同部分是遍在輔助t細胞表位；
55.根據權利要求51的方法，其中所述免疫應答是mhc-i依賴性的；
56.根據權利要求51的方法，其中所述免疫應答是mhc-ii依賴性的；
57.根據權利要求51的方法，其中所述免疫應答是mhc-i和mhc-ii依賴性的；
58.根據權利要求51的方法，其中所述免疫應答是t細胞依賴性的；
59.根據權利要求51的方法，其中所述免疫應答是cd4+t細胞依賴性的；
60.根據權利要求51的方法，其中所述免疫應答是cd4+t細胞不依賴性的；
61.根據權利要求51的方法，其中所述免疫應答是cd8+t細胞依賴性的；
62.根據權利要求51–61中任一項的方法，其包括步驟：
a.提供根據權利要求42–47中任一項的至少一種組合物，
b.給受試者施用所述至少一種組合物至少一次用于動物的治療或預防；
63.根據權利要求51–62中任一項的方法，其中所述組合物施用于最可能是給定感染的接受器的區域；
64.根據權利要求51–63中任一項的方法，其中所述受試者是人；
65.根據權利要求51–63中任一項的方法，其中所述受試者是哺乳動物；
66.根據權利要求51–63中任一項的方法，其中所述受試者是雪貂；
67.根據權利要求51–63中任一項的方法，其中所述受試者是魚；
68.根據權利要求51–63中任一項的方法，其中所述受試者是鳥。”。
附圖說明
圖1：用基于ii鏈的裸露dna疫苗的dna引發。
圖2：在ii序列中結構域和測試的突變的定位。
圖3：ii顯著增加siinfekl/h-2kbova衍生表位的細胞表面呈遞。
圖4：ii僅以順式工作。
圖5：n末端缺失和置換不影響ii刺激能力。
圖6：c末端缺失和置換不影響ii刺激能力。
圖7：僅n和c末端缺失降低ii刺激能力。
圖8：ad-iigp和ad-gp疫苗的劑量應答。
圖9：ad-gp、ad-iigp和ad-iiclipgp作用于mhcii類呈遞的比較。
圖10：ad-gp、ad-iigp、ad-gplamp-1和ad-iiδ17gp在體內時間過程研究中的比較。
圖11：ad-gp、ad-iigp、ad-iiδ17gp、ad-iikeygp、ad-iiclipgp、ad-ii1-117gp和ad-ii1-199gp在體內應答中的比較。
圖12：ad-gp能夠引發后續ad-iigp加強。
圖13：ad-iigp不能引發后續ad-gp或ad-iigp加強。
圖14：ad-gp和adii-gp疫苗的劑量應答。
圖15：與包括殘基50-215的恒定鏈變體（ii50-215）偶聯的甘露糖受體，與腺病毒纖維蛋白質進一步偶聯。
定義
腺病毒：一組包含雙鏈dna的病毒。腺病毒可以進行遺傳修飾，使得其不能復制或條件性不能復制。以這種形式，作為腺病毒構建體或腺病毒載體，它們可以用作基因遞送媒介物用于疫苗接種或基因療法。
腺病毒纖維蛋白質：來自腺病毒的任何血清型的纖維蛋白質。它還稱為腺病毒纖維結或具有異源結插入片段的腺病毒纖維結。
佐劑：其與施用的免疫原決定簇/抗原/核酸構建體的混合物增加或以其他方式修飾對于所述決定簇的免疫應答的任何物質。
氨基酸：任何合成或天然存在的氨基羧酸，包括在肽和多肽包括在體內合成的蛋白質和酶中存在的任何氨基酸，從而包括氨基酸的修飾。術語氨基酸在本文中與術語“氨基酸殘基”同義使用，其意欲包含如所述已與至少一個其他種類例如2、例如3、例如超過3個其他種類反應的氨基酸。通用詞氨基酸包括天然和非天然氨基酸，其中任何可以以“d”或“l”異構形式存在。氨基酸可以縮寫為‘aa’。
抗體：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗體是例如完整免疫球蛋白分子或其保留免疫學活性的片段。
抗原：可以與克隆分布的免疫受體（t細胞或b細胞受體）結合的任何物質。通常是肽、多肽或多聚體多肽。抗原優選能夠引發免疫應答。
加強：通過加強物注射（shot）或劑量來加強是給予免疫試劑例如疫苗的一次或多次另外劑量，在用于引發免疫系統的物質的初始劑量后一段時間給予，以維持或增強通過相同（同源）或另一種（異源）免疫試劑的先前劑量引發的免疫應答。
載體：抗原與之偶聯以幫助誘導免疫應答的實體或化合物。
嵌合蛋白質：由核苷酸序列編碼的遺傳改造蛋白質，所述核苷酸序列通過將2種或更多種完整或部分基因或一系列（非）隨機核酸剪接在一起制備。
補體：其作用于“補充”抗體工作的復雜系列的血液蛋白質。補體破壞細菌，產生炎癥，且調節免疫反應。
細胞因子：生長或分化調節劑，在本文中非限定使用，并且不應限制本發明和權利要求的解釋。除細胞因子外，粘附或輔助分子或其任何組合可以單獨或與細胞因子組合采用。
ctl：細胞毒性t淋巴細胞。表達cd8連同t細胞受體，且因此能夠響應由i類分子呈遞的抗原的t細胞亞組。
遞送媒介物：由此核苷酸序列或多肽或兩者可以從至少一種介質轉運到另一種介質的實體。
片段：用于指出核酸或多肽的非全長部分。因此，片段自身也分別是核酸或多肽。
異源加強或引發-加強：其中用于加強免疫系統的物質不同于先前用于引發免疫應答的物質。
同源加強或引發-加強：其中用于加強免疫系統的物質與先前用于引發免疫應答的物質相同。
個體：鳥、哺乳動物、魚、兩棲類或爬行類包括人類的任何物種或亞種。
恒定鏈：與內質網和后續細胞區室中的mhcii分子結合且穩定其的整合膜蛋白質糖蛋白。此處術語恒定鏈涵蓋所有天然存在或人工生成的與人恒定鏈具有特定相似性的全長或片段化的同源基因和蛋白質。恒定鏈在本文中縮寫為ii。
分離的：與本文公開的核酸、多肽或抗體結合使用的‘分離的’指已鑒定且從其天然的、一般的細胞環境的組分中分離和/或回收的那些。本發明的核酸、多肽和抗體優選是分離的，并且本發明的疫苗和其他組合物優選包括分離核酸、多肽或分離抗體。
mhc：主要組織相容性復合物，存在mhc的2個主要亞類，i類和ii類。
裸露dna：不與組蛋白結合的dna；通常是低甲基化和富含cpg的dna。裸露dna可以是環狀或線性的，例如環狀質粒。
核酸：傳送遺傳信息的核苷酸鏈或序列。就本發明而言，核酸可以是脫氧核糖核酸（dna）或下述中的任何：核糖核酸（rna）、鎖核酸（lna）、肽核酸（pna）、嵌入核酸（ina）、扭曲嵌入核酸（tina）、己糖醇核酸（hna）、阿糖核酸（ana）、環己烷核酸（cna）、環己烯基核酸（cena）、甘油核酸（gna）、蘇糖基核酸（tna）、缺口-聚體（gap-mers）、混合-聚體（mix-mers）和嗎啉代類物質（morpholinos）。
核酸構建體：遺傳改造的核酸。一般包括幾種元件例如基因或其片段、啟動子、增強子、終止子、多聚腺苷酸尾、接頭、多聚接頭、操作接頭、多克隆位點（mcs）、標記、終止密碼子、其他調節元件、內部核糖體進入位點（ires）或其他。
操作接頭：以保證核酸或多肽的生物加工的方式使核酸構建體或（嵌合）多肽的2個部分結合在一起的核苷酸或氨基酸殘基序列。
病原體：疾病的特異性成因劑，特別是生物劑例如病毒、細菌、朊病毒或寄生蟲，其可以引起對其宿主的疾病，也被稱為傳染劑。
肽：限定序列且由酰胺鍵連接的多個共價連接的氨基酸殘基。該術語與寡肽和多肽類似地使用。天然和/或非天然氨基酸可以通過肽鍵或通過非肽鍵連接。術語肽還包含通過化學或酶催化反應引入的翻譯后修飾，如本領域已知的。該術語可以指多肽變體或片段。
藥物載體：也稱為賦形劑或穩定劑，在采用的劑量和濃度下對暴露于其的細胞或個體是無毒的。通常生理學上可接受的載體是ph緩沖的水性溶液。生理學上可接受的載體的例子包括緩沖液例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量（小于約10個殘基）多肽；蛋白質例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如edta；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如tweentm、聚乙二醇（peg）和pluronicstm。
多個：至少2個。
引發：用例如dna初始引發免疫系統，以使免疫應答集中于所需免疫原。
引發-加強：用例如dna初始引發免疫系統，以使免疫應答集中于所需免疫原，并且用疫苗隨后加強免疫應答，導致由所述疫苗誘導的免疫應答中的增加。
啟動子：rna聚合酶在其上結合以起始通過一種或多種附近結構基因的信使rna轉錄的dna鏈中的結合位點。
信號肽：決定蛋白質在細胞中的最終定位的短氨基酸序列，也被稱為分選肽。
合適疫苗：用于根據本發明使用的任何疫苗，能夠加強通過初始引發刺激的免疫應答，特征在于用于引發免疫應答的核酸構建體和用于加強免疫應答的后續疫苗的至少一個部分是等同的。引發物和加強物的所述至少一個等同部分可以是ii或其變體、抗原肽或抗原肽的部分、或遍在的輔助t細胞表位。
表面活性劑：能夠減少它溶解于其中的液體的表面張力的表面活性試劑。表面活性劑是包含其為親水的極性基團和其為疏水的非極性基團，并且通常由脂肪鏈組成的化合物。
疫苗：能夠在動物中誘導免疫應答的物質或組合物：在該正文中也被稱為免疫原性組合物。免疫應答是在生物中誘導記憶的免疫應答（體液/抗體和/或細胞免疫應答），導致傳染劑由二次而不是初次應答對抗，從而減少其對宿主生物的影響。本發明的疫苗可以作為預防和/或治療藥物給予。組合物可以包括下述中的一種或多種：一種或多種抗原、包括與ii可操作地連接的一種或多種抗原的核酸構建體、載體、佐劑和藥物載體。
變體：給定參考核酸或多肽的‘變體’指這樣的核酸或多肽，其展示出與所述參考核酸或多肽的一定序列同源性/同一性程度，但不等同于所述參考核酸或多肽。
結構域、區域和基序在本文中可以互換使用。
具體實施方式
本發明涉及包括這樣的序列的核酸構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽編碼序列可操作地連接的恒定鏈或其變體。核酸構建體用于引發免疫應答，以加強后續加強疫苗接種的效應。
免疫應答
疫苗可以在預防上使用：它們在實際感染發生前給予；或在治療上使用：其中它們引發或加速對已在體內的病原體的免疫應答。2種疫苗接種方法要求實體免疫應答的建立。通過感染或疫苗接種激活的免疫應答依賴于幾種細胞類型例如t、b和抗原呈遞細胞，以及幾種不同分子主要是抗原、mhc分子、t和b細胞受體及許多其他的相互作用。
抗原是在抗原呈遞細胞的表面上由mhc分子呈遞的肽片段。抗原可以是外源的，即致病性來源，或源于生物自身，所謂的自體或自身抗原。mhc分子是由特異性染色體區域編碼的多態基因家族的代表，所述特異性染色體區域稱為“主要組織相容性復合物”（“majorhistocompatibilitycomplex”），因此為mhc。存在2類mhc分子，mhci類（mhc-i）和mhcii類（mhc-ii）。
t輔助細胞通過由mhcii類（mhc-ii）分子呈遞的抗原刺激，所述mhc-ii分子位于抗原呈遞細胞的表面上。mhc-ii分子在內質網中合成。在合成過程中，它們以阻止mhc-ii分子負載有自體或自身抗原的方式與恒定鏈（ii）組合。mhc-ii分子通過恒定鏈中的信號序列轉運至在特異性細胞區室中的細胞表面。隨著區室通過加工其內含物而成熟，它從溶酶體發展到晚期內體（在與內吞囊泡融合后）到mhcii類區室（miic）。內吞囊泡包含外源抗原，即蛋白酶解切割的細菌肽片段。這些片段通過其降解制備，以負載到mhc-ii分子上。mhc-ii分子通過恒定鏈在2部分過程中釋放，這時恒定鏈首先通過蛋白酶解被降解，僅留下在mhc-ii結合結構域中稱為clip的肽，其次通過hla-dm分子去除clip。mhc-ii分子隨后游離，以結合外源抗原，且在miic囊泡與質膜融合后，將其呈遞在細胞表面上。這起始體液免疫應答，因為呈遞的抗原刺激t輔助細胞的激活，這依次通過幾種方式激活b細胞，這最終分化成抗體分泌細胞。
當t細胞毒性細胞的t細胞受體識別與在抗原呈遞細胞上的mhci類分子結合的抗原時，細胞免疫應答起始。mhc-i分子不與功能性類似與mhc-ii結合的恒定鏈的分子結合。mhc-i加工成的抗原呈遞分子另外不同于mhc-ii分子的那種，因為mhc-i分子已在內質網中負載有抗原。由mhc-i分子呈遞的抗原一般是通過蛋白質的蛋白酶體切割的肽片段，所述蛋白質已通過抗原呈遞細胞自身合成。這些蛋白質可以是在細胞自身dna中編碼的異常蛋白質或衍生自病毒或其他病原體的蛋白質，所述病毒或其他病原體已感染細胞且寄生其蛋白質合成機制。mhci類相關蛋白酶解系統存在于基本上所有細胞中。
2類t細胞的功能是顯著不同的，如由其名稱所示的。細胞毒性t細胞通過細胞的直接裂解和通過分泌細胞因子例如γ-干擾素來消滅細胞內病原體和腫瘤。占優勢的細胞毒性t細胞是cd8+t細胞，這也是抗原特異性的。輔助t細胞也是裂解細胞，但其主要功能是分泌促進b細胞（抗體生產細胞）和其他t細胞的活性的細胞因子，并且因此它們廣泛增強對于外源抗原的免疫應答，包括抗體介導的和細胞毒性t細胞介導的應答機制。cd4+t細胞是免疫應答中的主要輔助t細胞表型。
核酸構建體
本發明的一個方面涉及包括這樣的序列的核酸構建體例如裸露dna構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段簡言之抗原可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體。
在一個實施方案中，本發明涉及包括這樣的序列的核酸構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，其中所述恒定鏈或其變體不包括key區域的lrmk氨基酸殘基。
在另一個實施方案中，本發明涉及包括這樣的序列的核酸構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，其中所述恒定鏈或其變體包括clip區域的變體。
在另一個實施方案中，本發明涉及包括這樣的序列的核酸構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，其中所述恒定鏈或其變體不包括前17個氨基酸。
在另外一個實施方案中，本發明涉及包括這樣的序列的核酸構建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，其中所述核酸構建體用于癌癥疫苗的引發。
核酸構建體應理解為遺傳改造的核酸。核酸構建體可以是非復制的且線性的核酸、環狀表達載體或自主復制質粒。核酸構建體可以包括幾種元件，例如但不限于基因或其片段、啟動子、增強子、終止子、多聚腺苷酸尾、接頭、多聚接頭、操作接頭、多克隆位點（mcs）、標記、終止密碼子、內部核糖體進入位點（ires）和用于整合的宿主同源序列或其他限定元件。應當理解根據本發明的核酸構建體可以包括上述元件的任何組合的所有或亞組。
用于改造核酸構建體的方法是本領域眾所周知的（參見例如，molecularcloning：alaboratorymanual，sambrook等人，編輯，coldspringharborlaboratory，第2版，coldspringharbor，n.y.，1989）。進一步地，根據本發明的核酸構建體可以無需模板而合成，并且可以得自各種商業供應者（例如genscriptcorporation）。
在一個實施方案中，核酸構建體包括的核酸殘基可以被修飾。所述修飾可以選自：乙酰化、甲基化、磷酸化、遍在蛋白化、核糖基化、硫化及其他。
在一個實施方案中，根據本發明的核酸構建體可以由dna組成。在另一個實施方案中，核酸構建體可以由選自下述的核酸組成：脫氧核糖核酸（dna）、核糖核酸（rna）、鎖核酸（lna）、肽核酸（pna）、嵌入核酸（ina）、扭曲嵌入核酸（tina）、己糖醇核酸（hna）、阿糖核酸（ana）、環己烷核酸（cna）、環己烯基核酸（cena）、甘油核酸（gna）、蘇糖基核酸（tna）、缺口-聚體、混合-聚體、嗎啉代類物質或其組合。
如上所述，mhcii分子在加工過程中與恒定鏈結合，直至結合的恒定鏈降解，以允許外源抗原肽負載到mhcii分子上。當應用包括恒定鏈–接頭–表位的‘外部’蛋白質構建體時，其中恒定鏈包括key區域（包括lrmk氨基酸殘基），所述蛋白質構建體在所述mhcii分子定位于細胞的細胞外表面上時將與mhcii分子（包含抗原）相互作用。因此，效應是外部的，并且依賴于蛋白質構建體（包括lrmk氨基酸殘基）的恒定鏈key-殘基競爭負載到mhcii分子上的能力。換言之，在細胞內加工過程中已負載到mhcii分子上的抗原必須被“倒出”（“tippedoff”）或從細胞表面上的mhcii分子中去除，并且由包括恒定鏈–接頭–表位的蛋白質構建體代替。這給出無法擴增的“1:1”-效應，并且它不變地依賴于來自恒定鏈的lrmk氨基酸殘基的存在。
根據本發明的核酸構建體涉及應用編碼恒定鏈或其變體且還編碼抗原肽或表位的‘內部’核酸構建體，即核酸構建體轉染到受試者中細胞的細胞內間隙內。所述核酸構建體將使用細胞翻譯機制，以產生恒定鏈–接頭–表位或恒定鏈–表位產物，在所述mhc分子定位在細胞內例如在胞內體或miic中時，這將與mhcii分子或mhci分子（不包含抗原）相互作用。因此，效應是內部的，并且不依賴于蛋白質構建體（包括lrmk氨基酸殘基）的恒定鏈key-結構域競爭負載到mhc分子上的能力。事實上，該效應不依賴于ii-key區域及其lrmk殘基的存在。此外，這給出可以擴增的效應，因為一個核酸構建體可以產生超過一種產物。
核酸構建體的‘內部’使用具有優于蛋白質構建體的‘外部’使用的幾個優點，如上詳述：1）擴增；小量核酸構建體的引入產生可以都與mhc分子結合的許多產物，這還可以是二次擴增的，因為與mhc結合的所述產物可以通過內在化進一步再循環，以最終增加其展示，2）細胞自身抗原加工系統的使用確保表位與mhc分子的正確和緊密結合，3）不需要ii-key區域的lrmk殘基和天然ii-clip結構域。
密碼子最佳化和簡并核酸序列
