脯組環二肽的合成方法與流程

本發明屬于多肽合成技術領域，具體地，本發明涉及一種脯組環二肽的合成方法。

背景技術：

組氨酸-脯氨酸環二肽(Cyclo(His-Pro)，簡稱CHP，脯組環二肽)是一類活性肽類物質，具體為內源性環狀二肽，分布極為廣泛，人，猴，狗，貓，大鼠及蛙體內均有其存在，在生物體內是由促甲狀腺素釋放激素(TRH)經焦谷氨酸氨肽酶水解脫去焦谷氨酸后環化而成。脯組環二肽具有多方面的生物學活性，近些年研究表明，有很好的降低血糖作用，有望成為藥物投入市場。

申請號為200510109439.9的中國發明專利申請公開了一種制備脯組環二肽的方法，該方法具體是脯氨酸甲酯與保護的組氨酸在二環己基碳二亞胺的作用下生成保護的脯組二肽甲酯，然后在氯化氫的乙酸乙酯液作用下脫保護生成脯組環二肽。該方法的弊端是保護的脯組二肽甲酯，在氯化氫的乙酸乙酯液溶液中，長時間高溫回流反應，會對產物的光學純度造成不可逆轉的影響。

技術實現要素：

本發明的目的在于針對現有技術的缺陷，提供一種脯組環二肽的合成方法。

本發明提供了一種脯組環二肽的合成方法，包括如下步驟：

(1)由組氨酸和脯氨酸制備氨基被保護的脯組二肽甲酯，其中，組氨酸和脯氨酸中的一種是甲酯鹽酸鹽的形式，另一種是氨基被保護的形式；

(2)將步驟(1)制備的氨基被保護的脯組二肽甲酯脫保護并環合成脯組環二肽。

前述的合成方法，在步驟(2)中，將步驟(1)制備的氨基被保護的脯組二肽甲酯在哌啶的四氫呋喃溶液中脫保護并環合成脯組環二肽。

前述的合成方法，氨基被保護的脯組二肽甲酯、四氫呋喃、哌啶的比例是1-4g：25-55ml：0.5-2ml，優選地，氨基被保護的脯組二肽甲酯與哌啶的比例是2g：40ml：1ml。

前述的合成方法，在步驟(1)中，由組氨酸甲酯鹽酸鹽和氨基被保護的脯氨酸制備氨基被保護的脯組二肽甲酯。

前述的合成方法，在步驟(1)中，氨基被芴甲氧羰基保護的脯氨酸與N-羥基琥珀酰亞胺在N,N'-二環己基碳二亞胺的作用下生成活潑酯，再進一步與組氨酸甲酯鹽酸鹽在堿性條件下反應生成氨基被芴甲氧羰基保護的脯組二肽甲酯。

前述的合成方法，氨基被芴甲氧羰基保護的脯氨酸、N-羥基琥珀酰亞胺、N,N'-二環己基碳二亞胺、組氨酸甲酯鹽酸鹽的摩爾比是6-10：8-12：8-12：9-12，優選是8:9:9:9.6。

前述的合成方法，在步驟(1)中，由脯氨酸甲酯鹽酸鹽和氨基被保護的組氨酸制備氨基被保護的脯組二肽甲酯。

前述的合成方法，在步驟(1)中，氨基被芴甲氧羰基保護的組氨酸與N-羥基琥珀酰亞胺在N,N'-二環己基碳二亞胺的作用下生成活潑酯，再進一步與脯氨酸甲酯鹽酸鹽在堿性條件下反應生成氨基被芴甲氧羰基保護的脯組二肽甲酯。

前述的合成方法，氨基被芴甲氧羰基保護的組氨酸、N-羥基琥珀酰亞胺、N,N'-二環己基碳二亞胺、脯氨酸甲酯鹽酸鹽的摩爾比是6-10：8-12：8-12：9-12，優選是8:9:9:9.6。

前述的合成方法，所述脯組環二肽是L-L型脯組環二肽、L-D型脯組環二肽、D-L型脯組環二肽、D-D型脯組環二肽。

相對于現有技術，本發明提供的脯組環二肽的合成方法具有如下優點：

(1)使用氨基被保護的脯氨酸或組氨酸為起始原料合成脯組環二肽，最后在哌啶的四氫呋喃溶液中脫保護和環合一次性完成，避免了以往工藝中脫保護和環合必須兩步才能完成的缺陷。

