一種六勝肽的制備方法及其產品與流程

本發明屬于化妝品技術領域，具體涉及液相片段與固相合成六勝肽的方法及獲得的產品。

背景技術：

六勝肽是一種六個氨基酸組成的活性多肽，其序列為Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH₂，是由突觸蛋白SNAP-25的氮端(AA12～17)衍生而來的六個氨基酸肽鏈，能與SNARE三元復合物相互作用，抑制嗜鉻細胞中受Ca²⁺調控的兒茶酚胺釋放，從而阻止神經-肌肉間的乙酰膽堿傳導，引起肌肉麻痹。六勝肽是肉毒素類的安全替代品，與之活性相似，具有膜滲透性，有效避免了潛在的毒副作用。由于能夠阻斷神經肌肉間的信息傳導，避免肌肉過度收縮，減少了動態紋的發生，同時還能有效重組膠原彈力，增加彈力蛋白活性，使臉部線條放松。因此，多用于化妝品內作為抗皺成分。

目前，有關六勝肽的制備均采用經典固相法完成，然而該方法不夠靈活，Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin偶聯較為困難，導致成本很高，收率較小。

因此，開發一種高效率低成本合成六勝肽的方法成為本領域急需解決的技術問題。

技術實現要素：

本發明解決的技術問題是提供一種固相合成與液相合成相結合的六勝肽的合成方法。該方法既有液相法降低成本、易于放大的優點，又有固相法易于純化、操作簡單的特點，是一種相對理想的六勝肽合成方法。

具體來說，本發明采用液相法分別合成片段A[Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH]，避開了直接偶聯兩個Fmoc-Arg(pbf)-OH較難的情況，再將片段A[Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH]以單個氨基酸組分的形式，按照經典固相法進行偶聯，制得六勝肽產品。

更具體來說，本發明通過如下技術方案實現的：

一種六勝肽的制備方法，所述方法包括如下步驟

(1)Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin合成；以及

(2)氨基酸鏈延長：將步驟(1)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上依次連接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH制備得到六勝肽產品；

其中，步驟(1)中所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin是通過片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH制備得到，所述片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH是將H-Arg(pbf)-OH與Fmoc-Arg(pbf)-OSu進行反應合成得到。

其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的制備方法是將H-Arg(pbf)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OSu溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入N,N-二異丙基乙胺進行反應，之后加入水、有機酸調節pH 5～6，對其用乙酸乙酯進行萃取分離得到乙酸乙酯相進行濃縮后加入乙醚再次進行濃縮，得到產物Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；優選所述有機酸為檸檬酸。

其中，所述H-Arg(pbf)-OH是通過如下方法合成得到：

其中，將Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氫呋喃混合進行反應，反應后將溶劑蒸干，加入水，之后用鹽酸調節PH≈6，固液分離得到固體，干燥得到產物H-Arg(pbf)-OH。

其中，所述鹽酸的濃度是1mol/L；優選所述在用鹽酸調節PH≈6后攪拌15分鐘，再進行過濾。

其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氫呋喃之間的比例是每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入0.60ml哌啶、20ml四氫呋喃。

其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-OSu是通過如下方法合成得到：

其中，在Fmoc-Arg(pbf)-OH和HoSu中加入四氫呋喃和二環己基碳二亞胺進行反應，固液分離得到濾液，即為產物Fmoc-Arg(pbf)-OSu。

其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-OH與N-羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺摩爾比為1:1.5:1.3。

其中，所述步驟(1)合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin包括如下步驟：

(1)將Rink-Amide-AM-Resin活化；

(2)步驟(1)活化后的樹脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，除掉Rink-Amide-AM-Resin上的9-芴甲氧羰基基團；

(3)將步驟(2)的Rink-Amide-AM-Resin加入N，N-二甲基甲酰胺，之后與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺進行反應，得到產物用有機溶劑洗滌，得到保護肽樹脂Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin。

其中所述Rink-Amide-AM-Resin樹脂與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2:5:5。

其中步驟(2)所述氨基酸鏈延長包括如下步驟：

(1)在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液進行反應，去除溶劑后用有機溶劑洗滌得到H₂N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；

(2)將步驟(1)得到的H₂N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺進行反應，之后用有機溶劑洗滌樹脂，得到保護肽樹脂Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；

(3)在Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上按照上述步驟(1)和(2)的方法將Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH依次連接得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；

