本發明克隆表達了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質和應用，屬于工業微生物領域。
背景技術：
D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)
目前為止，已經在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發現了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)
本發明首次從奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應相比逆反應極微弱，可應用于光學純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。
技術實現要素：
本發明從奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)中克隆得到了一種以FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性，并進行了應用研究。
本發明的技術方案如下：
1、菌株
本發明D-乳酸氧化酶基因的來源菌株為：Proteus mirabilis ATCC 25933，購自美國ATCC菌種庫。
2、D-乳酸氧化酶基因的克隆
提取Proteus mirabilis ATCC 25933菌體基因組總DNA。設計特異性引物，應用PCR方法，擴增出D-乳酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構建重組質粒。
3、D-乳酸氧化酶表達與純化
將重組質粒導入E.coli BL21(DE3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。
4、D-乳酸氧化酶的酶學性質分析
以D-乳酸為底物研究pH對本發明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。
以D-乳酸為底物研究溫度對本發明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。
D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。
酶活測定方法為：根據Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進行。
5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯
拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉化16h，轉化后液相色譜分析上清液。(R)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應的α-酮酸酯，(S)-α-羥酸酯不被氧化。
產物(S)-α-羥酸酯的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價：
對映體過量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％
式中SR為反應后(R)-對映體的峰面積，SS為反應后(S)-對映體的液相色譜峰面積，S0為反應前(R)-和(S)-對映體的液相色譜峰面積之和。
產物測定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進樣量20μL。
所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細辛醇酯、對羥基苯乳酸細辛醇酯。
所述的α-羥酸酯，根據中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本發表明的有益之處：從Proteus mirabilis ATCC 25933中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶可以氧化(R)-α-羥酸和(R)-α-羥酸酯，可用于規模化制備手性純(S)-α-羥酸酯，具有重要的工業應用價值。
具體實施方式
實施例1
本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構建。
1、Proteus mirabilis ATCC 25933DNA的提取
將Proteus mirabilis ATCC 25933菌株在LB培養基中培養12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應用細菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。
2、大腸桿菌感受態制備
(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養過夜。
(2)按1％接種量接種于50mL LB培養基中，37℃培養至OD600約0.6(約2～3h)。
(3)將菌液轉移到50mL預冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。
(4)棄上清，加入5mL預冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復2次。
(5)棄上清，加入1.5mL預冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。
3、D-乳酸氧化酶基因的克隆
(1)引物設計
設計引物序列為：
引物1：5'GCCGGGATCCATGAAAATTGTTTCCTATAGTACTA 3'
引物2：5'GCCGTCTAGACTTTCACTTCGTTAGGTGAT 3'
(2)PCR擴增
用以上合成的兩條引物，以Proteus mirabilis ATCC 25933的基因組DNA為模板進行PCR擴增。
本步驟中擴增體系為：
擴增程序為：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應30個循環
72℃，10min
PCR產物送華大基因測序后得到該酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)雙酶切和連接
將pColdⅡ質粒和PCR產物進行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉化到E.coli DH5α感受態細胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。
(4)轉化
步驟：
1在連接體系中加入100μl DH5α感受態細菌，輕混勻，冰浴30min。
2放入預熱的42℃水浴中，放置90s進行熱休克處理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的LB培養液，37℃培養1h使菌體復蘇。
5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。
6培養24h長勢良好。挑單菌落進行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質粒。將重組質粒導入BL21大腸桿菌感受態中，保存備用。
實施例2
本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶的誘導表達及分離純化。
1、加500μl重組菌液到50ml LB培養液中。37℃培養2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導培養24h。將發酵液進行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統操作進行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進水里，設置system flow 20ml/min流速，進行排氣。然后設置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進結合液中，B1放進洗脫液中，再進行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經冷凍干燥備用。
實施例3
本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶的最適溫度。以D-乳酸為底物，將底物與pH為8.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測定D-乳酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應溫度為50℃。
實施例4
本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶的最適pH值。以D-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，50℃水浴15min測定酶的酶活，結果發現在pH 8.0條件下D-乳酸氧化酶酶活最高。
實施例5
本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶與不同底物的反應特性，列于表2中。
表2 D-乳酸氧化酶對不同底物的活性
實施例6
根據發明內容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結果如下表所示：
表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果
由上表可以看出，當在反應時間充分時，可以得到各類高光學純的(S)-α-羥酸酯，該酶的光學專一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大學
<120> 一種氧化酶及其應用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1770
<212> DNA
<213> Proteus mirabilis ATCC 25933
<400> 1
atgaatgaga gtagcagctc cacaaaccag cattttattc gtaagttaga aggtattgtc 60