(2)在堿性環境中常溫反應完成，避免了以往工藝在高溫和酸性環境的條件下環合造成的光學純度發生改變的缺陷。

附圖說明

圖1是本發明第一種具體實施方式的L-L型脯組環二肽的¹H NMR圖。

圖2是本發明第一種具體實施方式的L-L型脯組環二肽的質譜圖。

圖3是本發明第二種具體實施方式的L-L型脯組環二肽的¹H NMR圖。

圖4是本發明第二種具體實施方式的L-L型脯組環二肽的質譜圖。

具體實施方式

為充分了解本發明之目的、特征及功效，借由下述具體的實施方式，對本發明做詳細說明。

現有的脯組環二肽的合成方法普通存在反應條件苛刻、步驟冗長、光學純度損失大且收率不高的問題，針對這些問題，本發明提出了一條新的合成路線，采用液相合成法制備脯組環二肽。相較于現有的方法，本發明的方法合成步驟少，氨基酸無需太多保護，只需要起始氨基酸中的一種的氨基被保護，反應條件溫和，易操作，光學純度不損失，收率也很高，達到80％。

本發明的方法包括由組氨酸甲酯鹽酸鹽和氨基被保護的脯氨酸，或者，由脯氨酸甲酯鹽酸鹽和氨基被保護的組氨酸，來制備氨基被保護的脯組二肽甲酯，以及氨基被保護的脯組二肽甲酯脫保護并環合成脯組環二肽。

根據本發明的第一種具體實施方式，本發明的脯組環二肽合成方法包括如下步驟：

(1)制備氨基被保護的脯組二肽甲酯

由組氨酸甲酯鹽酸鹽和氨基被保護的脯氨酸制備氨基被保護的脯組二肽甲酯。具體地，氨基被芴甲氧羰基保護的脯氨酸與N-羥基琥珀酰亞胺在N,N'-二環己基碳二亞胺的作用下生成活潑酯，再進一步與組氨酸甲酯鹽酸鹽在堿性條件(例如，NaHCO₃存在下)下反應生成氨基被芴甲氧羰基保護的脯組二肽甲酯。

其中，氨基被芴甲氧羰基保護的脯氨酸、N-羥基琥珀酰亞胺、N,N'-二環己基碳二亞胺、組氨酸甲酯鹽酸鹽的摩爾比是6-10：8-12：8-12：9-12，優選是8:9:9:9.6。

(2)脫保護與環合

將上述制備的氨基被芴甲氧羰基保護的脯組二肽甲酯在哌啶的四氫呋喃溶液中在室溫下(例如25℃)脫保護并環合成脯組環二肽。

其中，氨基被芴甲氧羰基保護的脯組二肽甲酯四氫呋喃、哌啶的比例是1-4g：25-55ml：0.5-2ml，優選地，氨基被保護的脯組二肽甲酯與哌啶的比例是2g：40ml：1ml。

在各步驟中控制各個物質之間的配料比在上述范圍內，這是發明人對各個步驟的制備方法配料比經過多個因素的考慮得到的結果，在上述保護范圍內進行上下10％的浮動依然可以達到所述的技術效果。優選技術方案如上。

本發明的方法合成的脯組環二肽可以是L-L型脯組環二肽、L-D型脯組環二肽、D-L型脯組環二肽、D-D型脯組環二肽。其中，L-L型脯組環二肽的起始原料為L構型的組氨酸甲酯鹽酸鹽和L構型的N-芴甲氧羰基-脯氨酸；L-D型脯組環二肽的起始原料為L構型的組氨酸甲酯鹽酸鹽和D構型的N-芴甲氧羰基-脯氨酸；D-L型脯組環二肽的起始原料為D構型的組氨酸甲酯鹽酸鹽和L構型的N-芴甲氧羰基-脯氨酸；D-D型脯組環二肽的起始原料為D構型的組氨酸甲酯鹽酸鹽和D構型的N-芴甲氧羰基-脯氨酸。圖1和圖2分別是L-L型脯組環二肽的¹H NMR圖和質譜圖。