(4)將步驟(3)得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin脫9-芴甲氧羰基得到H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；在H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N-二異丙基乙胺進行反應，經固液分離得到產物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；然后將其加入到切割液中進行切割反應，經分離、純化得到六勝肽產品。

其中，步驟(2)所述Rink-Amide-AM-Resin樹脂與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2:5:5；優選步驟(1)和步驟(2)中用有機溶劑進行洗滌是用N，N-二甲基甲酰胺進行洗滌。

其中，步驟(4)所述H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂與乙酸酐、N,N-二異丙基乙胺的質量比為2:4:3。

其中，步驟(4)所述切割液是體積比為6:3:86:5的三異丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水的混合溶液，優選切割液的加入量是按每克樹脂加入8～10mL切割液。

其中，步驟(4)所述分離、純化是對切割后的反應液進行過濾，濾液傾倒到冷凍的無水乙醚中，攪拌，離心、分離出上清液，室溫減壓烘干，得六勝肽的粗品，經反相色譜法純化、濃縮、凍干得純度大于95％的六勝肽。

本發明還提供上述制備方法制備得到六勝肽，其純度大于95％。再具體來說，本發明提供一種六勝肽的合成方法，其包括下述步驟：

(1)液相法合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH

①將Fmoc-Arg(pbf)-OH加入茄型瓶中，每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入0.60ml哌啶、20ml四氫呋喃，室溫攪拌反應3小時，將溶劑旋轉蒸干，每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入200ml水，用1mol/L的鹽酸調節PH≈6，攪拌15分鐘，過濾得濾餅，烘干得到產物，產物為H-Arg(pbf)-OH；

②將Fmoc-Arg(pbf)-OH加入茄型瓶中，加入N-羥基琥珀酰亞胺，加入四氫呋喃中攪拌溶解，再投入二環己基碳二亞胺，Fmoc-Arg(pbf)-OH與N-羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺摩爾比為1:1.5:1.3，攪拌反應3小時，過濾得到濾液，產物為Fmoc-Arg(pbf)-OSu；

③以上述步驟①、②的產物為原料，以1:1的比例溶于N，N-二甲基甲酰胺，按每克Fmoc-Arg(pbf)-OSu加入10mlN，N-二甲基甲酰胺、0.5ml N,N-二異丙基乙胺，反應2小時，加入5倍體積的水，用檸檬酸調節PH 5～6，加入乙酸乙酯，攪拌分層，取乙酸乙酯層，乙酸乙酯層用飽和氯化鈉水溶液淋洗2遍，蒸干溶劑，蒸干后，再加入乙醚攪拌，再蒸干，加入乙醚，攪拌過濾，得到固體產物，產物為Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。

(2)樹脂活化

將Rink-Amide-AM-Resin樹脂加入反應器中，每克Rink-Amide-AM-Resin樹脂加入10mL N，N-二甲基甲酰胺，室溫攪拌30分鐘使其充分溶脹活化；

(3)合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

在步驟(2)的活化樹脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，除掉Rink-Amide-AM-Resin上的9-芴甲氧羰基基團，用N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂。加入N，N-二甲基甲酰胺，室溫攪拌，加入步驟(1)制得Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺，Rink-Amide-AM-Resin樹脂與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2:5:5，室溫攪拌反應3～5小時，用N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(4)合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

在每克步驟(3)合成的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂中加入10ml哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室溫反應20～40分鐘，抽濾除去溶劑，N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂，得H₂N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺，Rink-Amide-AM-Resin樹脂與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2:5:5，室溫攪拌反應3～5小時，用N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(5)合成Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂重復步驟(3)(4)，對保護蛋氨酸進行偶聯，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(6)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

重復步驟(3)(4)，對保護谷氨酸進行偶聯，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(7)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

重復步驟(3)(4)，對保護谷氨酸進行偶聯，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(8)合成H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

將步驟(7)中得到肽樹脂，加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室溫反應20～40分鐘，抽濾除去溶劑，N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂，脫除9-芴甲氧羰基基團，得到H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(9)合成Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

在H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂中加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N-二異丙基乙胺，按每克樹脂加入20ml二氯甲烷，H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂與乙酸酐、N,N-二異丙基乙胺的質量比為2:4:3。室溫反應30分鐘，抽濾，用N，N-二甲基甲酰胺洗樹脂，得到產物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(10)制備六勝肽

配制肽樹脂切割液：將三異丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水按體積比為6:3:86:5加入到燒杯內攪拌混合；