功能蛋白質在異源宿主中的表達是現代生物技術的基石。不幸的是，許多蛋白質難以在其原始背景外表達。它們可以包含表達限制性調節元件，來自使用非經典核苷酸編碼的生物，或來自具有在所需宿主中很少使用的密碼子的普遍基因（generife）。基因合成速度和效率中的改善已致使可行的完整基因重新設計用于最大限度的蛋白質表達。例如，當在研究下的基因的密碼子頻率與宿主表達系統的密碼子頻率匹配時，蛋白質表達可以顯著改善。例如，重新設計策略可以不僅包括最佳密碼子偏好的使用，還包括mrna結構元件的改變以及翻譯和起始區的修飾。用于密碼子最佳化的技術是本領域技術人員已知的，并且可以通過商業供應者例如genscriptcorporation執行。
應當理解根據本發明包括恒定鏈或其變體的核酸構建體可以以任何方式進行密碼子最優化，以便通過翻譯成蛋白質即氨基酸產生包括根據本發明的恒定鏈或其變體的氨基酸序列，所述恒定鏈對應于seqidno：2（人ii）中公開的氨基酸序列。
同樣地，根據本發明包括恒定鏈的核酸構建體可以以任何方式進行密碼子最優化，以便通過翻譯成蛋白質即氨基酸產生包括根據本發明的恒定鏈或其變體的氨基酸序列，所述恒定鏈對應于其中核酸構建體可以用于引發免疫應答的任何動物的氨基酸序列；包括任何脊椎動物、哺乳動物、魚或鳥。
密碼子偏好：密碼子偏好已鑒定為在原核生物基因表達中的單個最重要因子。給定密碼子在遺傳密碼中出現的程度在生物之間、在以高和低水平表達的蛋白質之間和甚至在相同操縱子的不同部分之間顯著不同。關于這點的原因幾乎是必然的，因為優選密碼子與細胞內可用的同族trna豐度相關。這個關系用于最優化翻譯系統且平衡密碼子濃度與同工trna（isoacceptortrna）濃度。
替換很少使用的密碼子：一般而言，基因包含的罕見密碼子越多，異源蛋白質將在那種特定宿主系統內以合理水平表達的可能性越小。如果罕見密碼子成簇或在蛋白質的n末端部分中出現，那么這些水平變得甚至更低。用更緊密地反映宿主系統的密碼子偏好而不改變氨基酸序列的其他密碼子替換罕見密碼子可以增加功能蛋白質表達水平。
消除問題密碼子：生物使用小于5％-10％時機的任何密碼子都可能引起問題，不管它來自何處。再次，緊密或相鄰密碼子對蛋白質表達比它們分開可以具有更大的影響。消除罕見密碼子和可以作為終止信號閱讀的密碼子可以阻止低表達或不存在表達的情況。
在哺乳動物宿主中表達病毒蛋白質：如果基因正確制備，甚至病毒基因也可以在哺乳動物細胞系中成功表達。病毒基因的密集信息負荷頻繁導致重疊的讀碼框。許多病毒基因還在編碼序列內編碼順式作用的負調節序列。病毒基因可以重新合成，不僅只表達所需蛋白質，還破壞調節元件，從而增強蛋白質產生。病毒密碼子最優化在dna疫苗研究中是特別有用的，因為它增加靶的免疫原性。
其他限制：盡管密碼子偏好在基因表達中發揮很大作用，但表達載體和轉錄啟動子的選擇也是重要的。在蛋白質n末端區域周圍的核苷酸序列對于罕見密碼子的存在和緊鄰起始aug的密碼子的特性是特別敏感的。在翻譯和mrna穩定性之間還存在一定相互影響。
遺傳密碼的簡并性
根據上文可見遺傳密碼具有冗余性但不具有多義性（ambiguity）。例如，盡管密碼子gaa和gag都指定谷氨酸（冗余性），但其中無一指定任何其他氨基酸（無多義性）（關于完全關聯參見下文密碼子表）。編碼一種氨基酸的密碼子可以在其3個位置中的任何中不同。遺傳密碼的簡并性是解釋沉默突變的存在的原因。因為4種堿基的三聯體密碼指定20種氨基酸和終止密碼子，所以產生簡并性。
該表顯示20種氨基酸、起始（start）和終止（stop）密碼子和64種可能密碼子。mrna的方向是5'到3'。
同義置換
沉默突變或置換是不導致對蛋白質的氨基酸序列的改變的dna突變。它們可以在非編碼區中出現（在基因外或在內含子內），或它們可以以不改變最終氨基酸序列的方式在外顯子內出現。短語沉默突變或置換通常可與短語同義突變或置換互換使用；然而，同義突變或置換是前者的子范疇，僅在外顯子內出現。
應當理解根據本發明包括恒定鏈或其變體的核酸構建體可以包括同義置換，以便通過翻譯成蛋白質即氨基酸產生包括根據本發明的恒定鏈或其變體的氨基酸序列，所述恒定鏈對應于seqidno：2（人ii）中公開的氨基酸序列。
同樣地，根據本發明包括恒定鏈的核酸構建體可以包括同義置換，以便通過翻譯成蛋白質即氨基酸產生包括根據本發明的恒定鏈或其變體的氨基酸序列，所述恒定鏈對應于其中核酸構建體可以用于引發免疫應答的任何動物的氨基酸序列；包括任何脊椎動物、哺乳動物、魚或鳥。
非同義置換成同義氨基酸
非同義置換引起氨基酸中的改變。然而，氨基酸根據所述氨基酸的性質分組，并且一個氨基酸由另一個氨基酸的置換可以對包括所述氨基酸的蛋白質的功能或性質沒有影響（如果置換導致同義氨基酸）。此類置換可以指示保守置換或突變：dna或rna序列中的改變導致一個氨基酸由生物化學相似的氨基酸替換。
因此，應當理解根據本發明包括恒定鏈或其變體的核酸構建體可以包括非同義置換，以便通過翻譯成蛋白質即氨基酸產生包括恒定鏈變體的氨基酸序列，其中所述非同義置換導致其為同義的一個或多個氨基酸的置換。
同義置換可以包括疏水性氨基酸由另一個疏水性氨基酸的置換；親水性氨基酸由另一個親水性氨基酸的置換；極性氨基酸由另一個極性氨基酸的置換；非極性氨基酸由另一個非極性氨基酸的置換；帶正電的氨基酸由另一個帶正電的氨基酸的置換；帶負電的氨基酸由另一個帶負電的氨基酸的置換；中性氨基酸由另一個中性氨基酸的置換；多重性（ambiguous）氨基酸由其配對多重性荷電氨基酸的置換，例如異亮氨酸和亮氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸以及谷氨酰胺和谷氨酸；芳香族氨基酸由另一個芳香族氨基酸的置換；脂肪族氨基酸由另一個脂肪族氨基酸的置換；或任何氨基酸由丙氨酸的置換。這些置換可以指示等值置換。
剪接變體
可變剪接是rna剪接變異機制，其中初級基因轉錄物（前mrna）的外顯子分離且重新連接，以便產生可變核糖核苷酸排列。這些線性組合隨后經歷翻譯過程，其中指定氨基酸的特定和獨特序列，導致同種型蛋白質或剪接變體。以這種方式，可變剪接使用遺傳表達以促進更多樣的蛋白質的合成。在真核生物中，可變剪接是朝向更高效率的重要步驟，因為信息可以經濟得多地被貯存。幾種蛋白質可以在其長度在原核生物編碼方式中只夠2種蛋白質的dna序列中編碼。
在一個實施方案中，本發明的核酸構建體可以這樣設計，以便產生多重抗原肽或抗原肽的片段和/或多重恒定鏈或其變體。
在一個實施方案中，根據本發明的核酸構建體包括抗原肽或所述抗原肽的片段的至少1、例如2、例如3、例如4、例如5、例如6、例如7、例如8、例如9、例如10、例如11、例如12、例如13、例如14、例如15、例如16、例如17、例如18、例如19、例如20種剪接變體。
超過一種抗原肽剪接變體可以包含等同或不等同的抗原肽。
在另一個實施方案中，根據本發明的核酸構建體包括恒定鏈或其變體的至少1、例如2、例如3、例如4、例如5、例如6、例如7、例如8、例如9、例如10、例如11、例如12、例如13、例如14、例如15、例如16、例如17、例如18、例如19、例如20種剪接變體。
超過一種恒定鏈剪接變體可以包含等同或不等同恒定鏈或其變體。
在一個實施方案中，恒定鏈的至少一種剪接變體包括天然全長恒定鏈。在另一個實施方案中，恒定鏈的至少一種剪接變體包括恒定鏈的變體。在另外一個實施方案中，恒定鏈的至少一種剪接變體包括恒定鏈的變體，其中所述ii不包括ii-key區域的lrmk氨基酸殘基。在另一個實施方案中，恒定鏈的至少一種剪接變體包括恒定鏈的變體，其中所述ii不包括clip結構域的m91和m99殘基。
由此可見剪接變體可以包括等同或不等同抗原肽和/或等同或不等同恒定鏈或其變體的任何組合。
以這種方式，可能的是“改組”（“shuffle”）包括恒定鏈的不同結構域或區域的序列（外顯子），以便通過可變剪接獲得恒定鏈的變體。以這種方式，還可能的是“改組”包括一種或多種抗原肽的不同結構域或區域的序列（外顯子），以便通過可變剪接獲得一種或多種所述抗原肽的變體。
恒定鏈
恒定鏈（ii）或mhcii類結合的恒定鏈或cd74或p31是非多態ii型嵌膜蛋白質，關于人和小鼠ii的氨基酸序列分別參見seqidnos：2和4，并且同樣地關于人和小鼠ii的核酸序列分別參見seqidnos：1和3。恒定鏈在淋巴細胞成熟和適應性免疫應答中具有多重功能，特別地靶向溶酶體區室是iiclip序列可以占據mhcii類分子，直至這些與胞內體區室融合（pietersj.1997，curr.opin.immunol.，9:8996）。此外，ii已顯示發揮mhci類伴侶蛋白的功能（morris等人，2004，immunol.res.30:171-179），并且通過其胞內體靶向序列，促進針對共價連接抗原的cd4+而不是cd8+t細胞的增殖（diebold等人，2001，genether.8:487-493）。
恒定鏈蛋白質包括幾個結構域：包括信號或分選肽（也稱為溶酶體靶向序列）的細胞溶質結構域、跨膜結構域、和其自身包括clip區域、key區域（包括lrmk殘基）的腔結構域、核心結構域和三聚結構域。這些結構域的兩側為高度彈性區域（strumptner-cuvelette&benaroch，2002，biochem.biophys.acta.，1542:1-13）。恒定鏈已在幾種生物中得到表征，包括脊椎動物（例如雞）、哺乳動物（例如牛、犬、小鼠和大鼠）和人。
本發明涉及包括這樣的序列的核酸構建體，其中至少一種恒定鏈或其變體是生物特異性的，或可以與特定生物有關。優選地，至少一種恒定鏈具有脊椎動物起源，更優選哺乳動物起源且最優選人起源。與之相關，由seqidno：1限定的序列是來自人的恒定鏈的核酸序列。在另一個優選實施方案中，至少一種恒定鏈具有禽起源，最優選來自家雞（gallusgallusdomesticus）（雞）。在另外一個優選實施方案中，至少一種恒定鏈衍生自魚，最優選可以在養魚場中培育的魚（例如大麻哈魚或鮭魚）。在另外一個優選實施方案中，至少一種恒定鏈衍生自雪貂。
采用的恒定鏈優選是待接受核酸構建體的生物的恒定鏈。本發明的一個目的是恒定鏈和宿主生物或處理接受者具有相同物種。
在本發明的一個實施方案中，包括至少一種恒定鏈或其變體的核酸構建體具有下述前提：當核酸構建體包括至少一種恒定鏈的變體時，所述恒定鏈不包括ii-key序列的lrmk氨基酸殘基。
在本發明的另一個實施方案中，包括至少一種恒定鏈或其變體的核酸構建體具有下述前提：當核酸構建體包括至少一種恒定鏈的變體時，所述恒定鏈包括ii-clip結構域的變體。在一個實施方案中，所述變體是在位置91和99上的甲硫氨酸由另一個氨基酸的置換。在另一個實施方案中，所述變體是m91am99a雙點突變（在位置91和99上的氨基酸甲硫氨酸至丙氨酸的置換）。
在另一個實施方案中，ii變體是ii的前17個氨基酸的缺失（δ17ii）。
在第三個實施方案中，ii變體包括在位置91和99上的甲硫氨酸的置換，和ii的前17個氨基酸的缺失。
本發明人已驚訝地發現ii-key結構域的lrmk殘基不是根據本發明用于引發免疫應答所需的。
此外，本發明人已驚訝地發現在ii的位置91和99上的甲硫氨酸置換增加mhcii呈遞。
此外，本發明人已發現缺失ii的前17個氨基酸令人驚訝地增加記憶應答。
本發明人已進一步發現包括殘基編號50–118的恒定鏈的中心部分是獲得ii的完全效應所需的。這種ii變體缺乏三聚結構域。因此，在一個實施方案中，核酸構建體包括至少一種恒定鏈或其變體，其中所述恒定鏈包括與來自另一種蛋白質的三聚結構域偶聯的氨基酸殘基編號50–118。所述其他蛋白質可以是例如細菌蛋白質或腺病毒纖維蛋白質。
本發明還涉及核酸構建體，其中編碼的至少一種恒定鏈是具有至少40個氨基酸的seqidno：2中鑒定的序列片段且與seqidno：2的相同片段具有至少85％同一性。
片段是來自如seqidno：2中所示恒定鏈的任何部分的至少40個氨基酸的片段。這包括包含下述殘基的片段：殘基1-40、10-50、20-60、25-65、30-70、35-75、40-80、45-85、50-90、55-95、60-100、65-105、70-110、75-115、80-120、85-125、90-130、95-135、100-140、105-145、110-150、115-155、120-160、125-165、130-170、135-175、140-180、145-185、150-190、155-195、160-200,165-205、170-210和175-216。它還包括如上文列出中的任何擴大至其任一側的高達5個殘基的片段。它進一步包括至少50個殘基、至少60個殘基、至少70個殘基、至少80個殘基、至少90個殘基、至少100個殘基、至少110個殘基、至少120個殘基、至少130個殘基、至少140個殘基、至少150個殘基、至少160個殘基、至少170個殘基、至少180個殘基至少190個殘基、至少200個殘基和至少210個殘基的片段。
在本發明的范圍內包括與seqidno：2具有至少85％序列同一性、例如至少90％序列同一性、例如至少91％序列同一性、例如至少92％序列同一性、例如至少93％序列同一性、例如至少94％序列同一性、例如至少95％序列同一性、例如至少96％序列同一性、例如至少97％序列同一性、例如至少98％序列同一性、例如99％序列同一性的上述片段中的任何。
氨基酸序列之間的同一性/同源性可以使用眾所周知的評分矩陣進行計算，例如blosum30、blosum40、blosum45、blosum50、blosum55、blosum60、blosum62、blosum65、blosum70、blosum75、blosum80、blosum85和blosum90中的任何一個。
在一個實施方案中，本發明是核酸構建體，其中編碼的至少一種恒定鏈是具有至少186個氨基酸的seqidno：2的片段。這包括如上定義并且因此與seqidno：2的恒定鏈序列共享同一性的片段中的任何。
本發明另外涉及核酸構建體，其中編碼的至少一種恒定鏈與seqidno：2至少85％等同。
這包含與seqidno：2具有至少85％序列同一性、例如至少90％序列同一性、例如至少91％序列同一性、例如至少92％序列同一性、例如至少93％序列同一性、例如至少94％序列同一性、例如至少95％序列同一性、例如至少96％序列同一性、例如至少97％序列同一性、例如至少98％序列同一性、例如99％序列同源性的衍生自如seqidno：2中提及的恒定鏈的任何序列，其包括在本發明的范圍內。這包括比seqidno：2中所述的序列更長或更短的序列。
與起源、序列同一性或長度無關，上述序列中的任何來自在此命名的恒定鏈變體。
由此可見在本發明的范圍內，來自任何生物的恒定鏈變體可以是根據上文的變體，即變體可以在ii-key區域中是改變的和/或在ii-clip區域中是改變的和/或是生物恒定鏈的片段和/或在恒定鏈的所有序列上或在其片段內與所述恒定鏈至少85％等同。恒定鏈還可以來自生物的相關物種或來自遙遠相關的物種。
本發明的另一個方面涉及如由核酸構建體編碼的至少一種恒定鏈的區域、肽或結構域的添加、去除或置換。這些區域、肽或結構域中的一個或多個的去除將截短所得到的恒定鏈。區域、肽或結構域的添加或替換包括從已知來源例如天然存在的蛋白質或多肽或從人工合成的多肽或編碼其的核酸殘基中選擇這些序列的選項。區域、結構域或肽的添加包括添加每種類型或不同類型區域、結構域、肽中的1個、2個或更多個，和編碼這些區域、結構域和肽的核酸中的1個、2個、3個或更多個的選項。這些基于序列可以是彼此等同或不同的。區域、肽和結構域無需與支架恒定鏈源于相同的生物。
區域、結構域或肽的去除包括去除每種類型或不同類型區域、結構域、肽中的1個、2個、3個或更多個和去除編碼這些區域、結構域和肽的氨基酸殘基中的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個的選項。執行編碼所得到的多肽的個別核苷酸以及核苷酸段的添加、缺失和置換是本領域眾所周知的。
當確定哪些置換、缺失、重排或其他改變對于構建體將是有利的時，比對來自不同生物的同源基因或蛋白質的核酸且特別是蛋白質序列可以具有極大幫助。如下舉例說明的比對人和鼠類恒定鏈序列給出哪些氨基酸殘基對于在這些生物中恒定鏈的結構和功能可以具有重要性的指示–這些是在2個序列之間是保守的殘基。同樣地，推測的較不重要的殘基是在其中序列不同的那些。就本發明而言有利的是執行變體殘基/區域的置換和/或缺失。當嘗試突變或缺失或以其他方式改變例如人恒定鏈的序列以便改善其免疫應答刺激能力時，檢查保守殘基且制備例如同源置換（即其中氨基酸被視為具有例如相同結構質量、極性、疏水性或其他的置換）也可以是相關的。
在衍生自人和小鼠的恒定鏈蛋白質如下比對中，key區域的lrmk氨基酸殘基是具有下劃線的。
key區域
本發明的一個優選實施方案涉及至少一種恒定鏈的key區域的去除、置換或替換。如上所述，key區域的添加或替換包括用來自相同或其他生物的恒定鏈的key區域或來自相同或其他生物的key區域的變體來添加或替換在選擇的一種或多種恒定鏈的變體中的現有key區域的選項。如由上文可見的，變體key區域可以是特異性生成的key區域的突變體形式，通過單個或多個核酸置換、缺失或添加生成。一個優選實施方案包括單獨的key區域的n末端或c末端相鄰序列，但不含key區域自身。相鄰意指在key區域的10個殘基內、在key區域的20個殘基內、在30個殘基內、在40個殘基內、在50個殘基內、在75個殘基內或在100個殘基內的任何氨基酸。
一個最優選的實施方案包括key區域的一個或多個置換或缺失，導致在key區域中包括的lrmk氨基酸中的1個、2個、3個或4個氨基酸殘基的置換或缺失。在一個實施方案中，缺失在key區域中包括的lrmk氨基酸中的至少1個、例如2個、例如3個、例如4個。在另一個實施方案中，在key區域中包括的lrmk氨基酸中的至少1個、例如2個、例如3個、例如4個由其他氨基酸置換。所述氨基酸可以是選自下述的任何氨基酸：g（甘氨酸）、p（脯氨酸）、a（丙氨酸）、v（纈氨酸）、l（亮氨酸）、i（異亮氨酸）、m（甲硫氨酸）、c（半胱氨酸）、f（苯丙氨酸）、y（酪氨酸）、w（色氨酸）、h（組氨酸）、k（賴氨酸）、r（精氨酸）、q（谷氨酰胺）、n（天冬酰胺）、e（谷氨酸）、d（天冬氨酸）、s（絲氨酸）和t（蘇氨酸）。