根據本發明的第二種具體實施方式，本發明的脯組環二肽合成方法包括如下步驟：

(1)制備氨基被保護的脯組二肽甲酯

由脯氨酸甲酯鹽酸鹽和氨基被保護的組氨酸制備氨基被保護的脯組二肽甲酯。具體地，氨基被芴甲氧羰基保護的組氨酸與N-羥基琥珀酰亞胺在N,N'-二環己基碳二亞胺的作用下生成活潑酯，再進一步與脯氨酸甲酯鹽酸鹽在堿性條件下反應生成氨基被芴甲氧羰基保護的脯組二肽甲酯。

其中，氨基被芴甲氧羰基保護的組氨酸、N-羥基琥珀酰亞胺、N,N'-二環己基碳二亞胺、脯氨酸甲酯鹽酸鹽的摩爾比是6-10：8-12：8-12：9-12，優選是8:9:9:9.6。

(2)脫保護與環合

將上述制備的氨基被芴甲氧羰基保護的脯組二肽甲酯在哌啶的四氫呋喃溶液中在室溫下(例如25℃)脫保護并環合成脯組環二肽。

其中，氨基被芴甲氧羰基保護的脯組二肽甲酯四氫呋喃、哌啶的比例是1-4g：25-55ml：0.5-2ml，優選地，氨基被保護的脯組二肽甲酯與哌啶的比例是2g：40ml：1ml。

在各步驟中控制各個物質之間的配料比在上述范圍內，這是發明人對各個步驟的制備方法配料比經過多個因素的考慮得到的結果，在上述保護范圍內進行上下10％的浮動依然可以達到所述的技術效果。優選技術方案如上。

本發明的方法合成的脯組環二肽可以是L-L型脯組環二肽、L-D型脯組環二肽、D-L型脯組環二肽、D-D型脯組環二肽。其中，L-L型脯組環二肽的起始原料為L構型的脯氨酸甲酯鹽酸鹽和L構型的N-芴甲氧羰基-組氨酸；L-D型脯組環二肽的起始原料為L構型的脯氨酸甲酯鹽酸鹽和D構型的N-芴甲氧羰基-組氨酸；D-L型脯組環二肽的起始原料為D構型的脯氨酸甲酯鹽酸鹽和L構型的N-芴甲氧羰基-組氨酸；D-D型脯組環二肽的起始原料為D構型的脯氨酸甲酯鹽酸鹽和D構型的N-芴甲氧羰基-組氨酸。圖3和圖4分別是L-L型脯組環二肽的¹H NMR圖和質譜圖。

實施例

下面實施例中使用的各個物質如果沒有特別說明，所使用的原料和儀器均是商購獲得，是本領域常規使用儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

下面對說明書中的簡寫進行說明：

Fmoc：芴甲氧羰基

THF：四氫呋喃

HOSu：N-羥基琥珀酰亞胺

DCC：N,N'-二環己基碳二亞胺

His：組氨酸

Pro：脯氨酸

TLC：薄層色譜

實施例1 L-L型脯組環二肽

1.將Fmoc-L-Pro-OH(30g，0.08mol)，500mlTHF加入到茄型瓶中，磁力攪拌，攪拌使其全部溶解，在依次加入HOSu(10.2g，0.09mol)，DCC(18.3g，0.09mol)，常溫攪拌一晚上，出現大量白色沉淀，過濾，取濾液，加THF補足500ml體積，常溫下攪拌，分別向濾液中加入L-H-His-OCH₃.2HCl(23g，0.096mol)，NaHCO₃(30g，0.36mol),H₂O150ml,常溫攪拌一晚上，TLC顯示反應完全，處理，蒸干THF，加入乙酸乙酯和水，攪拌，分層，取乙酯層，水層用乙酯萃取一次，倒掉，合并乙酯層，乙酯層用稀鹽酸水溶液洗2遍除去過量的H-His-OCH₃，在用鹽水洗3遍，水溶液呈中性，乙酯層干燥過濾蒸干，得到白色泡沫狀固體產物Fmoc-Pro-His-OCH₃31g。

2.將Fmoc-Pro-His-OCH₃ 20g，加入400mlTHF溶解，在加入10ml哌啶，常溫下攪拌6小時，TLC顯示反應完全，蒸干溶劑，加入乙醚，攪拌，過濾，得白色固體產物L-L型脯組環二肽8.2g，經質譜以及核磁共振氫譜測定，證明所得產物正確。