切割肽樹脂：在步驟(11)肽樹脂中加入切割液，按每克樹脂加入8～10mL切割液，室溫攪拌反應2小時，過濾，濾液傾倒到冷凍的無水乙醚中，攪拌，離心、分離出上清液，室溫減壓烘干，得六勝肽粗品，經反相色譜法純化、濃縮、凍干得純度大于95％的六勝肽。

其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的合成是以Fmoc-Arg(pbf)-OH用哌啶脫除9-芴甲氧羰基后的H-Arg(pbf)-OH與Fmoc-Arg(pbf)-OH的活波酯Fmoc-Arg(pbf)-OSu在堿性環境下反應生成。

本發明有益效果如下：

1.本發明的方法液相合成的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH以單個氨基酸組分的形式，按照經典固相合成法進行偶聯，制得六勝肽產品。該方法既有液相法降低成本、易于放大的優點，又有固相法易于純化、操作簡單的特點，是一種相對理想的六勝肽合成方法。

2.本發明使用液相法分別合成片段A[Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH]，避開了固相合成的常用方法直接偶聯兩個Fmoc-Arg(pbf)-OH較難的情況，Fmoc-Arg(pbf)-OH是常用的固相合成保護氨基酸，但是Fmoc-Arg(pbf)-OH的空間位阻大，如果直接在樹脂上進行縮合連接，產率低下，本發明將片段A[Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH]以單個氨基酸組分的形式，按照經典固相法進行偶聯，制得六勝肽產品，降低了成本，而且同時達到了易于規模化生產目的。

附圖說明

圖1是實施例1合成的六勝肽的質譜圖。

圖2是實施例1合成的六勝肽的液相色譜圖，其中，(a)表示液相色譜圖，(b)表示處理通道。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。

下面對說明書中的簡寫進行說明：

pbf是精氨酸Arg的側鏈氨基保護基，名稱為2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基；

OtBu是谷氨酸Glu的側鏈羧基保護基，名稱為叔丁氧基；

Trt是谷氨酰胺Gln的側鏈酰胺基保護基，名稱為三苯甲基。

Fmoc是Rink-Amide-AM-Resin的氨基保護基團，也是精氨酸Arg、谷氨酸Glu、谷氨酰胺Gln和蛋氨酸Met的側鏈氨基保護基，名稱為9-芴甲氧羰基。

一種六勝肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟

(1)Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin合成；以及(2)氨基酸鏈延長：將步驟(1)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上依次連接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH制備得到六勝肽產品；

其中步驟(1)中所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin是通過片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH制備得到，所述片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH是將H-Arg(pbf)-OH與Fmoc-Arg(pbf)-OSu進行反應合成得到。

上述序列中各個氨基酸選擇的保護基可以是任意保護基，只要能夠達到所希望的可以保護的技術效果即可，但發明人經過優選上述取代基效果最好。選擇H-Arg(pbf)-OH與Fmoc-Arg(pbf)-OSu合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH是發明人對多個因素進行考慮的結果。

在一種具體實施方式中，所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的制備方法是將H-Arg(pbf)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OSu溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入N,N-二異丙基乙胺進行反應，之后加入水、有機酸調節pH 5～6，對其用乙酸乙酯進行萃取分離得到乙酸乙酯相,進行濃縮后,加入乙醚再次進行濃縮，得到產物Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。在該步驟中使用檸檬酸調節pH值，然而任何有機弱酸都能達到相應的技術效果，只要能將pH值調節到5-6，并且不對各種原料和產物有影響即可。加入乙酸乙酯萃取后加入乙醚，能夠純化產品，以提高該產物在下一步反應中的反應活性。

在一種具體實施方式中，其中所述H-Arg(pbf)-OH是通過如下方法合成得到：將Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氫呋喃混合進行反應，反應后將溶劑蒸干，加入水，之后用鹽酸調節PH≈6，固液分離得到固體，干燥得到產物H-Arg(pbf)-OH。優選其中所述鹽酸的濃度是1mol/L；優選所述在用鹽酸調節PH≈6后攪拌15分鐘，再進行過濾；優選地，所述Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氫呋喃之間的比例是每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入0.60ml哌啶、20ml四氫呋喃。其中所述Fmoc-Arg(pbf)-OSu是通過如下方法合成得到：在Fmoc-Arg(pbf)-OH和N-羥基琥珀酰亞胺中加入四氫呋喃和二環己基碳二亞胺進行反應，固液分離得到濾液，即為產物Fmoc-Arg(pbf)-OSu；優選所述Fmoc-Arg(pbf)-OH與N-羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺摩爾比為1：1.5：1.3。