在一個特定實施方案中，lrmk氨基酸殘基各自由丙氨酸（a）氨基酸殘基置換，從而序列閱讀為：aaaa。在另一個實施方案中，lrmk氨基酸殘基由包括同義或等值置換的氨基酸置換。例如，氨基酸殘基l可以由i、v、m或f置換；r可以由k、h、e或d置換；m可以由l、i、f或v置換；并且k可以由h或r置換。
在本發明的一個實施方案中，key區域可以包括大于lrmk殘基，或lrmk殘基可以由大于4個氨基酸殘基的序列替換。
本發明的一個實施方案涉及如上所述不含key區域的恒定鏈的片段。這些片段可以是至少5個氨基酸殘基長，長度至少10個殘基、至少15個殘基、至少20個殘基、至少25個殘基、至少30個殘基或至少35個殘基。另一個實施方案涉及恒定鏈的片段，其中信號肽被去除，并且恒定鏈片段是至少10個氨基酸殘基長，長度至少15個殘基、至少20個殘基、至少25個殘基、至少30個殘基、至少35個殘基、至少50個殘基、至少60個殘基、至少70個殘基、至少80個殘基、至少90個殘基、至少100個殘基、至少110個殘基、至少120個殘基、至少130個殘基、至少140個殘基、至少150個殘基、至少160個殘基、至少170個殘基或至少180個殘基。
在本發明的一個實施方案中，由如本文描述的核酸構建體編碼的至少一種恒定鏈不包括ii-key區域的lrmk氨基酸殘基。
在一個實施方案中，本發明因此涉及包括與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段連接的至少一種恒定鏈或其變體的核酸構建體，其中所述恒定鏈或其變體不包括ii-key區域的lrmk氨基酸殘基。
clip區域
本發明的另一個實施方案涉及至少一種恒定鏈的clip區域的去除、添加或替換。如上所述，clip區域的添加或替換包括用來自相同或其他生物的恒定鏈的clip區域或來自相同或其他生物的clip區域的變體來添加或替換在選擇的一種或多種恒定鏈的變體中的現有clip區域的選項。如由上文可見的，變體clip區域可以是特異性生成的clip區域的突變體形式，通過單個或多個核酸置換、缺失或添加生成。一個優選實施方案包括單獨的clip區域，或連同n末端相鄰序列或c末端相鄰序列的clip區域，不含恒定鏈的任何其他區域或結構域。其他優選實施方案包括單獨的clip區域的n末端或c末端相鄰序列，但不含clip區域自身。相鄰意指在clip區域的10個殘基內、在clip區域的20個殘基內、在30個殘基內、在40個殘基內、在50個殘基內、在75個殘基內或在100個殘基內的任何氨基酸，。
一個優選實施方案包括clip區域的一個或多個置換或缺失，導致在clip區域的1個、2個、3個、4個或更多個氨基酸殘基的置換或缺失。在一個實施方案中，缺失在clip區域中包括的氨基酸中的至少1個、例如2個、例如3個、例如4個或更多個。在另一個實施方案中，在clip區域中包括的氨基酸中的至少1個、例如2個、例如3個、例如4個或更多個由其他氨基酸置換。所述氨基酸可以是選自下述的任何氨基酸：g（甘氨酸）、p（脯氨酸）、a（丙氨酸）、v（纈氨酸）、l（亮氨酸）、i（異亮氨酸）、m（甲硫氨酸）、c（半胱氨酸）、f（苯丙氨酸）、y（酪氨酸）、w（色氨酸）、h（組氨酸）、k（賴氨酸）、r（精氨酸）、q（谷氨酰胺）、n（天冬酰胺）、e（谷氨酸）、d（天冬氨酸）、s（絲氨酸）和t（蘇氨酸）。
本發明的一個實施方案涉及如上所述不含clip區域的恒定鏈的片段。這些片段可以是至少5個氨基酸殘基長，長度至少10個殘基、至少15個殘基、至少20個殘基、至少25個殘基、至少30個殘基或至少35個殘基。另一個實施方案涉及恒定鏈的片段，其中信號肽被去除，并且恒定鏈片段是至少10個氨基酸殘基長，長度至少15個殘基、至少20個殘基、至少25個殘基、至少30個殘基、至少35個殘基、至少50個殘基、至少60個殘基、至少70個殘基、至少80個殘基、至少90個殘基、至少100個殘基、至少110個殘基、至少120個殘基、至少130個殘基、至少140個殘基、至少150個殘基、至少160個殘基、至少170個殘基或至少180個殘基。
在一個特定實施方案中，在位置91和99上的m氨基酸殘基各自由丙氨酸（a）氨基酸殘基置換，從而序列閱讀為：m91am99a。在另一個實施方案中，在位置91和99上的m氨基酸殘基由包括同義或等值置換的氨基酸置換。
在本發明的一個實施方案中，由如本文描述的核酸構建體編碼的至少一種恒定鏈不包括在ii-clip序列的位置91和99上的m氨基酸殘基。
在一個實施方案中，本發明因此涉及包括與至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段連接的至少一種恒定鏈或其變體的核酸構建體，其中所述恒定鏈或其變體不包括在ii-clip區域的位置91和99上的m氨基酸殘基。
n或c末端改變:
本發明的一個實施方案涉及至少一種恒定鏈的n或c末端區域的去除（缺失）、置換或替換。如上所述，n或c末端區域的添加或替換包括用來自相同或其他生物的恒定鏈或其他蛋白質的n或c末端區域或來自相同或其他生物的n或c末端區域的變體來添加或替換在選擇的一種或多種恒定鏈的變體中的現有n或c末端區域的選項。如由上文可見的，變體n或c末端區域可以是特異性生成的n或c末端區域的突變體形式，其通過單個或多個核酸置換、缺失或添加生成。
一個實施方案包括ii的前（n末端）或末（c末端）氨基酸的缺失，例如ii的前或末1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150個氨基酸。
在本發明的一個特定實施方案中，ii變體包括ii的前17個氨基酸的缺失（δ17ii）。
本發明的一個實施方案涉及不含完整n或c末端區域的如上所述恒定鏈的片段。這些片段可以是至少5個氨基酸殘基長，長度至少10個殘基、至少15個殘基、至少20個殘基、至少25個殘基、至少30個殘基或至少35個殘基。另一個實施方案涉及恒定鏈的片段，其中信號肽被去除，并且恒定鏈片段是至少10個氨基酸殘基長，長度至少15個殘基、至少20個殘基、至少25個殘基、至少30個殘基、至少35個殘基、至少50個殘基、至少60個殘基、至少70個殘基、至少80個殘基、至少90個殘基、至少100個殘基、至少110個殘基、至少120個殘基、至少130個殘基、至少140個殘基、至少150個殘基、至少160個殘基、至少170個殘基或至少180個殘基。
在本發明的一個實施方案中，ii的跨膜區段的所有或部分可以由來自任何其他蛋白質例如趨化因子受體ccr6tm6的相應區段替換。
在本發明的另一個實施方案中，ii的跨膜區段的所有或部分可以由來自趨化因子受體ccr6tm6的相應區段替換。
信號肽
本發明的另一個實施方案涉及至少一種恒定鏈，其中信號肽被去除、替換或添加到編碼恒定鏈的序列上。信號肽是決定蛋白質在細胞中的最終定位的短氨基酸序列，也被稱為分選肽。決定蛋白質至亞細胞區室例如內質網、高爾基體和各種區室包括高爾基體、核、質膜、線粒體及其中的各種空間和膜、過氧化物酶體、溶酶體、胞內體和分泌囊泡的信號肽都包括在本發明的范圍內。一個優選實施方案包括單獨的恒定鏈的溶酶體靶向序列。
抗原
恒定鏈的上述變體中的任何以這樣的形式包含在本發明中，其中所述變體中的至少一種與至少一種抗原例如抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段可操作地連接。
本發明的一個目的是包括但不限于源于致病性生物的抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的片段、癌癥特異性多肽和抗原、和與異常生理學應答相關的蛋白質或肽。
更優選地，本發明的一個目的是包括源于下述類型病原體中的任何的抗原：病毒、微生物和寄生蟲。這包括任何動物已知的病原體。優選具有來自哺乳動物病原體的抗原，例如特異性靶向哺乳動物例如雪貂的病原體。優選具有來自人病原體的抗原。一般而言，可以使用發現與人病原體或疾病相關的任何抗原。
在另一個實施方案中，優選具有來自禽病原體的抗原，例如特異性靶向鳥或家禽的病原體。更優選具有來自雞（家雞）的抗原。一般而言，可以使用發現與禽病原體相關的任何抗原。
在另外一個實施方案中，優選具有來自魚類病原體即特異性靶向魚的病原體的抗原。更優選具有來自可以在養魚場中培育的魚的抗原。一般而言，可以使用發現與魚類病原體相關的任何抗原。
病毒抗原
在一個優選實施方案中，至少一種抗原可以源于但不限于下述病毒科中的任何：腺病毒、沙粒病毒科、星狀病毒科、布尼亞病毒科、嵌杯病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、皰疹病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、細小rna病毒科、痘病毒科、呼腸病毒科、逆轉錄病毒科、彈狀病毒科和披膜病毒科。
更具體而言，至少一種抗原或抗原序列可以衍生自下述病毒中的任何：甲型流感例如h1n1、h1n2、h3n2和h5n1（禽流感），乙型流感，丙型流感病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒，輪狀病毒屬，諾瓦克病毒屬中的任何病毒，腸腺病毒，細小病毒屬，登革熱病毒，猴痘，單股負鏈病毒目，狂犬病病毒屬例如狂犬病病毒，拉戈斯蝙蝠病毒，莫科拉病毒，杜溫哈格病毒，歐洲蝙蝠病毒1和2以及澳大利亞蝙蝠病毒，短暫熱病毒屬，水泡病毒屬，水皰性口炎病毒（vsv），皰疹病毒例如單純皰疹病毒1和2型，水泡帶狀皰疹，巨細胞病毒，eb病毒（ebv），人皰疹病毒（hhv），人皰疹病毒6和8型，人免疫缺陷病毒（hiv），乳頭狀瘤病毒，鼠類γ皰疹病毒，沙粒病毒例如阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、sabia伴隨出血熱病毒、委內瑞拉出血熱病毒、拉沙熱病毒，machupo病毒，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（lcmv），布尼亞病毒科例如克里米亞-剛果出血熱病毒，漢他病毒，引起伴腎病綜合征的出血熱病毒，裂谷熱病毒，絲狀病毒科（絲狀病毒）包括埃博拉出血熱和馬爾堡出血熱，黃病毒科包括科薩努爾森林病病毒，鄂木斯克出血熱病毒，引起蜱傳腦炎的病毒和副粘病毒例如亨德拉病毒和尼帕病毒，重型天花和輕型天花（天花），甲病毒例如委內瑞拉馬腦炎病毒，東方馬腦炎病毒，西方馬腦炎病毒，sars-相關冠狀病毒（sars-cov），西尼羅河病毒，引起任何腦炎的病毒。
在本發明的一個優選實施方案中，至少一種抗原蛋白質或肽來自選自下述的病毒：hiv、丙型肝炎病毒、流感病毒、皰疹病毒、拉沙、埃博拉、天花、禽流感、絲狀病毒、馬爾堡和乳頭狀瘤病毒。
在本發明的一個更優選實施方案中，至少一種抗原蛋白質或肽選自下述和/或可以是下述中的任何的至少一個抗原片段：水皰性口炎病毒糖蛋白（vsv-gp）；甲型流感ns-1（非結構蛋白質1）、m1（基質蛋白質1）、np（核蛋白）、nep、m2、m2e、ha、na、pa、pb1、pb2、pb1-f2；lcmvnp、lcmvgp；埃博拉gp、埃博拉np；hiv抗原tat、vif、rev、vpr、gag、pol、nef、env、vpu；siv抗原tat、vif、rev、vpr、gag、pol、nef、env；鼠類γ皰疹病毒m2、m3和orf73（例如mhv-68m2、m3和orf73）；雞卵白蛋白（ova）；或輔助t細胞表位。將本文提及抗原中的任何的2種或更多種組合是在本發明的范圍內的。
微生物抗原
本發明的一個實施方案包括來自微生物的至少一種抗原蛋白質或肽或抗原蛋白質或肽的片段。更具體而言，至少一種抗原可以衍生自來自非詳盡列表的下述中的一種：炭疽（炭疽芽孢桿菌（bacillusanthracis）），結核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis），沙門氏菌屬（salmonella）（雞沙門氏菌（salmonellagallinarum）、雞白痢沙門氏菌（s.pullorum）、傷寒沙門氏菌（s.typhi）、腸炎沙門氏菌（s.enteridtidis）、副傷寒沙門氏菌（s.paratyphi）、都柏林沙門氏菌（s.dublin）、鼠傷寒沙門氏菌（s.typhimurium）），肉毒梭菌（clostridiumbotulinum），產氣莢膜梭菌（clostridiumperfringens），白喉桿菌（corynebacteriumdiphtheriae），百日咳博德特氏菌（bordetellapertussis），彎曲桿菌屬（campylobacter）例如空腸彎曲桿菌（campylobacterjejuni），新型隱球菌（crytococcusneoformans），鼠疫耶爾森氏菌（yersiniapestis），小腸結腸炎耶爾森氏菌（yersiniaenterocolitica），假結核耶爾森氏菌（yersiniapseudotuberculosis），單核細胞增多性李斯特菌（listeriamonocytogenes），鉤端螺旋體屬（leptospira）物種，嗜肺軍團菌（legionellapneumophila），伯氏疏螺旋體（borreliaburgdorferi），鏈球菌屬（streptococcus）物種例如肺炎鏈球菌（streptococcuspneumoniae），腦膜炎奈瑟球菌（neisseriameningitides），流感嗜血桿菌（haemophilusinfluenzae），弧菌屬（vibrio）物種例如霍亂弧菌（vibriocholerae）o1、霍亂弧菌非o1、副溶血弧菌（v.parahaemolyticus）、副溶血弧菌、溶藻弧菌（v.alginolyticus）、弗尼斯弧菌（v.furnissii）、鯊魚弧菌（v.carchariae）、霍氏弧菌（v.hollisae）、辛辛那提弧菌（v.cincinnatiensis）、梅氏弧菌（v.metschnikovii）、海魚弧菌（v.damsela）、擬態弧菌（v.mimicus）、河流弧菌（v.fluvialis）、創傷弧菌（v.vulnificus），蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus），嗜水氣單胞菌（aeromonashydrophila）、豚鼠氣單胞菌（aeromonascaviae）、溫和氣單胞菌（aeromonassobria）和維氏氣單胞菌（aeromonasveronii），類志賀鄰單胞菌（plesiomonasshigelloides），志賀氏菌屬（shigella）物種例如宋氏志賀氏菌（shigellasonnei）、鮑氏志賀氏菌（s.boydii）、弗氏志賀氏菌（s.flexneri）和痢疾志賀氏菌（s.dysenteriae），致瀉大腸埃希氏菌（enterovirulentescherichiacoli）eec（產腸毒素大腸埃希氏菌（escherichiacoli-enterotoxigenic）（etec）、腸致病性大腸埃希氏菌（escherichiacoli-enteropathogenic）（epec）、腸出血性大腸埃希氏菌o157∶h7（escherichiacolio157:h7enterohemorrhagic）（ehec）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（escherichiacoli-enteroinvasive）（eiec）），葡萄球菌屬（staphylococcus）物種例如金黃色葡萄球菌（s.aureus）且特別是萬古霉素中間產物/抗性物種（visa/vrsa）或多藥抗性物種（mrsa），志賀氏菌屬物種例如弗氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌，微小隱孢子蟲（cryptosporidiumparvum），布魯氏菌屬（brucella）物種例如流產布魯氏菌（b.abortus）、馬爾他布魯氏菌（b.melitensis）、綿羊布魯氏菌（b.ovis）、豬布魯氏菌（b.suis）和犬布魯氏菌（b.canis），鼻疽伯克霍爾德菌（burkholderiamallei）和類鼻疽伯克霍爾德菌（burkholderiapseudomallei），鸚鵡衣原體（chlamydiapsittaci），貝氏柯克斯體（coxiellaburnetii），土拉熱弗朗西絲菌（francisellatularensis），普氏立克次體（rickettsiaprowazekii），夾膜組織胞漿菌（histoplasmacapsulatum），粗球孢子菌（coccidioidesimmitis）。
在本發明的一個優選實施方案中，至少一種抗原蛋白質或肽來自選自下述的微生物：結核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌、葡萄球菌屬物種和弧菌屬物種。
寄生蟲抗原
本發明的一個實施方案涉及核酸構建體，其中編碼的至少一種抗原蛋白質或肽來自寄生蟲。
本發明的另一個實施方案涉及核酸構建體，其包括來自上述病原體中的任何的至少2種抗原蛋白質或肽的組合。