ggtaaaaaac atgtattaac ccaagagcat aaaacagagc gatatcgtaa agggtttcgt 120
tccggacagg gaaaagcgct ggcagtggta ttccccggct ctttattaga acagtggcgt 180
atttttaaaa cctgtgttga agccgataaa attattatta tgcaagcggc aaatactggg 240
ttaacagaag gttcaacccc cagtggtgat gactatgatc gtgatattgt tatcatcagt 300
accttgcgcc aagataaaat acaagttctt tctgaatata accaagttat tgcctttcct 360
ggcagtacat tatggcactt agaaaaagta ttaaagccat taggaagaga gccacattca 420
gtgatagggt cttcttgtat tggtgcttcg gtgattggag gcatttgtaa taactcaggg 480
ggggcattag tgcgccgcgg tcctgcttat actgagttat ctctttatgc ccgtgttaat 540
gaacaaggtg aagcagagct tatcaaccat ttgggaattg atttaggtga cactccggaa 600
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tttgctatta aagggcgtgt tgatgctgtt cttaataaag tgccattttt acctaagaat 1080
ctaactgata gaacaatgca attgatgagt aagttatggc ctgctcattt acctgctcgt 1140
atgacagaat atcgcgataa atatgagcat catttaatgc taagaatggc ggatagtggt 1200
atagaagaag cctcaactta tttaaaagaa tattttaaac atgccacggg ggattatttc 1260
gaatgtacag aagaagaagg taataaagcc tttttacatc gttttgccgc cgcgggtgct 1320
gcggtgcgtt atcatgccgt tcatattaac gatgtggaag atgtgctacc tttggatatt 1380
gcattgcgtc gtaatgatcg agattggttt gaaaaactgc ctcctgaaat agaaaaccaa 1440
ttgctctata aattgtactg tggtcacttt atgtgtcacg ttatgcatca agattatatt 1500
attaaaaaag gtgttgacgc taaggcgctt aaagcacaga tgttagcctt actagacaaa 1560
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ttaaaagcgt tttataaaca taacgatccg acaaatagca tgaacccagg cattggtaaa 1680
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gaagttaatc atatagaaaa caaagaataa 1770
<210> 2
<211> 589
<212> PRT
<213> Proteus mirabilis ATCC 25933
<400> 2
Met Asn Glu Ser Ser Ser Ser Thr Asn Gln His Phe Ile Arg Lys Leu
1 5 10 15
Glu Gly Ile Val Gly Lys Lys His Val Leu Thr Gln Glu His Lys Thr
20 25 30
Glu Arg Tyr Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly Gln Gly Lys Ala Leu Ala
35 40 45
Val Val Phe Pro Gly Ser Leu Leu Glu Gln Trp Arg Ile Phe Lys Thr
50 55 60
Cys Val Glu Ala Asp Lys Ile Ile Ile Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly
65 70 75 80
Leu Thr Glu Gly Ser Thr Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Asp Arg Asp Ile
85 90 95
Val Ile Ile Ser Thr Leu Arg Gln Asp Lys Ile Gln Val Leu Ser Glu
100 105 110
Tyr Asn Gln Val Ile Ala Phe Pro Gly Ser Thr Leu Trp His Leu Glu
115 120 125
Lys Val Leu Lys Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser
130 135 140
Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Ile Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ala Leu Val Arg Arg Gly Pro Ala Tyr Thr Glu Leu Ser Leu Tyr
165 170 175
Ala Arg Val Asn Glu Gln Gly Glu Ala Glu Leu Ile Asn His Leu Gly
180 185 190
Ile Asp Leu Gly Asp Thr Pro Glu Glu Ile Leu Thr Asn Leu Asp Asn
195 200 205
Arg His Tyr His Ala Lys Gln Ile His Ala Thr Asp Lys Leu Ala Ser
210 215 220
Asp His Glu Tyr Ser Glu Arg Val Arg Asp Ile Asp Ala Asp Thr Pro
225 230 235 240
Ser Arg Phe Asn Asn Asp Glu Arg Arg Leu Phe Glu Ala Ala Gly Ser
245 250 255
Ala Gly Lys Leu Ser Val Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Ala
260 265 270
Asp His Arg Thr Gln Val Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Asp Pro Asp Glu
275 280 285
Leu Glu Asp Ile Arg Arg His Ile Leu Ser Gln Phe Lys Val Leu Pro
290 295 300
Val Ala Gly Glu Tyr Met His Arg Ser Tyr Tyr Lys Met Ala Glu Val
305 310 315 320
Tyr Gly Lys Asp Thr Phe Leu Ile Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys
325 330 335
Met Pro Ala Leu Phe Ala Ile Lys Gly Arg Val Asp Ala Val Leu Asn
340 345 350
Lys Val Pro Phe Leu Pro Lys Asn Leu Thr Asp Arg Thr Met Gln Leu
355 360 365
Met Ser Lys Leu Trp Pro Ala His Leu Pro Ala Arg Met Thr Glu Tyr
370 375 380
Arg Asp Lys Tyr Glu His His Leu Met Leu Arg Met Ala Asp Ser Gly
385 390 395 400
Ile Glu Glu Ala Ser Thr Tyr Leu Lys Glu Tyr Phe Lys His Ala Thr
405 410 415
Gly Asp Tyr Phe Glu Cys Thr Glu Glu Glu Gly Asn Lys Ala Phe Leu
420 425 430
His Arg Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ala Val Arg Tyr His Ala Val His
435 440 445
Ile Asn Asp Val Glu Asp Val Leu Pro Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg
450 455 460
Asn Asp Arg Asp Trp Phe Glu Lys Leu Pro Pro Glu Ile Glu Asn Gln
465 470 475 480
Leu Leu Tyr Lys Leu Tyr Cys Gly His Phe Met Cys His Val Met His
485 490 495
Gln Asp Tyr Ile Ile Lys Lys Gly Val Asp Ala Lys Ala Leu Lys Ala
500 505 510
Gln Met Leu Ala Leu Leu Asp Lys Arg Gly Ala Glu Tyr Pro Ala Glu
515 520 525
His Asn Val Gly His Leu Tyr Tyr Ala Lys Pro Gln Leu Lys Ala Phe
530 535 540
Tyr Lys His Asn Asp Pro Thr Asn Ser Met Asn Pro Gly Ile Gly Lys
545 550 555 560
Thr Ser Lys Leu Lys Tyr Trp Gly Glu Glu Cys Gly Cys Gly His Asn
565 570 575
His Asn Gln Ala Glu Val Asn His Ile Glu Asn Lys Glu
580 585