上述制備方法是通過液相法合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH，之后通過固相法進行氨基酸鏈的延長而獲得產品，這是發明人創造性勞動的結果，由于這樣巧妙的應用將成本降低的同時還達到了規模化生產的目的。

其中所述步驟(1)合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin包括如下步驟：

(1)將Rink-Amide-AM-Resin活化；

(2)將活化后的Rink-Amide-AM-Resin加入N，N-二甲基甲酰胺，之后與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺進行反應，得到產物用N，N-二甲基甲酰胺洗滌，得到保護肽樹脂Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin。其中所述Rink-Amide-AM-Resin樹脂與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2:5:5。

在一種優選的具體實施方式中，步驟(2)所述氨基酸鏈延長包括如下步驟：

(1)在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液進行反應，去除溶劑后用N，N-二甲基甲酰胺洗滌得到H₂N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；

(2)將步驟(1)得到的H₂N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺進行反應，之后用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，得到保護肽樹脂Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；

(3)在Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上按照上述步驟(1)和(2)的方法將Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH依次連接得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；

(4)將步驟(3)得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin脫9-芴甲氧羰基得到H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；在H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N-二異丙基乙胺進行反應，經固液分離得到產物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；然后將其加入到切割液中進行切割反應，經分離、純化得到六勝肽產品；

其中，步驟(2)所述Rink-Amide-AM-Resin樹脂與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2:5:5；其中步驟(4)所述H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂與乙酸酐、N,N-二異丙基乙胺的質量比為2:4:3；其中步驟(4)所述切割液是體積比為6:3:86:5的三異丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水的混合溶液，優選切割液的加入量是按每克樹脂加入8～10mL切割液。步驟(4)所述分離、純化是對切割后的反應液進行過濾，濾液傾倒到冷凍的無水乙醚中，攪拌，離心、分離出上清液，室溫減壓烘干，得六勝肽的粗品，經反相色譜法純化、濃縮、凍干得純度大于95％的六勝肽。

該步驟中各個物質的投料量均是以Rink-Amide-AM-Resin作為參比，通過這種控制有助于對投料量的有效控制，保證原料的完全反應，從而達成保持產品品質，同時控制成本的目的。該比例保證了合成的成本最低化，同時純度和工藝達到要求。在制備過程中各個物質之間的比例可以進行適當調節，獲得的產品仍舊能夠滿足要求，因此，對制備過程中的各個物質之間的比例進行適當調整也在本發明的保護范圍內。

實施例

下面對實施例中使用的各個物質的來源進行說明，如果沒有特別說明，所使用的原料和儀器均是商購獲得，是本領域常規使用儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

本發明的Fmoc-Rink Amide AM Resin的取代度為0.90mmol/g，由天津南開和成科技有限公司生產。

分析型高效液相色譜儀為日立全自動L-2000。

制備型高效液相色譜儀為創新恒通LC-3000，C18分析色譜柱為大連物理化學研究所4.6mm×250mm，C18制備色譜柱為成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。

所用各型氨基酸及1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺購自上海吉爾生化有限公司。

LTQ-XL電噴霧電離質譜儀為美國Thermo Finnigan公司。

水為北京愛思泰克科技開發有限責任公司CRS-4-10型純水機制得的純水。

哌啶、四氫呋喃、乙酸乙酯、氯化鈉、鹽酸、N-羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二異丙基乙胺、檸檬酸、三氟乙酸、苯甲硫醚、三異丙基硅烷、無水甲醇等其它試劑均為國產AR或CP。

實施例1

本實施例六勝肽的制備方法包括如下步驟：

(1)液相法合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH

①將10g的Fmoc-Arg(pbf)-OH、200ml四氫呋喃加入茄型瓶中，磁力攪拌，使其全部溶解，加入6ml哌啶，室溫攪拌反應3小時，TLC顯示反應完全后，將溶劑在40℃下旋轉蒸干，加入200ml水，用1mol/L的鹽酸調節PH≈6，攪拌15分鐘，過濾得濾餅，烘干后研磨至粉末，將粉末加入茄型瓶，加入100ml的冰乙醚，磁力攪拌1小時后，過濾得產物為H-Arg(pbf)-OH，稱重6g；