優選地，抗原衍生自但不限于選自下述的寄生蟲：瘧原蟲屬（plasmodium）物種例如三日瘧原蟲（plasmodiummalariae）、卵形瘧原蟲（plasmodiumovale）、間日瘧原蟲（plasmodiumvivax）、惡性瘧原蟲（plasmodiumfalciparum），微小內蜒阿米巴（endolimaxnana），藍氏賈第蟲（giardialamblia），溶組織內阿米巴（entamoebahistolytica），微小隱孢子蟲（cryptosporidiumparvum），人芽囊原蟲（blastocystishominis），陰道毛滴蟲（trichomonasvaginalis），剛地弓形蟲（toxoplasmagondii），圓孢子球蟲（cyclosporacayetanensis），鼠隱孢子蟲（cryptosporidiummuris），卡氏肺囊蟲（pneumocystiscarinii），杜氏利什曼原蟲（leishmaniadonovani）、熱帶利什曼原蟲（leishmaniatropica）、巴西利什曼原蟲（leishmaniabraziliensis）、墨西哥利什曼原蟲（leishmaniamexicana），棘阿米巴屬（acanthamoeba）物種例如卡氏棘阿米巴（acanthamoebacastellanii）和卡伯特森氏棘阿米巴（a.culbertsoni），福氏耐格里原蟲（naegleriafowleri），克魯斯氏錐蟲（trypanosomacruzi）、布氏羅得西亞錐蟲（trypanosomabruceirhodesiense）、布氏岡比亞錐蟲（trypanosomabruceigambiense），貝氏等孢子球蟲（isosporabelli），結腸小袋纖毛蟲（balantidiumcoli），蛔蟲（roundworm）（似蚓蛔線蟲（ascarislumbricoides）），鉤蟲（hookworm）（美洲鉤蟲（necatoramericanus）、十二指腸鉤蟲（ancylostomaduodenal）），蟯蟲（pinworm）（蠕形住腸線蟲（enterobiusvermicularis）），蛔蟲（犬弓蛔蟲（toxocaracanis）、貓弓蛔蟲（toxocaracati）），犬心絲蟲（heartworm）（犬惡絲蟲（dirofilariaimmitis）），類圓線蟲屬（strongyloides）（糞類圓線蟲（stronglyoidesstercoralis）），毛線蟲屬（trichinella）（旋毛線蟲（trichinellaspiralis）），絲蟲屬（filaria）（班氏吳策線蟲（wuchereriabancrofti）、馬來絲蟲（brugiamalayi）、旋盤尾絲蟲（onchocercavolvulus）、羅阿絲蟲（loaloa）、鏈尾曼森線蟲（mansonellastreptocerca）、常現曼森線蟲（mansonellaperstans）、奧氏曼森線蟲（mansonellaozzardi））和異尖線蟲（anisakine）幼蟲（簡單異尖線蟲（anisakissimplex）（鯡魚蠕蟲）），擬地新線蟲屬（pseudoterranova）（海豹線蟲（phocanema）、鉆線蟲（terranova））形態種（鱈魚或海豹蠕蟲），對盲囊線蟲屬（contracaecum）物種和宮脂線蟲（hysterothylacium）（鮪蛔線蟲屬（thynnascaris）物種），鞭形鞭蟲（trichuristrichiura），牛肉絳蟲（beeftapeworm）（牛肉絳蟲（taeniasaginata）），豬肉絳蟲（porktapeworm）（豬帶絳蟲（taeniasolium）），魚絳蟲（fishtapeworm）（闊節裂頭絳蟲（diphyllobothriumlatum））和犬絳蟲（dogtapeworm）（犬復孔絳蟲（dipylidiumcaninum）），腸吸蟲（intestinalfluke）（布氏姜片吸蟲（fasciolopsisbuski）），血吸蟲（bloodfluke）（日本血吸蟲（schistosomajaponicum）、曼氏血吸蟲（schistosomamansoni）、埃及血吸蟲（schistosomahaematobium）），肝吸蟲（liverfluke）（華支睪吸蟲（clonorchissinensis）），東方肺吸蟲（orientallungfluke）（衛氏并殖吸蟲（paragonimuswestermani））和綿羊肝吸蟲（sheepliverfluke）（肝片形吸蟲（fasciolahepatica）），鮭隱孔吸蟲（nanophyetussalmincola）和希氏侏形吸蟲（n.schikhobalowi）。
在本發明的一個優選實施方案中，至少一種抗原蛋白質或肽來自選自下述的寄生蟲：瘧原蟲屬物種、利什曼原蟲屬物種和錐蟲屬物種。
本發明的至少一種抗原可以是來自惡性瘧原蟲的var2csa。在本發明的一個優選實施方案中，至少一種抗原蛋白質或肽或抗原蛋白質或肽的片段是var2csa。
家畜抗原
本發明的一個方面涉及衍生自感染家畜的疾病或因子的抗原和/或抗原序列，特別是商業上相關的動物例如豬、牛、馬、綿羊、山羊、美洲駝、兔、貂、小鼠、大鼠、犬、貓、雪貂，家禽例如雞、火雞、雉雞及其他，魚例如鮭魚、大麻哈魚、鱈魚及其他養殖物種。至少一種抗原或抗原序列可以衍生自其的疾病或其因子（agent）的例子包括但不限于：多物種疾病例如：炭疽、aujeszky氏病、藍舌病，布魯氏菌病例如：流產布魯氏菌、馬爾他布魯氏菌或豬布魯氏菌；克里米亞剛果出血熱，棘球蚴病/包蟲病，細小rna病毒科的病毒，引起口蹄疫的口蹄疫病毒屬特別是7個免疫上不同的血清型中的任何：a、o、c、sat1、sat2、sat3、asia1，或心水病，日本腦炎，鉤端螺旋體病，新大陸螺旋蠅蛆病（嗜人錐蠅（cochliomyiahominivorax）），舊大陸螺旋蠅蛆病（蛆癥金蠅（chrysomyabezziana）），副結核，q型熱，狂犬病，裂谷熱，牛疫，旋毛蟲病，土拉菌病，水皰性口腔炎或西尼羅河熱；牛疾病例如：牛邊蟲病、牛巴貝蟲病、牛生殖道彎曲桿菌病、牛海綿狀腦病、牛結核病、牛病毒性腹瀉、牛傳染性胸膜肺炎、地方流行性牛白血病、出血性敗血癥、牛傳染性鼻氣管炎/傳染性膿皰性外陰陰道炎、疙瘩皮膚病(lumpkyskindisease)、惡性卡他熱、泰勒蟲病、毛滴蟲病或錐蟲病（舌蠅傳播的）；綿羊和山羊疾病例如：山羊關節炎/腦炎、接觸傳染性無乳癥、接觸傳染性山羊胸膜肺炎、地方流行性母羊流產（綿羊衣原體病）、梅迪-維斯納病（maedi-visna）、內羅畢綿羊病、綿羊附睪炎（羊布魯氏菌）、小反芻動物瘟疫、沙門氏菌病（羊流產沙門氏菌（s.abortusovis））、羊瘙癢癥、綿羊痘和山羊痘；馬疾病例如：非洲馬瘟病、馬接觸傳染性子宮炎、馬交媾病、馬腦脊髓炎（東方）、馬腦脊髓炎（西方）、馬傳染性貧血、馬流感、馬焦蟲病、馬鼻肺炎、馬病毒性動脈炎、馬鼻疽、蘇拉病（伊氏錐蟲（trypanosomaevansi））或委內瑞拉馬腦脊髓炎；豬疾病例如：非洲豬瘟、古典豬瘟、尼帕病毒性腦炎、豬囊蟲病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬水皰病或傳染性腸胃炎；禽疾病例如：禽衣原體病、禽傳染性支氣管炎、禽傳染性喉氣管炎、禽支原體病（雞毒支原體（m.gallisepticum））、禽支原體病（滑液支原體（m.synoviae））、鴨病毒性肝炎、家禽霍亂、家禽傷寒、高致病性禽流感這是任何甲型或乙型流感病毒且特別是h5n1、傳染性法氏囊病（gumboro病）、馬立克氏病、新城疫、雞白痢或火雞鼻氣管炎；兔類動物和嚙齒類動物疾病例如：病毒性腸炎、粘液瘤病或兔出血性疾病；魚疾病例如：地方流行性造血器官壞死癥、傳染性造血器官壞死癥、鯉魚春季病毒血癥、病毒性出血性敗血癥、傳染性胰臟壞死病、傳染性鮭魚貧血、流行性潰瘍綜合征、細菌性腎病（鮭魚腎桿菌（renibacteriumsalmoninarum））、三代蟲病（gyrodactylosis）（三代蟲病（gyrodactylussalaris））、紅海鯛虹彩病毒病；或其他疾病例如駱駝痘或利什曼病。
在本發明的一個優選實施方案中，至少一種抗原蛋白質或肽來自aujeszky氏病、口蹄疫、水皰性口炎病毒、禽流感或新城疫。
本發明的另外一個優選實施方案涉及至少一種抗原蛋白質或肽或所述抗原蛋白質或肽的片段，其是與上述抗原中的任何具有至少85％同一性的抗原肽或蛋白質。氨基酸之間的同源性或同一性可以通過先前提及的blosum評分矩陣中的任何進行計算。
癌抗原
許多蛋白質/糖蛋白已得到鑒定且與特定類型的癌癥聯系；這些被稱為癌癥特異性多肽、腫瘤相關抗原或癌抗原。一般而言，可以使用發現與癌癥腫瘤相關的任何抗原。其中可以發現癌癥特異性抗原的一種方法是通過扣除分析（subtractionanalysis）例如各種微陣列分析，例如dna微陣列分析。此處，比較在健康和癌性患者之間、在癌性患者組之間、或在相同患者中的健康和癌性組織之間的基因表達模式（如由所述基因編碼的rna或蛋白質水平中可見的）。從彼此中“扣除”具有大約相等的表達水平的基因，留下在健康和癌性組織之間不同的基因/基因產物。這種方法是本領域已知的，并且可以用作鑒定新型癌抗原的方法或產生對于給定患者或患者組特異的基因表達概況。因此鑒定的抗原，單一抗原和它們可以在其中發現的組合落入本發明的范圍內。
優選地，本發明的至少一種抗原衍生自但不限于選自下述的癌癥特異性多肽：mage-3，mage-1，gp100，gp75，trp-2，酪氨酸酶，mart-1，cea，ras，p53，b-連環蛋白，gp43，gage-1，bage-1，psa，muc-1、2、3，和hsp-70，trp-1，gp100/pmel17，β-hcg，ras突變型，p53突變型，hmw黑素瘤抗原，muc-18，hoj-1，細胞周期蛋白依賴性激酶4（cdk4），半胱天冬酶8，her-2/neu，bcr-abl酪氨酸激酶，癌胚抗原（cea），端粒酶，sv40大t，人乳頭狀瘤病毒hpv6、11、16、18、31和33型；hpv衍生的病毒癌基因e5、e6、e7和l1；存活素、bcl-xl、mcl-1和rho-c。
在本發明的一個優選實施方案中，至少一種抗原蛋白質或肽或抗原蛋白質或肽的片段來自選自下述的癌癥特異性多肽：hpv衍生的病毒癌基因e5、e6、e7和l1；存活素、bcl-xl、mcl-1和rho-c。
與異常生理學應答相關的抗原
本發明的一個實施方案涉及核酸構建體，其中至少一種抗原蛋白質或肽或抗原蛋白質或肽的片段來自與異常生理學應答相關的多肽。此類異常生理學應答包括但不限于自身免疫疾病、過敏反應、癌癥和先天性疾病。其例子的非詳盡列表包括疾病例如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化、銀屑病和crohn氏病。
操作接頭（operativelinker）
本發明的一個方面涉及核酸構建體，其中在恒定鏈和抗原蛋白質或肽或抗原蛋白質或肽的片段之間的操作連接是直接連接或由間隔區介導的連接。術語操作接頭應理解為核苷酸或氨基酸殘基序列，其以保證核酸或多肽的生物加工的方式使核酸構建體或嵌合多肽的2個部分結合在一起。如果操作接頭是直接連接，那么各自編碼開放讀碼框或開放讀碼框的片段的2個核酸彼此緊鄰放置，并且從而也在框內。如果操作接頭由間隔區介導，那么一系列核苷酸分別插入編碼至少一種恒定鏈和至少一種抗原肽的核苷酸之間。具有間隔區是在本發明的范圍內的，其中間隔區僅是以保留開放讀碼框的方式使本發明的至少2種元件連接的一系列核苷酸，或間隔區可以編碼如本文下文定義的一種或多種信號或分離元件。
在一個特定實施方案中，本發明包括操作接頭，其中操作接頭是間隔區。
在一個實施方案中，本發明包括編碼關于mhcii類分子的至少一個輔助表位的間隔區。輔助表位的例子是免疫原決定簇例如白喉毒素。特別地白喉毒素b片段cooh-末端區域已顯示在小鼠中是免疫原性的。此外，hsp70部分或整體、以及其他免疫原性肽例如流感病毒、或具有錨定至hlai類和ii類分子的錨定基序的免疫原性序列或肽也可以在核酸構建體的間隔區中編碼。
在另一個實施方案中，核酸構建體的間隔區編碼至少一個蛋白酶切割位點。溶酶體蛋白酶例如組織蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和鋅蛋白酶以及其他細胞內蛋白酶的切割位點落入本發明的范圍內。
在另外一個實施方案中，核酸構建體的操作接頭可以包括至少一個sirna或mirna編碼序列。sirna（小干擾rna）和mirna（微小rna）以序列特異性方式靶向內源rna用于降解。因此可以選擇在本發明的核酸構建體內編碼的sirna或mirna，以靶向不希望有的基因產物。
在另一個實施方案中，操作接頭包括至少一個多聚接頭或多克隆位點（mcs）。多聚接頭和mcs是包括限制酶識別序列的核苷酸系列，即其中限制酶以平端或交錯方式切割dna的位點，促進dna的其他片段/序列亞克隆到核酸構建體內。多聚接頭/mcs的識別序列一般是獨特的，意味著它們在核酸構建體的其他地方未發現。操作接頭可以另外包括一個或多個終止或末端密碼子，其發出新生多肽從核糖體釋放的信號。操作接頭還可以包括至少一個ires（內部核糖體進入位點）和/或至少一個啟動子。ires是允許在信使rna（mrna）序列中間起始翻譯的核苷酸序列，作為蛋白質合成的更大過程的部分。啟動子是使得基因能夠被轉錄的dna序列。啟動子由rna聚合酶識別，這隨后起始轉錄，參見下文。啟動子可以是單向或雙向的。
在一個實施方案中，跨越在恒定鏈和至少一種抗原之間的區域的操作接頭是這樣的操作接頭，其包括至少一個多聚接頭和至少一個啟動子以及還任選地至少一個ires。這些元件可以以任何次序放置。在一個進一步優選的實施方案中，恒定鏈的終止密碼子已被缺失，并且多聚接頭已以保存開放讀碼框的方式克隆到載體內，允許插入多聚接頭內的至少一種抗原的框內閱讀。這具有促進多種抗原在一個步驟或多個克隆步驟中亞克隆到相同構建體內，并且允許多種抗原在與恒定鏈相同的框內同時表達的優點。終止密碼子可以在多聚接頭后插入用于翻譯終止。這個實施方案可以與上述輔助表位中的任何、mi/sirna或本文描述的其他元件中的任何進行組合。
本發明的一個實施方案涉及操作接頭相關于至少一種恒定鏈和至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的片段的放置，其中至少一種抗原肽編碼序列放置在：恒定鏈序列內、恒定鏈序列的前端、恒定鏈序列的末端部分。這以確保構建體的開放讀碼框的可讀性的方式完成，從而使得至少一個操作接頭在抗原肽之前、周圍或之后。
本發明的另一個實施方案進一步涉及操作接頭相關于至少一種恒定鏈和至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的片段的放置，其中至少一種抗原肽編碼序列優選放置在恒定鏈的末端部分，并且操作接頭插入兩者之間；末端部分是恒定鏈或其片段的第一個或最后一個殘基。
在另一個實施方案中，核酸構建體不包括操作接頭；相反，至少一種抗原肽編碼序列與恒定鏈直接栓系（tethered）。至少一種抗原肽編碼序列可以放置在：恒定鏈序列內、恒定鏈序列的前端、恒定鏈序列的末端部分。這以確保構建體的開放讀碼框的可讀性的方式完成。
存在關于包括或排除操作接頭的2種可能性的優點；在一個實施方案中，排除接頭可以減少引發針對所述接頭的免疫應答而不是引發針對抗原肽的免疫的可能性。
組合
核酸構建體編碼多個元件是在本發明的范圍內的。元件是至少一種恒定鏈或其變體和至少一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的片段。因此具有多個恒定鏈或其變體落入本發明的范圍內，這些各自彼此可操作地連接且與多個抗原蛋白質或肽或抗原蛋白質或肽的片段可操作地連接。核酸構建體的元件因此必須彼此是可操作地連接的。各自與一種抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的片段可操作地連接的幾個系列的恒定鏈或其變體（這些系列各自彼此可操作地連接）包含在本發明內。
本發明的優點和非常重要的方面涉及下述事實：可以起始任何類型的免疫應答例如t細胞介導和抗體介導的應答，二者可以用已知是弱抗原的表位、未知抗原性質的多肽和同時多個表位/抗原來起始。
因此，也在本發明的范圍內的是一個優選實施方案是核酸構建體，所述核酸構建體編碼與多個抗原蛋白質或肽或蛋白質或肽的片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體，例如2、3、4、5、6、8、10、12種或更多種抗原蛋白質或肽或蛋白質或肽的片段。
核酸構建體可以包括另外元件。這些包括但不限于：內部核糖體進入位點（ires）；編碼涉及抗原呈遞的蛋白質的基因，所述蛋白質例如lamp、鈣網織蛋白、hsp33、hsp60、hsp70、hsp90、hsp100、shsp（小熱休克蛋白）和熱休克結合蛋白例如77-殘基dnaj-同源hsp73-結合結構域；編碼涉及細胞內散布（spreading）的蛋白質的基因，所述蛋白質例如vp22、hivtat、cx43或其他連接蛋白和細胞內縫隙連接組成成分；編碼天然殺傷細胞（nk細胞）活化分子例如h60和細胞因子、雞卵白蛋白或任何t輔助細胞表位的基因。
在本發明的一個優選實施方案中，核酸構建體包括編碼涉及抗原呈遞的蛋白質的至少一種基因，所述蛋白質例如lamp、limp、鈣網織蛋白hsp33、hsp60、hsp70、hsp90、hsp100、shsp（小熱休克蛋白）或77-殘基dnaj-同源hsp73-結合結構域。
在本發明的另外一個優選實施方案中，核酸構建體包括編碼涉及細胞內散布的蛋白質的至少一種基因，所述蛋白質例如vp22、cx43、hivtat、其他連接蛋白和細胞內縫隙連接組成成分。
啟動子
術語啟動子將在此處用于指一組轉錄控制模塊，其在rna聚合酶ii的起始位點周圍成簇。關于啟動子被如何組織的許多想法衍生自幾種病毒啟動子的分析，包括關于hsv胸苷激酶（tk）和sv40早期轉錄單位的啟動子。由更近期工作加強的這些研究已顯示啟動子由不連續功能模塊組成，各自由約7-20bpdna組成，并且包含轉錄激活蛋白質的一個或多個識別位點。每個啟動子中的至少一個模塊作用于rna合成的起始位點的定位。這點的最佳已知例子是tata盒，但在缺乏tata盒的某些啟動子中，例如哺乳動物末端脫氧核苷酰轉移酶基因的啟動子和sv40晚期基因的啟動子，重疊自身起始位點的不連續元件幫助固定起始位置。
另外的啟動子元件調節轉錄起始頻率。一般地，這些位于起始位點上游30-110bp的區域中，盡管許多啟動子近期已顯示也包含起始位點下游的功能元件。元件之間的間距是彈性的，從而使得當元件倒轉或相對于彼此移動時，啟動子功能被保存。在tk啟動子中，在活性開始下降前元件之間的間距可以增至相隔50bp。依賴于啟動子，看起來個別元件可以共同或獨立地作用，以激活轉錄。可以引導由核酸構建體編碼的序列的轉錄起始的任何啟動子可以在本發明中使用。
本發明的一個方面包括核酸構建體，其中使得構建體能夠表達的啟動子在至少一種可操作地連接的恒定鏈和抗原蛋白質或肽編碼序列前。
進一步方面的是啟動子選自組成型啟動子、誘導型啟動子、生物特異性啟動子、組織特異性啟動子、細胞類型特異性啟動子和炎癥特異性啟動子。
啟動子的例子包括但不限于：組成型啟動子例如：猴病毒40（sv40）早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、人免疫缺陷病毒長末端重復啟動子、莫洛尼病毒啟動子、禽白血病病毒啟動子、eb病毒即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒（rsv）啟動子、人肌動蛋白啟動子、人肌球蛋白啟動子、人血紅蛋白啟動子、巨細胞病毒（cmv）啟動子和人肌肉肌酸啟動子，誘導型啟動子例如：金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子和四環素啟動子（tet開或tet關），組織特異性啟動子例如：her-2啟動子和psa相關啟動子和雙向啟動子，其能夠起始從啟動子任一方向的轉錄。
使用誘導型啟動子的優點包括提供可以隨意激活的“休眠”核酸構建體的選項。如果免疫應答的引發優選僅在體內局部與全身性（例如在涉及癌癥的情況下）比較誘導，或免疫應答的引發在施用時對于接受者的健康是有害的，這可以是有用的。
在一個優選實施方案中，核酸構建體包括選自下述的啟動子：cmv啟動子、sv40啟動子和rsv啟動子。
遞送媒介物
本發明的一個方面包括如包括在遞送媒介物中的在上文任何中描述的核酸構建體。遞送媒介物是由此核苷酸序列或多肽或兩者可以從至少一種介質轉運到另一種介質的實體。遞送媒介物一般用于表達在核酸構建體內編碼的序列和/或用于構建體或其中編碼的多肽的細胞內遞送。
核酸構建體可以在體內或先體外后體內轉移到細胞內；后者通過從患者中取出靶組織（即肝細胞或白血細胞），在體外轉移構建體，并且隨后將轉導細胞重新植入患者內來進行。
非病毒遞送的方法包括物理（無載體遞送）和化學方法（基于合成載體的遞送）。
物理方法包括針注射、基因槍、射流注射、電穿孔、超聲和水動力遞送，采用滲透細胞膜且促進細胞內基因轉移的物理力。所述物理力可以是電或機械的。
化學方法使用合成或天然存在的化合物作為載體，以將轉基因遞送到細胞內。用于非病毒基因遞送的最頻繁研究的策略是通過使用陽離子脂質或陽離子聚合物將dna配制成濃縮顆粒。含dna的顆粒隨后經由以細胞內囊泡形式的胞吞作用、巨胞飲作用或吞噬作用被細胞吸收，dna的小部分從細胞內囊泡中釋放到細胞質內并移動到核內，在其中發生轉基因表達。
在本發明的范圍內的是遞送媒介物是選自下述的媒介物：基于rna的媒介物、基于dna的媒介物/載體、基于脂質的媒介物、基于聚合物的媒介物和病毒衍生的dna或rna媒介物。
本發明的一個優選實施方案涉及通過機械或電技術遞送核酸構建體。
?物理
○注射：一個優選實施方案涉及在溶液中的核酸構建體的簡單注射。注射通常用遞送至細胞外空間的核酸構建體在骨骼肌中肌內（im）、皮內（id）或對于肝進行。通過注射的遞送可以通過下述得到輔助：電穿孔；使用鹽水或蔗糖的高滲溶液；用肌毒素例如布比卡因暫時損害肌纖維；或加入能夠增強dna被靶細胞內在化效率的物質，例如轉鐵蛋白、與水不混溶的溶劑、非離子聚合物、表面活性劑或核酸酶抑制劑。
○基因槍：基因槍或biolistic粒子遞送系統是用于將遺傳信息注射細胞的裝置。有效負荷（payload）是用例如質粒dna包被的重金屬例如金、銀或鎢的元素粒子。這種技術通常簡稱為biolistics。壓縮氦可以用作推進劑。特別地在金顆粒例如膠體金顆粒上的核酸構建體涂層是一個有利的實施方案。
○氣動（射流）注射：不需要顆粒，水性溶液。
○電穿孔或電滲透作用是由外部應用的電場引起的細胞質膜的導電性和滲透性的顯著增加。
○超聲促進的基因轉移：超聲產生膜孔，并且促進通過dna被動擴散跨越膜孔的細胞內基因轉移。效率可以通過使用造影劑或使得膜更具有流動性的條件得到增強。
○水動力基因遞送：水動力基因遞送是將裸露質粒dna引入在高度充滿（perfused）的內臟（例如肝）的細胞內的簡單方法。在嚙齒類動物中，大量dna溶液的快速尾靜脈注射引起注射溶液在下腔靜脈的暫時溢流，這超過心輸出量。因此，注射誘導dna溶液逆流到肝內的流動、肝內壓力的快速升高、肝擴大和肝窗的可逆破裂。
?化學
○陽離子脂質介導的基因遞送：盡管某些陽離子脂質單獨顯示出良好的轉染活性，但它們通常用不荷電磷脂或膽固醇作為輔助脂質進行配制，以形成脂質體。在與陽離子脂質體混合后，使質粒dna濃縮成稱為lipoplex的準穩定顆粒。lipoplex中的dna被充分保護免于核酸酶降解。lipoplex能夠觸發細胞攝取，并且促進在到達破壞性溶酶體區室前使dna從細胞內囊泡中釋放。
○陽離子聚合物介導的基因遞送：大多數陽離子聚合物都具有使dna濃縮成為小顆粒并且通過與細胞表面上陰離子位點的電荷-電荷相互作用促進經由胞吞作用的細胞攝取的功能。陽離子聚合物dna載體包括聚乙烯亞胺（pei）、聚乙二胺和聚丙胺樹狀聚體（dendrimers）、聚烯丙胺、陽離子右旋糖酐、殼聚糖、陽離子蛋白質（聚賴氨酸、魚精蛋白和組蛋白）和陽離子肽。
○脂質-聚合物雜交系統：用聚陽離子預濃縮dna，隨后用陽離子脂質體、陰離子脂質體或兩親性聚合物連同或不連同輔助脂質包被。
化學遞送媒介物的例子包括但不限于：生物可降解聚合物微球體、基于脂質的制劑例如脂質體載體、陽離子荷電分子例如脂質體、鈣鹽或樹狀聚體、脂多糖、多肽和多糖。
可選的物理遞送方法可以包括裸露核酸構建體在粘膜表面例如鼻和肺粘膜上的氣溶膠滴注；核酸構建體向眼和粘膜組織的局部施用；和水合作用例如通過其鹽水溶液受力進入眼的角膜基質內的基質水合。
本發明的另一個實施方案包括載體，其在本文中指示病毒載體（即非病毒），作為遞送媒介物。根據本發明的病毒載體由修飾的病毒基因組制成，即形成病毒基因組的實際dna或rna，并且以裸露形式引入。因此，在由病毒或非病毒蛋白質制成的病毒基因組周圍的任何包被結構不是根據本發明的病毒載體的部分。
病毒載體由其衍生的病毒選自下述非詳盡組：腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、泡沫病毒、巨細胞病毒、塞姆利基森林病毒、痘病毒、rna病毒載體和dna病毒載體。此類病毒載體是本領域眾所周知的。
重組細胞
本發明的一個方面涉及包括如在上文中的任何中定義的核酸構建體的細胞。此類重組細胞可以用作體外研究的工具，用作核酸構建體的遞送媒介物或用作基因療法方案的一部分。根據本發明的核酸構建體可以通過本領域眾所周知的技術引入細胞內，并且所述技術包括dna顯微注射到細胞的核內、轉染、電穿孔、脂轉染/脂質體融合和粒子轟擊。合適的細胞包括自體和非自體細胞，并且可以包括異種細胞。
在一個優選實施方案中，本發明的核酸構建體包括在抗原呈遞細胞（apc）內。在其表面上呈遞與mhc分子結合的抗原的任何細胞被視為抗原呈遞細胞。此類細胞包括但不限于巨噬細胞、樹突細胞、b細胞、雜合apc和養育（foster）apc。制備雜合apc的方法是本領域眾所周知的。
在一個更優選的實施方案中，apc是專職抗原呈遞細胞，并且最優選apc是mhc-i和/或mhc-ii表達細胞。
根據上文中的任何的apc可以是得自患者的干細胞。在引入本發明的核酸構建體后，干細胞可以以治療具有醫學狀況的患者的意圖重新引入患者內。優選地，從患者中分離的細胞是能夠分化成抗原呈遞細胞的干細胞。
在本發明的范圍內另外包括的是包括本發明的核酸構建體的抗原呈遞細胞不表達任何共刺激信號，并且抗原蛋白質或肽或所述蛋白質或肽的抗原片段是自身抗原。
嵌合蛋白質和抗體
本發明的一個目的是由如本文上文描述的核酸構建體編碼的嵌合蛋白質，包括至少一種可操作地連接的恒定鏈或其變體和至少一種抗原蛋白質或肽或所述抗原蛋白質或肽的片段。嵌合蛋白質應理解為由核苷酸序列編碼的遺傳改造蛋白質，所述核苷酸序列通過將2種或更多種完全或部分基因或一系列（非）隨機核酸剪接在一起制備。
本發明的一個方面涉及可以識別如本文上文定義的嵌合蛋白質的抗體。術語抗體應理解為免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗體是例如完整免疫球蛋白分子或其保留免疫學活性的片段。此類抗體可以用于動物的被動免疫接種，或用于在用于檢測抗體與之結合的蛋白質的測定中。
核酸構建體組合物
本發明的一個方面涉及包括核酸序列的組合物，所述核酸序列編碼與至少一種抗原蛋白質或肽或所述抗原蛋白質或肽的片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體。組合物因此可以包括如上文中的任何中定義的核酸構建體。組合物可以另外用作藥物。
根據本發明的核酸構建體組合物可以根據已知方法進行配制，例如通過一種或多種藥學上可接受的載體也稱為賦形劑或穩定劑與活性劑的混合。這些賦形劑對于施用于任何個體/動物，優選脊椎動物且更優選人可以是可接受的，因為它們在采用的劑量和濃度下對暴露于其的細胞或個體是無毒的。通常生理學上可接受的載體是ph緩沖水溶液。此類賦形劑、載體和配制方法的例子可以例如在remington'spharmaceuticalsciences（maackpublishingco，easton，pa）中找到。生理學上可接受的載體的例子包括但不限于：緩沖液例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量（小于約10個殘基）多肽；蛋白質例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如edta；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如tweentm、聚乙二醇（peg）和pluronicstm。
為了配制適合于有效施用的藥學上可接受的組合物，此類組合物根據本發明將包含有效量的核酸構建體，所述核酸構建體被包括在遞送媒介物內或嵌合蛋白質在如本文描述的核酸構建體內編碼。通常，如果用如由本發明的核酸構建體編碼的蛋白質或多肽引發免疫應答，那么通過使蛋白質或肽與之偶聯且因此幫助誘導免疫應答，載體將用作支架。載體蛋白質可以是任何常規載體，包括適合于呈遞免疫原決定簇的任何蛋白質。合適載體一般是大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質聚集體（例如油小滴或脂質體）和非活性病毒顆粒。此類載體是本領域普通技術人員眾所周知的。此外，這些載體可以充當免疫刺激劑（“佐劑”）。動物的免疫接種可以用佐劑和/或藥物載體執行。常規載體蛋白質包括但不限于鑰孔血藍蛋白，血清蛋白質例如轉鐵蛋白、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，卵白蛋白，免疫球蛋白或激素例如胰島素。載體可以連同佐劑或獨立于其存在。
在下文中，核酸構建體組合物或組合物意指包含對于預防和治療用途包括刺激患者中的免疫應答有用的組合物。進一步考慮本發明的組合物不包括任何全身或局部毒性反應或任何其他副作用。
在一個優選實施方案中，如本文使用的，短語‘組合物’指用于引發免疫應答的組合物。
在一個優選實施方案中，核酸構建體是包裝的。用于核酸構建體的包裝裝置（means）包括選自但不限于下述的裝置：基于rna的或基于dna載體、基于脂質的載體、病毒表達載體、病毒遞送載體、膠體金顆粒和生物可降解聚合物微球體的包被。先前提及的遞送裝置中的任何因此可以用于在組合物中使用的包裝目的。
在一個實施方案中，核酸構建體的包裝方法是選自但不限于下述的病毒表達載體：腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒和dna病毒載體。病毒載體可以是復制缺陷型或條件復制缺陷型病毒載體。
本發明的一個方面涉及包括至少2種載體的組合物。這包含如所述的任何1種或2種不同核酸構建體可以包裝到至少2種載體內，這些載體是如上文中的任何中所述的類型。本發明另外涉及包括3、4、5或6種載體的組合物。再次，這些載體可以彼此不同或相同，并且可以攜帶如本文上文描述的等同或不同核酸構建體。本發明的一個進一步方面涉及組合物，其包括如由本文描述的核酸構建體中的任何編碼的至少一種嵌合蛋白質。當嵌合蛋白質或多肽待用作免疫原時，它可以通過在重組細胞中表達任何一種或多種上述核酸構建體產生，或它可以通過本領域已知的方法通過化學合成制備。如上文中所述，此類嵌合蛋白質和/或肽可以與載體偶聯，以增加對于蛋白質/肽的免疫應答，并且可以連同或不連同佐劑和/或賦形劑一起施用。
在一個實施方案中，本發明涉及如本文描述的核酸構建體用于產生組合物的用途。
增強免疫應答：常規佐劑
佐劑可以包括在組合物中以增強特異性免疫應答。因此，特別重要的是鑒定這樣的佐劑，當與一種或多種抗原/核酸構建體和/或遞送媒介物（其中任何也可以被稱為免疫原決定簇）組合時，其導致能夠誘導強特異性免疫應答的組合物。免疫原決定簇還可以在免疫接種前與2種或更多種不同佐劑混合。組合物在呈現的正文中還被稱為免疫原性組合物。
大量佐劑已得到描述并且用于在實驗室動物例如小鼠、大鼠和兔中生成抗體。在此類設置中，副作用的耐受相當高，因為主要目標是獲得強抗體應答。對于用途和對于批準用于在藥物中使用，且特別對于在人中使用，要求組合物的組分包括佐劑是充分表征的。進一步要求組合物具有任何不良反應的最低限度危險，例如肉芽腫、膿腫或發熱。
本發明的一個實施方案涉及包括佐劑的組合物。在一個優選實施方案中，組合物適合于施用于哺乳動物例如人類。因此，優選佐劑適合于施用于哺乳動物，并且最優選地適合于施用于人類。
在另一個優選實施方案中，組合物適合于施用于鳥或魚，并且最優選雞（家雞）。因此，優選佐劑適合于施用于鳥或魚。
佐劑的選擇可以進一步通過其刺激希望的免疫應答類型b細胞和/或t細胞激活的能力進行選擇，并且組合物可以配制為最優化對相關淋巴組織的分布和呈遞。
關于本發明的佐劑可以根據其起源進行分組，其為礦物質、細菌、植物、合成的或宿主產物。在這個分類法下的第一個組是礦物質佐劑，例如鋁化合物。與鋁鹽沉淀的抗原或與預形成的鋁鹽或化合物混合或吸附的抗原已廣泛用于增強動物和人中的免疫應答。鋁顆粒已在免疫接種后7天在兔的局部淋巴結中得到證實，并且可能另一種顯著功能是將抗原導向在結自身中的含t細胞區域。佐劑效力已顯示與引流淋巴結的暗示相關。雖然許多研究已證實與鋁鹽一起施用的抗原導致增加的體液免疫，細胞介導的免疫看起來僅是輕微增加的，如通過遲發型超敏反應測量的。氫氧化鋁已描述為激活補體途徑。這種機制可以在局部炎癥應答以及免疫球蛋白生產和b細胞記憶中起作用。此外，氫氧化鋁可以保護抗原不受快速分解代謝。主要由于其極佳的安全記錄，鋁化合物是目前在人中使用的唯一佐劑。
另一大組佐劑是細菌起源的那些。具有細菌起源的佐劑可以進行純化且合成（例如胞壁酰二肽、脂質a），并且宿主介質已得到克隆（白介素1和2）。最近十年已在細菌起源活性組分的幾種佐劑的化學純化中獲得顯著進展：百日咳博德特氏菌、結核分枝桿菌、脂多糖、弗氏完全佐劑（fca）和弗氏不完全佐劑（difcolaboratories，detroit，mich.）和merckadjuvant65（merck和company，inc.，rahway，n.j.）。另外，依照本發明的合適佐劑是例如titermaxclassical佐劑（sigma-aldrich）、iscoms、quila、alun，參見us58767和5,554,372，脂質a衍生物、霍亂毒素衍生物、hsp衍生物、lps衍生物、合成肽基質、gmdp及其他以及與免疫刺激劑組合（us5,876,735）。百日咳博德特氏菌在本發明的背景中作為佐劑是有利的，由于其通過對t淋巴細胞群體的作用調節細胞介導的免疫的能力。對于脂多糖和弗氏完全佐劑，佐劑活性部分已得到鑒定且合成，這允許研究結構-功能關系。這些還考慮用于包括在根據本發明的免疫原性組合物中。
已發現脂多糖（lps）及其各種衍生物包括脂質a與脂質體或其他脂質乳劑組合是有力佐劑。仍未確定是否可以產生用于在人中的一般使用的具有足夠低毒性的衍生物。弗氏完全佐劑是大多數實驗研究中的標準。
礦物油可以加入免疫原性組合物中，以便保護抗原不受快速分解代謝。
許多其他類型的材料可以用作根據本發明的免疫原性組合物中的佐劑。這些包括植物產物例如皂苷、動物產物例如殼多糖和眾多合成化學制品。
根據本發明的佐劑還可以通過其提議的作用機制進行分類。這類分類法必定是略微任意的，因為大多數佐劑看起來通過超過一種機制起作用。佐劑可以通過抗原定位和遞送，或通過對構成免疫系統的細胞例如巨噬細胞和淋巴細胞的直接作用起作用。根據本發明的佐劑通過其增強免疫應答的另一種機制是通過抗原沉積物的產生。這看起來促成鋁化合物、油乳劑、脂質體和合成聚合物的佐劑活性。脂多糖和胞壁酰二肽的佐劑活性看起來主要通過巨噬細胞的激活介導，而百日咳博德特氏菌影響巨噬細胞和淋巴細胞。當摻入根據本發明的免疫原性組合物內可以是有用的佐劑的進一步例子在us5,554,372中描述。
在根據本發明的組合物中有用的佐劑因此可以是礦物鹽，例如氫氧化鋁和磷酸鋁或鈣凝膠、油乳劑和基于表面活性劑的制劑例如mf59（微流體化去污劑穩定的水包油乳劑）、qs21（純化皂苷）、as02（sbas2、水包油乳劑+單磷酰脂質a（mpl）+qs21）、montanideisa51和isa-720（穩定的油包水乳劑）、佐劑65（包含花生油、二縮甘露醇一油酸和單硬脂酸鋁）、ribiimmunochemresearchinc.，hamilton，utah）、微粒佐劑例如病毒體（摻入流感血凝素的單層脂質體小泡（原文為cehicles，疑為vehicles））、as04（含mpl的al鹽）、iscoms（皂苷和脂質（例如膽固醇）的結構復合物、聚丙交酯共乙交酯（plg）、微生物衍生物（天然和合成）例如單磷酰脂質a（mpl）、detox（mpl+草分支桿菌（m.phlei）細胞壁支架）、agp（rc-529（合成乙酰化單糖））、dc_chol（能夠自組構成脂質體的類脂免疫刺激劑）、om-174（脂質a衍生物）、cpg基序（包含免疫刺激cpg基序的合成寡核苷酸）、修飾細菌毒素、具有無毒佐劑效應的lt和ct、內源人免疫調節劑例如hgm-csf或hil-12或immudaptin（c3d串聯排列）、惰性媒介物例如金顆粒。