②將10gFmoc-Arg(pbf)-OH、1.57gN-羥基琥珀酰亞胺加入茄型瓶中，加入100ml四氫呋喃中磁力攪拌溶解，再投入2.44g的二環己基碳二亞胺，Fmoc-Arg(pbf)-OH與N-羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺摩爾比為1：1.5：1.3，攪拌反應3小時，TLC顯示反應完全后，過濾得到濾液，產物為Fmoc-Arg(pbf)-OSu，稱重11g；

③將5gH-Arg(pbf)-OH、8.76gFmoc-Arg(pbf)-OSu加入茄型瓶中，溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入5.0ml N,N-二異丙基乙胺，反應2小時，加入500ml的水，用檸檬酸調節PH≈5～6，加入乙酸乙酯，攪拌分層，取乙酸乙酯層，再將乙酸乙酯層用飽和氯化鈉水溶液淋洗2遍，旋轉蒸干溶劑，蒸干后，再加入乙醚攪拌后，再蒸干，加入乙醚，攪拌過濾，得到固體產物，產物為Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH，稱重11g。

(2)樹脂活化

將1g Rink-Amide-AM-resin樹脂加入反應器中，加入10mL N，N-二甲基甲酰胺，室溫攪拌浸泡30分鐘使其充分溶脹活化；

(3)合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

在步驟(2)的活化樹脂中加入10ml N，N-二甲基甲酰胺，室溫攪拌，加入步驟(1)制得Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺，Rink-Amide-AM-Resin樹脂與Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH(1.9g)、1-羥基苯并三唑(0.62g)、N,N-二異丙基碳二亞胺(0.85ml)的摩爾比為1:2:5:5，室溫攪拌反應3～5小時，用N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂兩次，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(4)合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

在步驟(3)合成的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂中加入10ml哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室溫反應40分鐘，抽濾除去溶劑，用N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂兩次，得H₂N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羥基苯并三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺，Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂與Fmoc-Gln(Trt)-OH(1.1g)、1-羥基苯并三唑(0.62g)、N,N-二異丙基碳二亞胺(0.85ml)的摩爾比為1:2:5:5，室溫攪拌反應3～5小時，用N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂兩次，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(5)合成Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

重復步驟(3)(4)，對保護蛋氨酸進行偶聯，Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂與Fmoc-Met-OH(0.67g)、1-羥基苯并三唑(0.62g)、N,N-二異丙基碳二亞胺(0.85ml)的摩爾比為1:2:5:5，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(6)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

重復步驟(3)(4)，對保護谷氨酸進行偶聯，Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂與Fmoc-Glu(OtBu)-OH(0.77g)、1-羥基苯并三唑(0.62g)、N,N-二異丙基碳二亞胺(0.85ml)的摩爾比為1:2:5:5，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(7)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

重復步驟(3)(4)，對保護谷氨酸進行偶聯，Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂與Fmoc-Glu(OtBu)-OH(0.77g)、1-羥基苯并三唑(0.62g)、N,N-二異丙基碳二亞胺(0.85ml)的摩爾比為1:2:5:5，得到保護肽樹脂，序列為Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(8)合成H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

將步驟(7)中得到肽樹脂中加入20ml哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室溫反應40分鐘，抽濾除去溶劑，用N，N-二甲基甲酰胺清洗樹脂二次，脫除9-芴甲氧羰基保護基團，得到H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂；

(9)合成Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂

在步驟(8)中得到的肽樹脂中加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N-二異丙基乙胺，H₂N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂與3.7ml乙酸酐、1.8ml N,N-二異丙基乙胺的質量比為2:4:3。室溫反應30分鐘，抽濾，用N，N-二甲基甲酰胺洗樹脂三次，無水甲醇洗滌三次，減壓干燥，得到產物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽樹脂，稱重2.2g；

(10)制備六勝肽

配制肽樹脂切割液：將三異丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水按體積比為6:3:86:5加入到燒杯內攪拌混合；

切割肽樹脂：在步驟(9)肽樹脂中加入10mL切割液，室溫攪拌反應2小時，過濾，濾液傾倒到冷凍的100ml無水乙醚中，攪拌，離心、分離出上清液，室溫減壓烘干，得六勝肽粗品，經反相色譜法純化、濃縮、凍干得到六勝肽0.45g，純度95％。

采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，結果見圖1。由圖1可見，所合成的產物的分子量及分子離子峰與六勝肽的分子量及分子離子峰一致，說明合成產物為六勝肽。采用液相色譜儀對合成的六勝肽進行純度測定，液相色譜圖見圖2(a)，結合圖2(b)可見，六勝肽的純度大于95％。