佐劑的另外例子包括：免疫刺激油乳劑（例如，油包水、水包油、水包油包水例如弗氏不完全佐劑例如montainde?，specol，礦物鹽例如al（oh）3、alpo4，微生物產物，皂苷例如quala，合成產物以及佐劑佐劑，和免疫刺激復合物（iscom）和細胞因子，熱滅活細菌/組分，納米珠，lps，lta。其他常用佐劑的列表公開于wo2003/089471中的第6-8頁上，所述列表在此引入作為參考。
根據本發明的免疫原性組合物還可以包含稀釋劑例如緩沖劑，抗氧化劑例如抗壞血酸，低分子量（小于約10個殘基）多肽，蛋白質，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合劑例如edta，谷胱甘肽及其他穩定劑和賦形劑。中性緩沖鹽水或與非特異性血清白蛋白混合的鹽水是示例性合適稀釋劑。
佐劑一般以根據制造商的說明書的量包括在免疫原性組合物中。
增強免疫應答：非常規佐劑
細胞因子調節
對于有效的疫苗，它必須誘導對于給定病原體的合適免疫應答。這可以通過修飾表達的抗原形式（即細胞內與分泌的比較）、遞送方法和途徑和遞送的dna劑量來完成。然而，它還可以通過共施用編碼免疫調節分子例如細胞因子、淋巴因子或共刺激分子的質粒dna（pdna）來完成。這些“遺傳佐劑”可以連同如本文概述的‘常規佐劑’或‘其他免疫刺激佐劑’中的任何以許多方式施用：
?作為2種分開質粒的混合物，一種編碼免疫原和另一種編碼細胞因子；
?作為通過間隔區分開的單一的雙或多順反子載體；或
?作為質粒編碼的嵌合體或融合蛋白；或
?以其天然形式，即蛋白質或核苷酸。
一般而言，促炎因子（例如各種白介素、腫瘤壞死因子和gm-csf）加上th2誘導細胞因子的共施用增加抗體應答，而促炎因子和th1誘導細胞因子降低體液應答且增加細胞毒性應答（這例如在病毒保護中更重要）。有時還使用共刺激分子如b7-1、b7-2和cd40l。
這個概念已成功地應用于編碼il-10的pdna的局部施用。編碼b7-1（在apc上的配體）的質粒在抗腫瘤模型中已成功地增強免疫應答，并且使編碼gm-csf和約氏瘧原蟲（p.yoelii）的環子孢子蛋白（pycsp）的質粒混合已增強針對后續攻擊的保護（而單獨的編碼pycsp的質粒則不是）。gm-csf可以促使樹突細胞更有效地呈遞抗原，且增強il-2產生和th細胞激活，從而驅動增加的免疫應答。這可以通過首先用ppycsp和pgm-csf混合物引發，且以后用表達pycsp的重組痘病毒加強得到進一步增強。然而，與通過單獨的ppcmsp1-hbs遞送獲得的保護比較，編碼gm-csf（或ifn-γ、或il-2）和夏氏瘧原蟲（p.chabaudi）裂殖子表面蛋白質1（c末端）-乙型肝炎病毒表面蛋白質（pcmsp1-hbs）的融合蛋白的質粒的共注射實際上消除了針對攻擊的保護。
其他免疫刺激佐劑
在一個實施方案中，下述中的任何可以用作關于根據本發明的核酸構建體或組合物的免疫刺激佐劑：
lps（脂多糖），poly-ic（多聚肌醇胞嘧啶）或任何其他佐劑，其類似于雙鏈rna、ll37、rig-1解螺旋酶、il-12、il-18、ccl-1、ccl-5、ccl-19、ccl-21、gm-csf、cx3cl、cd86、pd-1、分泌pd-1、il10-r、分泌il10-r、il21、icosl、41bbl、cd40l，以及刺激免疫應答的其他任何蛋白質或核酸序列。
在一個實施方案中，使免疫刺激佐劑與腺病毒纖維蛋白質融合。例如，cx3cl可以與腺病毒纖維蛋白質融合。
免疫刺激cpg基序
質粒dna自身看起來對免疫系統具有佐劑作用。質粒dna已衍生自這樣的細菌，發現所述細菌觸發先天性免疫防御機制，激活樹突細胞和產生th1細胞因子。這是由于識別具有免疫刺激的的特定cpg二核苷酸序列。cpg刺激（cpg-s）序列在細菌衍生的dna中的出現頻率為真核生物中的20倍。這是因為真核生物顯示“cpg抑制”-即cpg二核苷酸對以比預期的低得多的頻率出現。另外，cpg-s序列是低甲基化的。這在細菌dna中頻繁出現，而在真核生物中出現的cpg基序在胞嘧啶核苷酸上都是甲基化的。相比之下，抑制免疫應答激活的核苷酸序列（命名為cpg中和，或cpg-n）在真核生物基因組中是過度出現的。最佳免疫刺激序列已發現是未甲基化的cpg二核苷酸，其側面為2個5'嘌呤和2個3'嘧啶。此外，在這個免疫刺激六聚體外的側面區域任選是富含鳥嘌呤的，以確保結合且攝取到靶細胞內。
先天性免疫系統與適應性免疫系統協同作用，以設定針對dna編碼蛋白質的應答。cpg-s序列誘導多克隆b細胞激活以及細胞因子表達和分泌的上調。受刺激的巨噬細胞分泌il-12、il-18、tnf-α、ifn-α、ifn-β和ifn-γ，受刺激的b細胞分泌il-6和一些il-12。在dna疫苗的質粒骨架中cpg-s和cpg-n序列的操縱可以確保對于編碼抗原的免疫應答的成功，并且驅動針對th1表型的免疫應答。如果病原體要求th應答用于保護，那么這是有用的。cpg-s序列也已用作外部佐劑，用于具有可變成功率的dna和重組蛋白質疫苗接種。具有低甲基化的cpg基序的其他生物也已證實多克隆b細胞擴增的刺激。然而，在這背后的機制可以比簡單甲基化更復雜–未發現低甲基化的鼠類dna設定免疫應答。
dna的配制
dna免疫接種的效率可以通過針對降解穩定dna且增加dna遞送到抗原呈遞細胞內的效率得到改善。這可以通過用dna包被生物可降解的陽離子微粒（例如用十六烷基三甲基溴化銨配制的聚（丙交酯共乙交酯））來達到。此類dna包被微粒在產生ctl方面可以與重組痘苗病毒一樣有效，特別是當與鋁混合時。直徑300nm的顆粒看起來對于通過抗原呈遞細胞攝取是最有效的。
施用
根據本發明的核酸構建體和組合物可以以治療有效量施用于個體。有效量可以根據各種因素例如個體的狀況、重量、性別和年齡而改變。其他因素包括施用方式。
在一個實施方案中，根據本發明的核酸構建體可以以dna、rna、lna、pna、ina、tina、hna、ana、cna、cena、gna、tna、缺口-聚體、混合-聚體（mix-mers）、嗎啉代類物質或其任何組合的形式遞送給受試者。
在一個實施方案中，根據本發明的核酸構建體可以以dna的形式遞送給受試者。
在另一個實施方案中，根據本發明的核酸構建體可以以rna的形式遞送給受試者。因此，核酸構建體可以在施用前轉錄成rna。
在另外一個實施方案中，根據本發明的核酸構建體可以以蛋白質的形式遞送給受試者。因此，核酸構建體可以在施用前翻譯成蛋白質。
在其中根據本發明的核酸構建體以蛋白質的形式遞送給受試者的實施方案中，蛋白質可以已進行修飾，以增加穩定作用和/或最優化進入細胞內的遞送。蛋白質可以具有增加的穩定性，原因在于二硫鍵的存在（例如us5,102,985用過氧化氫處理以還原形式的蛋白質溶液，以90-96％得率生成具有分子內二硫橋的蛋白質）、極性殘基中的增加、表面電荷最優化、表面鹽橋、封裝（例如用中孔硅酸鹽），或蛋白質可以與熱休克蛋白（例如hsp-60、hsp-70、hsp-90、hsp-20、hsp-27、hsp-84及其他）、hivtat易位結構域、腺病毒纖維蛋白質或任何其他蛋白質或結構域連接。
藥物或獸醫學組合物可以通過各種途徑提供給個體，例如皮下（sc或s.c.）、局部、經口和肌內（im或i.m.）。藥物組合物的施用經口或腸胃外實現。腸胃外遞送的方法包括局部、動脈內（直接對于組織）、肌內、大腦內（ic或i.c.）、皮下、髓內、鞘內、心室內、靜脈內（iv或i.v.）、腹膜內或鼻內施用。本發明還具有提供用于在用組合物引發免疫應答的方法中使用的合適局部、經口、全身和腸胃外藥物制劑的目的。
例如，組合物可以在此類經口劑型中施用，例如片劑、膠囊（各自包括限時釋放和持續釋放制劑）、丸劑、粉劑、顆粒劑、酏劑、酊劑、溶液、懸浮液、糖漿劑和乳狀劑，或通過注射。同樣地，它們還可以以靜脈內（彈丸和輸注）、腹膜內、皮下、局部連同或不連同阻塞、或肌內形式施用，全部使用藥學領域普通技術人員眾所周知的形式。可以采用包括本文所述化合物中的任何的有效但無毒量的組合物。還包含其是本領域已知適合于配制可注射免疫原性肽組合物的任何和所有常規劑型，例如凍干形式和溶液、懸浮液或乳劑形式，需要時，其包含常規藥學上可接受的載體、稀釋劑、防腐劑、佐劑、緩沖組分等。
在一個實施方案中，用于引發和/或后續加強疫苗的組合物作為緩慢或持續釋放制劑給予。
根據本發明的核酸構建體或組合物的優選施用方式包括但不限于全身施用，例如靜脈內或皮下施用、真皮內施用、肌內施用、鼻內施用、經口施用、直腸施用、陰道施用、肺施用和一般地任何形式的粘膜施用。此外，在本發明中包括用于在本文中提及的任何施用形式的方法在本發明的范圍內。
根據本發明的核酸構建體或組合物可以施用一次，或任何次數例如2、3、4或5次。
在一個優選實施方案中，核酸構建體或組合物施用一次，隨后為合適疫苗的施用。
在另一個優選實施方案中，核酸構建體或組合物在施用疫苗前作為一系列施用進行施用。此類系列可以包括每天、每第二天、每第三天、每第四天、每第五天、每第六天、每周、每兩周或每第三周施用核酸構建體或組合物，總共1、2、3、4或5次。
在一個實施方案中，在首先施用核酸構建體或組合物用于引發免疫應答和其次施用疫苗用于加強之間的時間段是相隔至少1天、例如相隔至少2天、例如相隔3天、例如相隔至少4天、例如相隔5天、例如相隔至少6天、例如相隔7天、例如相隔至少8天、例如相隔9天、例如相隔至少10天、例如相隔15天、例如相隔至少20天、例如相隔25天。
用核酸構建體或組合物引發因此預期通過施用疫苗得到進一步加強。施用可以以不同于先前施用或類似于先前施用的形式或在不同于先前施用或類似于先前施用的身體部分中。
加強注射（shot）是同源或異源加強注射。同源加強注射是其中第一次和后續施用包括相同構建體且更具體而言相同遞送媒介物。異源加強注射是其中等同構建體包括在不同載體內。
根據本發明的組合物的優選施用形式是將組合物施用于身體區域，內或外，最可能是給定感染的接受器（receptacle）。感染接受器是感染通過其接受的身體區域，例如關于流感，感染接受器是肺。
本發明的核酸構建體或組合物可以施用于它對于其可以是有利的任何生物，特別是任何動物例如脊椎動物。組合物的施用裝置和方式適合于接受者落入本發明的范圍內。
組合物的優選接受者是哺乳動物，并且在本發明的一個更優選實施方案中，哺乳動物選自：牛、豬、馬、綿羊、山羊、美洲駝、小鼠、大鼠、猴、犬、貓、雪貂和人。在最優選的實施方案中，哺乳動物是人。
組合物的另一個優選接受者是來自鳥綱（鳥）的任何脊椎動物，例如家雞（雞）。
本發明的一個實施方案包括進一步包括第二種活性成分的組合物。第二種活性成分選自但不限于佐劑、抗生素、化學治療、抗變應原、細胞因子、免疫系統的補體因子和共刺激分子。
本發明的另一個實施方案包括部分試劑盒，其中試劑盒包括根據上文中的任何的至少一種核酸構建體或組合物，用于施用所述核酸構建體或組合物的裝置，和關于如何做到這點的說明書。包括多個劑量的相同組合物或幾種不同組合物在本發明的范圍內。在一個優選實施方案中，部分試劑盒進一步包括第二種活性成分。在一個更優選的實施方案中，所述第二種活性成分是合適疫苗，即能夠加強通過所述免疫應答的先前引發產生的免疫應答的疫苗。
本發明進一步包括用于加強動物中的免疫應答的方法，其包括給動物施用根據上文中的任何的核酸構建體或組合物，隨后施用合適疫苗，從而引發且加強受試者的免疫系統。
免疫應答可以是但不限于下述應答類型中的任何：mhc-i依賴性應答、mhc-i和/或mhc-ii依賴性應答、t細胞依賴性應答、cd4+t細胞依賴性應答、cd4+t細胞不依賴性應答、cd8+t細胞依賴性應答和b細胞依賴性免疫應答。合適疫苗是在用根據本發明的核酸構建體或組合物引發免疫系統后能夠加強免疫系統的那些。
在一個進一步的實施方案中，本發明涉及治療有此需要的個體的方法，其包括施用如本文上文所述的組合物，以治療所述個體中的臨床狀況。
增加疫苗的效力
本發明的一個實施方案涉及編碼至少一種恒定鏈或其變體和至少一種抗原蛋白質或肽或蛋白質或肽的片段的核酸構建體，其中至少一種抗原蛋白質或肽或蛋白質或肽的片段來自病毒、細菌或寄生蟲。
本文呈現的數據顯示使用包括恒定鏈或其變體的核酸構建體開發引發-加強方案并不簡單。因此，如圖1中呈現的，包括恒定鏈和抗原的裸露dna構建體（dna-iigp）能夠引發免疫應答，而包括抗原但不含恒定鏈的裸露dna構建體（dna-gp）不能引發免疫應答。此外，圖12中呈現的數據顯示包括抗原的腺病毒載體（adgp）能夠引發特定（ad-iigp）但并非全部（ad-gp）免疫應答，而圖13中呈現的數據顯示包括恒定鏈連同抗原的腺病毒載體（ad-iigp）在正常劑量和處理方案下不能引發任何（ad-iigp和ad-gp）免疫應答。然而，可能的是通過使用較低劑量的ad-iigp用于引發來最優化ad-iigp加強的ad-iigp引發（如圖14中所示）。
本發明的一個目的是提供編碼至少一種恒定鏈和病毒、細菌或寄生蟲抗原或其片段的核酸構建體，其中所述恒定鏈是恒定鏈的變體，用于引發免疫應答，其中所述引發隨后為用癌癥疫苗的后續加強疫苗接種。所述恒定鏈的變體可以是如本文其他地方指定的任何變體，包括其中ii-keylrmk氨基酸殘基已通過例如缺失或置換加以改變，或其中clip區域的部分已通過例如缺失或置換加以改變的恒定鏈。
在一個實施方案中，本發明涉及核酸構建體用于增加疫苗效力的用途。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈或其變體和抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體包括通過例如缺失或置換的ii-keylrmk氨基酸殘基的改變。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體包括通過例如缺失或置換的clip區域改變。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體不包括前17個氨基酸。
在另一個實施方案中，本發明涉及核酸構建體用于引發免疫應答的用途。
在一個實施方案中，本發明公開了用于引發免疫應答的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈或其變體和抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答。
在一個實施方案中，本發明公開了用于引發免疫應答的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體包括通過例如缺失或置換的ii-keylrmk氨基酸殘基改變。
在一個實施方案中，本發明公開了用于引發免疫應答的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體包括通過例如缺失或置換的clip區域改變。
在一個實施方案中，本發明公開了用于引發免疫應答的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體不包括前17個氨基酸。
增加癌癥疫苗的效力
本發明的一個實施方案涉及編碼至少一種恒定鏈或其變體和至少一種抗原蛋白質或肽或蛋白質或肽的片段的核酸構建體，其中至少一種抗原蛋白質或肽或蛋白質或肽的片段來自癌癥特異性多肽或癌抗原。
本發明的一個目的是提供編碼至少一種恒定鏈和癌抗原或其片段的核酸構建體，其中所述恒定鏈以其天然、野生型形式，用于引發免疫應答，其中所述引發隨后為用癌癥疫苗的后續加強疫苗接種。
本發明的另外一個目的是提供編碼至少一種恒定鏈和癌抗原或其片段的核酸構建體，其中所述恒定鏈是恒定鏈的變體，用于引發免疫應答，其中所述引發隨后為用癌癥疫苗的后續加強疫苗接種。所述恒定鏈的變體可以是如本文其他地方指定的任何變體，包括其中ii-keylrmk氨基酸殘基已通過例如缺失或置換加以改變，或其中clip區域的部分已通過例如缺失或置換加以改變，或其中前17個氨基酸已缺失的恒定鏈。
由此可見當用于加強免疫應答的隨后施用的疫苗是癌癥疫苗時，由根據本發明的核酸構建體編碼的恒定鏈可以以其天然、野生型形式，或它可以是恒定鏈的變體。
在一個實施方案中，本發明涉及核酸構建體用于增加癌癥疫苗效力的用途。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加癌癥疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈或其變體和癌癥特異性抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適的癌癥疫苗加強步驟b）的免疫應答。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加癌癥疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈和癌癥特異性抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適的癌癥疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈以其天然、野生型形式。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加癌癥疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和癌癥特異性抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適的癌癥疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體包括通過例如缺失或置換的ii-keylrmk氨基酸殘基的改變，和/或通過例如缺失或置換的clip區域部分的改變，和/或ii的前17個氨基酸的缺失。
在另一個實施方案中，本發明涉及核酸構建體用于引發免疫應答的用途。
在一個實施方案中，本發明公開了用于引發免疫應答的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈或其變體和癌癥特異性抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適的癌癥疫苗加強步驟b）的免疫應答。
在一個實施方案中，本發明公開了用于引發免疫應答的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈和癌癥特異性抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適的癌癥疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈以其天然、野生型形式。
在一個實施方案中，本發明公開了用于引發免疫應答的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和癌癥特異性抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用合適的癌癥疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體包括通過例如缺失或置換的ii-keylrmk氨基酸殘基的改變，和/或通過例如缺失或置換的clip區域部分的改變，和/或ii的前17個氨基酸的缺失。
增加針對異常生理學應答的疫苗的效力
本發明的一個目的是提供編碼至少一種恒定鏈和與異常生理學應答相關的多肽或其片段的核酸構建體，其中所述恒定鏈以其天然、野生型形式，用于引發免疫應答，其中所述引發隨后為用針對所述異常生理學應答的疫苗的后續加強疫苗接種。
本發明的另外一個目的是提供編碼至少一種恒定鏈和與異常生理學應答相關的多肽或其片段的核酸構建體，其中所述恒定鏈是恒定鏈的變體，用于引發免疫應答，其中所述引發隨后為用針對所述異常生理學應答的疫苗的后續加強疫苗接種。所述恒定鏈的變體可以是如本文其他地方指定的任何變體，包括其中ii-keylrmk氨基酸殘基已通過例如缺失或置換加以改變，或其中clip區域的部分已通過例如缺失或置換加以改變，或其中前17個氨基酸已缺失的恒定鏈。
由此可見當用于加強免疫應答的隨后施用的疫苗是針對所述異常生理學應答的疫苗時，由根據本發明的核酸構建體編碼的恒定鏈可以以其天然、野生型形式，或它可以是恒定鏈的變體。
在一個實施方案中，本發明涉及核酸構建體用于增加針對異常生理學應答的疫苗效力的用途。
在另一個實施方案中，本發明涉及核酸構建體用于引發免疫應答的用途。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加針對異常生理學應答的疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈或其變體和與異常生理學應答相關的抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用針對異常生理學應答的合適疫苗加強步驟b）的免疫應答。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加針對異常生理學應答的疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈和與異常生理學應答相關的抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用針對異常生理學應答的合適疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈以其天然、野生型形式。
在一個實施方案中，本發明公開了用于增加針對異常生理學應答的疫苗效力的方法，其包括步驟：
a.提供包括恒定鏈的變體和與異常生理學應答相關的抗原肽或其片段的核酸構建體，
b.通過施用步驟a）的核酸構建體引發受試者的免疫系統，從而刺激所述受試者中的免疫應答，和
c.通過施用針對異常生理學應答的合適疫苗加強步驟b）的免疫應答，
其中所述恒定鏈的變體包括通過例如缺失或置換的ii-keylrmk氨基酸殘基的改變，和/或通過例如缺失或置換的clip區域部分的改變，和/或ii的前17個氨基酸的缺失。
疫苗類型
本發明的一個方面涉及受試者中的免疫應答引發，通過施用包括ii連接的抗原的核酸構建體來進行，隨后為通過給相同受試者施用合適疫苗達到的后續加強。
根據本發明的合適疫苗具有與用于引發免疫應答的核酸構建體共同的至少一個等同特征。所述等同特征可以包括在恒定鏈的部分或全部、抗原肽的部分或全部、主鏈結構的部分或全部例如啟動子區的部分或全部、增強子的部分或全部、終止子的部分或全部、多聚腺苷酸尾的部分或全部、接頭的部分或全部、多聚接頭的部分或全部、操作接頭的部分或全部、多克隆位點（mcs）的部分或全部、標記的部分或全部、終止密碼子的部分或全部、內部核糖體進入位點（ires）的部分或全部和用于整合的宿主同源序列或其他限定元件的部分或全部中。
在一個優選實施方案中，等同特征是抗原肽或獨特輔助t細胞表位的部分或全部。在一個最優選的實施方案中，等同特征是抗原肽的部分或全部。
在另一個優選實施方案中，等同特征是恒定鏈的部分或全部。
疫苗可以被視為常規或創新的。本文引用的疫苗類型中的任何可以在根據本發明的后續加強步驟中使用。
常規疫苗或第一代疫苗依賴于完整生物；已被殺死的致病菌株，或具有減毒致病性的菌株。
分子生物學技術已用于開發新疫苗，基于來自致病生物的個別抗原蛋白質的第二代疫苗。概念上，抗原肽而不是完整生物的使用將避免致病性，同時提供包含最具免疫原性的抗原的疫苗。這些包括基于眾所周知的滅活毒性化合物的基于類毒素的疫苗，和基于滅活或減毒致病菌株的片段的亞單位疫苗。
綴合物疫苗：特定細菌具有弱免疫原性的多糖外衣殼。通過使這些外衣殼與蛋白質（例如毒素）連接，免疫系統可以導致識別多糖，如同它是蛋白質抗原。
重組載體疫苗：通過使一種微生物的生理學和另一種的dna組合，免疫可以針對具有復雜感染過程的疾病產生。
合成疫苗主要或整個由合成肽、碳水化合物或抗原組成。
dna（或遺傳）疫苗或第三代疫苗是用于開發預防和治療疫苗的新的和有希望的候選物。dna疫苗由dna的小環狀段（質粒）構成，其已進行遺傳改造，以產生來自微生物的一種或多種抗原。將疫苗dna注射到機體的細胞內，其中宿主細胞的“內部機制”“閱讀”dna，并且將其轉變成致病蛋白質。因為這些蛋白質被識別為外來的，所以它們通過宿主細胞加工且在其表面上展示，以改變免疫系統，這隨后觸發一系列免疫應答。確保免疫應答的強度通過載體（即裸露dna、病毒載體、活減毒病毒等）效力、抗原表達水平和重組抗原自身（即高或低親和力mhc結合物、對于或多或少有限的t或b細胞儲庫選擇的結構決定簇等）的組合決定。免疫記憶的有效誘導要求或獲益于cd4+（輔助細胞）t細胞與介導免疫記憶的許多效應的cd8+（細胞毒性）t細胞和b細胞的相互作用，這一般是真實的。
在本發明的一個實施方案中，用根據本發明的核酸構建體引發免疫應答隨后為用于加強所述免疫應答的第一代或常規疫苗的后續施用。
在本發明的一個實施方案中，用根據本發明的核酸構建體引發免疫應答隨后為用于加強所述免疫應答的第二代疫苗的后續施用。
在本發明的一個實施方案中，用根據本發明的核酸構建體引發免疫應答隨后為用于加強所述免疫應答的第三代或dna疫苗的后續施用。
在dna疫苗構建體中使用恒定鏈以增加免疫原性是本領域眾所周知的。在本發明的一個實施方案中，用根據本發明的核酸構建體引發免疫應答隨后為用于加強所述免疫應答的dna疫苗的后續施用，所述dna疫苗包括恒定鏈或其變體。
在本發明的一個實施方案中，用根據本發明的核酸構建體引發免疫應答隨后為用于加強所述免疫應答的腺病毒疫苗的后續施用。
疫苗可以進一步是單價的（monovalent）（也稱為一價的（univalent））或多價的（multivalent）（也稱為多價的（polyvalent））。單價疫苗設計為針對單一抗原或單一微生物免疫接種。多價或多價體疫苗設計為針對相同微生物的2種或更多種菌株，或針對2種或更多種微生物免疫接種。
附圖詳述
圖1：用基于ii鏈的裸露dna疫苗的dna-引發顯著增強在用高度有效的病毒載體的后續加強后的病毒特異性cd8+t細胞生成。小鼠用dna-iigp、dna-gp進行基因槍免疫接種2次，相隔3周，或不予以處理。在最后一次免疫接種后3周，所有小鼠在右后足墊中用2x107ifuad5-iigp注射，并且4周后，處死動物，并且如圖1中所述分析脾細胞。表位特異性ifn-γ+cd8+t細胞數目作為平均值±se（n=5只小鼠/組）呈現。*指示相對于僅用ad5-iigp疫苗接種的小鼠的統計顯著性（曼-懷二氏秩和檢驗）。描述了來自2次相似實驗之一的結果。
圖2：ii序列中的結構域和測試突變定位。wtii中的結構域在條上描述。ess；胞內體分選信號，tm；跨膜結構域，key；肽呈遞增強區域，clip；ii類結合的恒定鏈肽，trim：三聚結構域。ii中的缺失突變和置換程度在條下標記。a；ad-δ17iigp，b；ad-iiltmgp，c；ad-iiutmgp，d；ad-δ50iigp，e；ad-ii1-201gp，f；ad-ii1-118gp，g；ad-ii1-105gp，h；ad-iiclipgp，i；ad-iikeygp，j；ad-ii51-118gp。
圖3：ii顯著增加siinfekl/h-2kbova衍生表位的細胞表面呈遞。骨髓衍生的樹突細胞用ad-ova、ad-iiova或ad-iigp（陰性對照）轉染，并且表面對于mhcii類（染色成熟樹突細胞）和用siinfekl/h-2kb特異性抗體（ova表位）染色。
圖4：ii僅以順式工作。a）來自ad-iigp和ad-ii+gp載體的ii的表達；在用50moiad-iigp和ad-ii+gp感染的cos7細胞中將ii表達對gapdh進行標準化。b）tcr318gp33限制響應ad-gp、ad-iigp或ad-ii+gp轉導的bmdc（骨髓衍生的樹突細胞）的t細胞增殖。
圖5：n末端缺失和置換不影響ii刺激能力。tcr318gp33限制響應ad-gp、ad-iigp、ad-δ17iigp、ad-iiltmgp、ad-iiutmgp、ad-δ50iigp轉導的bmdc（骨髓衍生的樹突細胞）的t細胞增殖。
圖6：c末端缺失和置換不影響ii刺激能力。tcr318gp33限制響應ad-gp、ad-iigp、ad-ii1-205gp、adii1-118gp和ad-ii1-105gp轉導的bmdc（骨髓衍生的樹突細胞培養系統）的t細胞增殖。
圖7：僅n和c末端缺失減少ii刺激能力。tcr318gp33限制響應ad-gp、ad-iigp、ad-iiclipgp、ad-iikeygp和ad-ii51-118gp轉導的bmdc（骨髓衍生的樹突細胞培養系統）的t細胞增殖。
圖8：ad-iigp和ad-gp疫苗的劑量應答。小鼠組用在指示菌株中的指示疫苗進行疫苗接種。在疫苗接種后14天，處死小鼠，并且用指示表位刺激脾細胞。通過細胞內染色和facs分析測定特異性cd8+脾細胞的總數目。數據顯示ad-iigp在極低劑量下誘導應答，并且因此用低劑量ad-iigp（或任何抗原）引發和用更高劑量ad-iigp（或任何抗原）后續加強可以應用于同源引發-加強方案。
圖9：ad-gp、ad-iigp和ad-iiclipgp用于mhcii類呈遞（cd4+t細胞的刺激）的比較。smartagp61-80限制響應ad-gp、ad-iigp和ad-iiclipgp轉導的bmdc的t細胞呈遞顯示增加的ad-iiclipgp的mhcii抗原呈遞。
圖10：在體內時間-過程研究中的ad-gp、ad-iigp、ad-gplamp-1和ad-iiδ17gp比較。
圖11：ad-gp、ad-iigp、ad-iiδ17gp、ad-iikeygp、ad-iiclipgp、ad-ii1-117gp和ad-ii1-199gp體內應答的比較。
圖12：ad-gp能夠引發后續ad-iigp加強。3組c57bl/6小鼠用ad-gp進行疫苗接種。60天后，這些小鼠不受干擾，用ad-gp進行疫苗接種，或用ad-iigp進行疫苗接種。包括用ad-gp進行疫苗接種的第4組小鼠。第一次疫苗接種后120天，處死小鼠，并且通過用所述肽的先體外后體內再刺激和用于干擾素-γ產生的細胞內染色來定量識別指示表位的抗原特異性細胞。
圖13：ad-iigp不能引發后續ad-gp或ad-iigp加強。3組c57bl/6小鼠用ad-iigp進行疫苗接種。60天后，這些小鼠不受干擾，用ad-gp進行疫苗接種，或用ad-iigp進行疫苗接種。包括用ad-iigp進行疫苗接種的第4組小鼠。第一次疫苗接種后120天，處死小鼠，并且通過用所述肽的先體外后體內再刺激和用于干擾素-γ產生的細胞內染色來定量識別指示表位的抗原特異性細胞。這顯示ad-iigp引發不能用ad-iigp加強，而dna-iigp引發可以用ad-iigp加強（參見圖1）。
圖14：ad-gp和adii-gp疫苗的劑量應答。小鼠組用在指示菌株中的指示疫苗進行疫苗接種。在疫苗接種后14天，處死小鼠，并且用指示表位刺激脾細胞。通過細胞內染色和facs分析測定cd8+脾細胞的總數目。
圖15：與包括殘基50–215（ii50-215）的恒定鏈的變體偶聯的甘露糖受體進一步與腺病毒纖維蛋白質偶聯。腺病毒纖維蛋白質（ad纖維）可以源自腺病毒的任何血清型。甘露糖受體可以是來自甘露糖受體的一個或多個結構域。ii可以是ii的變體或全長。ag=抗原。
本發明的實施例
本發明現在將參考下述實施例進一步舉例說明。應當理解下述僅作為例子并且可以做出細節中的修飾，同時仍落入本發明的范圍內。
實施例1：用基于ii鏈的裸露dna疫苗引發顯著加強在用最優化病毒載體的后續加強后的病毒特異性cd8+t細胞生成。
用裸露dna疫苗（即核酸構建體）引發顯示加強通過用ad5（腺病毒血清型5）載體的后續免疫接種產生的免疫應答。用dna-iigp（表達與恒定鏈（ii）融合的lcmv（淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒）糖蛋白（gp）的dna構建體）引發在本文中證實顯著增強通過在腺病毒血清型5載體（ad5-iigp）中遞送的相同基因構建體誘導的cd8+t細胞應答，提供關于在未來異源免疫接種（“引發-加強”）方案中包括基于ii鏈的dna構建體的強論據。
我們的研究顯示ii鏈連接的免疫增強效應并不限于ad5載體，還與dna平臺相關。此外，考慮ii鏈增強超過一種表位的呈遞的事實，這提出基于ii鏈的dna疫苗作為用于各種異源引發-加強方案的非常有希望的候選物。
結果和討論
改善誘導的t細胞記憶的一種方法是通過異源引發-加強方案，例如裸露dna引發隨后為載體加強。因此具有在我們實驗室中的合適載體——表達與p31ii鏈融合的lcmvgp的復制缺陷型腺病毒（ad5-iigp），在實驗上測試了這種可能性。首先，我們執行了標準dna疫苗接種，用dna-iigp或dna-gp的基因槍疫苗接種2次，相隔3周。第二次dna疫苗接種后3周，通過在右后足墊中接種2x107ifuad5-iigp免疫接種小鼠組和匹配對照，并且4周后，通過關于ifn-γ的iccs和流式細胞術計數脾中的病毒特異性cd8+t細胞數目。用融合的dna構建體引發的小鼠包含比未引發小鼠明顯更多的gp33-41和gp276-286特異性ifn-γ+cd8+t細胞，并且對于gp92-101特異性細胞注意到相似趨勢，盡管在這種情況下差異不是統計上顯著的。相比之下，在不存在ii的情況下用編碼gp的裸露dna引發對通過用ad5-iigp的后續免疫接種誘導的gp特異性記憶cd8+t細胞水平具有很少作用（圖1）。應當指出觀察到的誘導ii作用不反映疫苗接種小鼠的免疫反應性的非特異性加強，因為用僅包括ii但不含gp的載體的dna引發對隨后用腺病毒載體接種的小鼠中的gp特異性cd8+t細胞水平沒有作用（數據未顯示）。
我們已顯示使用改良dna載體作為異源引發-加強方案的一部分將顯著加強通過已最優化的病毒載體誘導的應答（holst等人，2008）。這強烈指出甚至基于非常免疫原性載體的免疫接種也可以通過用基于ii鏈的裸露dna疫苗最初引發宿主得到進一步改善。總之，因為與抗原的ii鏈融合物將導致用于廣泛cd8+t細胞應答的引發，所以基于ii鏈的dna疫苗應代表關于針對快速突變病毒的預防策略作為異源引發-加強方案的一部分的明確優點。
材料與方法
小鼠。c57bl/6（b6）野生型小鼠得自taconicm&b（ry，丹麥）。穿孔蛋白缺陷b6小鼠由最初得自thejacksonlaboratory（barharbor，me）的育種對當地培育。7–10周大的小鼠在所有實驗中使用，并且來自外部來源的動物在使用前總是允許適應當地環境至少1周。所有動物在無特殊病原體的條件下飼養，如通過標記（sentinels）篩選驗證的。所有動物實驗根據國家指導進行。
dna疫苗構建和免疫接種程序。dna疫苗使用真核生物表達載體paccmv.plpa產生，所述paccmv.plpa包含鼠類恒定鏈隨后為lcmv的gp或單獨的lcmvgp。構建體如近期描述的生成（holst等人，2008）。大腸桿菌菌株xl1-blue（stratagene，usa）通過電穿孔用構建體進行轉化。使用循環測序、bigdyeterminator和abi310遺傳分析儀（abiprism，usa）的dna測序鑒定陽性克隆。引物得自tag，copenhagen，丹麥。使用qiagenmaxiprep（qiagen，usa）產生大規模dna制劑。
基因槍免疫接種。將dna以2μgdna/mg金的濃度包被到1.6nm金顆粒上，并且將dna/金復合物包被到塑料管上，從而使得0.5mg金遞送至小鼠/注射（1μgdna/注射）。這些程序根據制造商的說明書執行（biorad，ca，usa）（bartholdy等人，2003）。小鼠使用采用壓縮氦（400psi）作為粒子原運力的手提式基因槍裝置在腹部皮膚上進行免疫接種。除非另有說明，否則小鼠用3-4周的間隔免疫接種2次，并且隨后在進一步攻擊/研究前允許休息3周。
病毒。lcmv的阿姆斯特朗（armstrong）毒株克隆13在大多數實驗中使用。除非另有說明，否則待感染的小鼠接受在0.3ml的i.v.注射中的105pfu，或在右后足墊（f.p.）中在0.03ml中的20pfu克隆13劑量。對于i.c.注射，小鼠接受在0.03ml的體積中的20pfu的向神經阿姆斯特朗克隆53b。如近期描述的（holst等人，2008）產生且滴定編碼恒定鏈連接的gp的復制缺陷型腺病毒（ad5-iigp）。
病毒滴定。通過如先前描述的（battegay等人，1991）免疫焦點測定來測定器官病毒滴度。
cd4+和cd8+t細胞的體內耗盡。使用抗cd4（克隆gk1.5）和抗cd8mabs（克隆53.6.72）。在相對于感染的第-1和0天時，待耗盡細胞的小鼠腹膜內接受在0.3mlpbs的體積中的200□g劑量；而對于假處理，使用純化的大鼠igg（jacksonimmunoresearch）。通過流式細胞術驗證細胞耗盡的效率。
存活研究。死亡率用于評估急性lcmv誘導的腦膜炎的臨床嚴重性。小鼠每天檢查2次，共14天時間段，或直至達到100％的死亡率。
lcmv特異性足墊腫脹反應的測定。小鼠如上所述在右后足墊中進行局部感染，并且跟蹤局部腫脹反應直至第14天p.i。用指針式測徑器（dialcaliper）（mitutoyo7309，mitutoyoco.，tokyo，日本）測量足墊厚度，并且病毒特異性腫脹測定為受感染右足和未感染左足厚度的差異（christensen等人，1994）。
細胞制備。無菌取出來自小鼠的脾細胞，并且轉移至hanks`平衡鹽溶液（hbss）。通過按壓器官經由精細無菌鋼絲網獲得單細胞懸浮液。細胞用hbss洗滌2次，并且細胞濃度在包含10％胎牛血清（fcs）的rpmi1640中調整，所述rpmi1640補充有2-巰基乙醇、l-谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素溶液。
用于流式細胞術的mab。下述mab都作為大鼠抗小鼠抗體購自pharmingen（sandiego，ca）：fitc綴合的抗cd44、cy-鉻綴合的抗cd8a、cy-鉻綴合的抗cd4和藻紅蛋白（pe）綴合的抗ifn-γ。
流式細胞術分析。對于lcmv特異性（產生干擾素-γ）cd8+/cd4+t細胞的顯現，使1-2x106個脾細胞重懸浮于0.2ml完全rpmi培養基中，所述完全rpmi培養基補充有10個單位鼠類重組il-2（r&dsystemseuropeltd，abingdon，uk）、3μm莫能星（sigmachemicalsco.，stlouis，mo）和1μg/ml相關肽，并且在37℃下孵育5小時。使用下述肽：對于cd8+t細胞為gp33-41、gp276-86、gp92-101、gp118-125且np396-404用于對照；對于cd4+t細胞為gp61-80。在孵育后，細胞進行表面染色，洗滌，滲透化且用ifn-γ特異性mab染色，如先前描述的（andreasen等人，2000；christensen等人，2003）。同種型匹配的抗體充當對照用于非特異性染色。細胞使用facscalibur（bectondickinson，sanjose，ca）進行分析，并且使用低角度和側面散射的組合來門控至少104個活細胞，以排除死細胞和碎片。使用cell-quest軟件進行數據分析。
實施例2：ii連接的抗原增強的cd8+t細胞激活不依賴于天然ii
ii序列包含在抗原加工具有功能的多個區域，其包括：細胞質分選結構域和三聚結構域、細胞質和近側膜發信號結構域、細胞質、膜內和周質三聚結構域、涉及解鎖mhc分子以促進外源肽結合的“key”基序、在clip區域中對于mhci和ii類的結合基序、周質糖基化位點以及與cd44和巨噬細胞遷移抑制因子（mif）相互作用的在結構上未鑒定的區域（圖2）。
ii連接增加在mhci和ii類上的抗原呈遞。通過使用骨髓衍生的樹突細胞（bmdc）的ad-iiova（ova是卵白蛋白）或ad-ova轉導，我們發現ii連接的確誘導mhci類限制性抗原呈遞的顯著增加，如通過用針對在h-2kb上呈遞的siinfeklova表位的抗體的直接染色測量的（圖3）。增加的來自ii連接的序列的mhci類限制性抗原的表達直接作用于apc，不依賴于mhcii類、cd4+t細胞和任何其他細胞類型，并且可以在樹突細胞培養中直接測量。
以順式的ii
為了確定ii是僅以順式還是也以反式工作，通過合成具有β-珠蛋白多聚腺苷酸化信號的磷酸甘油酸酯激酶（pgk）啟動子，并且將其克隆到腺病毒骨架的e3區域內，建立在腺病毒載體內的另外讀碼框。這種載體隨后可以用于與穿梭載體重組，所述穿梭載體用于制備ad-gp載體（其表達在人cmv啟動子和sv40多聚腺苷酸的控制下來自e1讀碼框的lcmvgp）。新載體表達來自腺病毒e1區的lcmvgp和來自e3區的ii（ad-ii+gp）。啟動子通過轉染到cos7細胞內就綠色熒光細胞的誘導進行驗證，并且在ad-iigp和ad-ii+gp感染的cos7細胞中iimrna表達的測量證實ii由pgk啟動子表達至少與由cmv啟動子表達一樣有效（圖4a）。用ad-gp、ad-iigp和ad-ii+gp感染的bmdc刺激的tcr318細胞的比較顯示ii必須與抗原連接，以具有任何作用（圖4b）。如果以反式的ii表達已顯示功效那將是令人驚訝的，因為用于刺激的bmdc培養物已表達ii。
n末端改變：
從n末端開始，我們進行1）前17個氨基酸的缺失（ad-δ17iigp），這去除基于亮氨酸的胞內體分選信號，2）用來自趨化因子受體ccr6tm6的相應區段替換跨膜區段的前一半（ad-iiltmgp），3）用相應ccr6tm6區段替換跨膜區段的另一半（ad-iiutmgp），和最后4）前50個氨基酸的完全缺失（ad-δ50iigp）。后面一種缺失去除整個細胞溶質、tm和膜近側區。這些突變無一對其余ii序列增強cd8+t細胞刺激的能力具有任何作用（圖5）。
c末端改變：
從c末端我們進行最后14個aa（ad-ii1-201gp，這去除c末端糖基化信號）、最后97個aa（ad-ii1-118gp）和最后110個aa（ad-ii1-105gp）的缺失。通過1-201未觀察到對其余ii序列增強cd8+t細胞刺激的能力的作用，而從1-105突變和1-118突變僅可見不一致和較小的減少趨勢（圖6）。
突變：
我們還嘗試在報道的clip區域的mhci類結合位點（ad-iiclipgp：雙重的m至a點突變-m91am99a–設計為取消ii與mhci類分子的相互作用）和key基序（ad-iikeygp：lrmk至aaaa的四重的點突變，這將破壞ii-key區段）中進行點突變。這些突變無一對于ii介導的增強的cd8+t細胞刺激是關鍵的。當我們組合n和c末端截短（truncation）時，唯一有趣的數據出現。因此，當我們測試51-118變體（ad-ii51-118gp）時，觀察到cd8+t細胞刺激能力的顯著減少，但突變體仍優于ad-gp（圖7）。
實施例3
在本發明的一個實施方案中，提供了與ii偶聯的與糖基結合蛋白質組合的非人糖基轉移酶。ii可以是全長或變體，其中變體可以是包括殘基編號50–215的ii的截短形式。這種變體具有完全活性，盡管缺乏跨膜結構域。任選地，可以進一步提供佐劑或一個或多個易位結構域。在圖15中提供的是一個實施方案的示意圖，其中甘露糖受體（在疫苗中通常靶向的鈣依賴性凝集素）與包括殘基50–215的恒定鏈的變體（ii50-215）偶聯，與腺病毒纖維蛋白質進一步偶聯。腺病毒纖維蛋白質（ad纖維）可以源于腺病毒的任何血清型。甘露糖受體可以是來自甘露糖受體的一個或多個結構域。
在一個特定例子中，提供了這樣的腺病毒：在一個讀碼框中表達egghead（來自果蠅的蛋白質），并且在另一個讀碼框中表達甘露糖受體（或來自甘露糖受體的結構域），所述受體與不含跨膜區的具有完全活性的ii變體例如ii50-215變體，其與腺病毒纖維蛋白質進一步偶聯。
糖基轉移酶例如egghead和糖基結合蛋白質例如甘露糖受體可以由在相同腺病毒載體中的不同讀碼框表達，或糖基轉移酶例如egghead和糖基結合蛋白質例如甘露糖受體可以由同時施用的不同腺病毒載體表達。
egghead在所有糖基化er（內質網）蛋白質上偶聯甘露糖。分泌蛋白質的甘露糖基化可以因此引起甘露糖化蛋白質與甘露糖受體-ii-ad纖維復合物的結合（如圖15中所示）。復合物的腺病毒纖維引起與所述復合物連接的分泌蛋白質由其他細胞吸收，激活這些以變得免疫刺激的，并且提供復合物對ii可以在其中發揮其作用的細胞溶質的接近。
這種技術可以用于構建可以直接施用到例如癌癥內的疫苗。
參考文獻列表
andreasen，s.o.，christensen，j.e.，marker，o.&thomsen，a.r.（2000）.roleofcd40ligandandcd28ininductionandmaintenanceofantiviralcd8+effectortcellresponses.jimmunol164，3689-3697.
bartholdy，c.，stryhn，a.，hansen，n.j.，buus，s.&thomsen，a.r.（2003）.incompleteeffector/memorydifferentiationofantigen-primedcd8+tcellsingenegundna-vaccinatedmice.eurjimmunol33，1941-1948.
battegay,m.，cooper,s.，althage,a.，banziger,j.，hengartner,h.和zinkernagel,r.m.（1991）.quantificationoflymphocyticchoriomeningitisviruswithanimmunologicalfocusassayin24-or96-wellplates.j.virol.methods33:191-198.
becker,t.c.，noel,r.j.，coats,w.s.，gomez-foix,a.m.，alam,t.，gerard,r.d.和newgard,c.b.（1994）.useofrecombinantadenovirusformetabolicengineeringofmammaliancells.methodscellbiol.43pta:161-189.
christensen，j.p.，marker，o.&thomsen，a.r.（1994）.theroleofcd4+tcellsincell-mediatedimmunitytolcmv：studiesinmhcclassiandclassiideficientmice.scandjimmunol40，373-382.
christensen，j.p.，kauffmann，s.o.&thomsen，a.r.（2003）.deficientcd4+tcellprimingandregressionofcd8+tcellfunctionalityinvirus-infectedmicelackinganormalbcellcompartment.jimmunol171，4733-4741.
diebold，s.s.，m.cotten，n.koch和m.zenke.（2001）.mhcclassiipresentationofendogenouslyexpressedantigensbytransfecteddendriticcells.genether.8:487-493.
holmesjp，benavideslc，gatesjd，carmichaelmg，huemanmt，mittendorfea，murrayjl，amina，craigd，vonhofee，ponniahs，peoplesge.（2008）.resultsofthefirstphaseiclinicaltrialofthenovelii-keyhybridpreventiveher-2/neupeptide（ae37）vaccine.jclinoncol.jul10；26（20）:3426-33.
holst，p.j.，sorensen，m.r.，mandrupjensen，c.m.，orskov，c.，thomsen，a.r.&christensen，j.p.（2008）.mhcclassii-associatedinvariantchainlinkageofantigendramaticallyimprovescell-mediatedimmunityinducedbyadenovirusvaccines.jimmunol180，3339-3346.
kallinterisnl，lux，blackwellce，vonhofee，humphreysre，xum.（2006）.ii-key/mhcclassiiepitopehybrids：astrategythatenhancesmhcclassiiepitopeloadingtocreatemorepotentpeptidevaccines.expertopin.biol.ther.6（12）:1311-1321.
morris，c.r.，a.j.reber，j.l.petersen，s.e.vargas和j.c.solheim.（2004）.associationofintracellularproteinswithfoldedmajorhistocompatibilitycomplexclassimolecules.immunol.res.30:171-179.
pieters，j.（1997）.mhcclassiirestrictedantigenpresentation.curr.opin.immunol.9:89-96.
sambrook等人，編輯，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，2ndedition，coldspringharbor，n.y.，1989.
strumptner-cuvelette，p.和p.benaroch.（2002）.multiplerolesoftheinvariantchaininmhcclassiifunction.biochem.biophys.acta.，1542:1-13.
wo2007/062656
us2008/0095798
wo2003/089471
us5,554,372
us5,876,735
5,102,985。
序列表
<110>holst,peterjohannes
thomsen,allanrandrup
christensen,janpravsgaard
grujic,mirjana
<120>免疫應答的引發
<130>p1982dk00
<140>pa200801638
<141>2008-11-21
<160>4
<170>fastseqforwindowsversion4.0
<210>1
<211>1287
<212>dna
<213>智人-恒定鏈
<400>1
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<211>216
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metserarghisserleugluglnlysprothraspalaproprolys
180185190
gluserleugluleugluaspproserserglyleuglyvalthrlys
195200205
glnaspleuglyprovalpromet
210215
<210>3
<211>648
<212>dna
<213>小家鼠-恒定鏈
<400>3
atggatgaccaacgcgacctcatctctaaccatgaacagttgcccatactgggcaaccgc60
cctagagagccagaaaggtgcagccgtggagctctgtacaccggtgtctctgtcctggtg120
gctctgctcttggctgggcaggccaccactgcttacttcctgtaccagcaacagggccgc180
ctagacaagctgaccatcacctcccagaacctgcaactggagagccttcgcatgaagctt240
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atgtccatggataacatgctccttgggcctgtgaagaacgttaccaagtacggcaacatg360
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<211>215
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<213>小家鼠-恒定鏈
<400>4
metaspaspglnargaspleuileserasnhisgluglnleuproile
151015
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202530
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