實施例2 L-D型脯組環二肽

1.將Fmoc-L-Pro-OH(30g，0.08mol)，500mlTHF加入到茄型瓶中，磁力攪拌，攪拌使其全部溶解，在依次加入HOSu(10.2g，0.09mol),DCC(18.3g，0.09mol)，常溫攪拌一晚上，出現大量白色沉淀，過濾，取濾液，加THF補足500ml體積，常溫下攪拌，分別向濾液中加入D-H-His-OCH₃.2HCl((23g，0.096mol)，NaHCO₃(30g，0.36mol)，H₂O150ml,常溫攪拌一晚上，TLC顯示反應完全，處理，蒸干THF，加入乙酸乙酯和水，攪拌，分層，取乙酯層，水層用乙酯萃取一次，倒掉，合并乙酯層，乙酯層用稀鹽酸水溶液洗2遍除去過量的H-His-OCH₃，在用鹽水洗3遍，水溶液呈中性，乙酯層干燥過濾蒸干，得到白色泡沫狀固體產物Fmoc-Pro-His-OCH₃30g。

2.將Fmoc-Pro-His-OCH₃ 20g，加入400mlTHF溶解，在加入10ml哌啶，常溫下攪拌6小時，TLC顯示反應完全，蒸干溶劑，加入乙醚,，攪拌，過濾，得白色固體產物L-D型脯組環二肽8.1g，經質譜以及核磁共振氫譜測定，證明所得產物正確。

實施例3 D-D型脯組環二肽

1.將Fmoc-D-Pro-OH(27g，0.08mol)，500mlTHF加入到茄型瓶中，磁力攪拌，攪拌使其全部溶解,在依次加入HOSu(10.2g，0.09mol),DCC(18.3g，0.09mol)，常溫攪拌一晚上，出現大量白色沉淀，過濾，取濾液，加THF補足500ml體積，常溫下攪拌，分別向濾液中加入D-H-His-OCH₃.2HCl((23g，0.096mol)，NaHCO₃(30g，0.36mol)，H₂O150ml,常溫攪拌一晚上，TLC顯示反應完全，處理，蒸干THF，加入乙酸乙酯和水，攪拌，分層，取乙酯層，水層用乙酯萃取一次，倒掉，合并乙酯層，乙酯層用稀鹽酸水溶液洗2遍除去過量的H-His-OCH₃，在用鹽水洗3遍，水溶液呈中性，乙酯層干燥過濾蒸干，得到白色泡沫狀固體產物Fmoc-Pro-His-OCH₃33g。

2.將Fmoc-Pro-His-OCH₃ 20g，加入400mlTHF溶解，在加入10ml哌啶，常溫下攪拌6小時，TLC顯示反應完全，蒸干溶劑，加入乙醚，攪拌，過濾，得白色固體產物D-D-型脯組環二肽8.4g,經質譜以及核磁共振氫譜測定，證明所得產物正確。

實施例4 D-L型脯組環二肽

1.將Fmoc-D-Pro-OH(30g，0.08mol)，500mlTHF加入到茄型瓶中，磁力攪拌，攪拌使其全部溶解,在依次加入HOSu(10.2g，0.09mol)，DCC(18.3g，0.09mol)，常溫攪拌一晚上，出現大量白色沉淀，過濾，取濾液，加THF補足500ml體積，常溫下攪拌，分別向濾液中加入L-H-His-OCH₃.2HCl(23g，0.096mol)，NaHCO3(30g，0.36mol)，H₂O150ml，常溫攪拌一晚上，TLC顯示反應完全，處理，蒸干THF，加入乙酸乙酯和水，攪拌，分層，取乙酯層，水層用乙酯萃取一次，倒掉，合并乙酯層，乙酯層用稀鹽酸水溶液洗2遍除去過量的H-His-OCH₃，在用鹽水洗3遍，水溶液呈中性，乙酯層干燥過濾蒸干，得到白色泡沫狀固體產物Fmoc-Pro-His-OCH₃31g。

2.將Fmoc-Pro-His-OCH₃ 20g，加入400mlTHF溶解，在加入10ml哌啶，常溫下攪拌6小時，TLC顯示反應完全，蒸干溶劑，加入乙醚，攪拌，過濾，得白色固體產物D-L-型脯組環二肽8.3g,經質譜以及核磁共振氫譜測定，證明所得產物正確。

實施例5 L-L型脯組環二肽

1.將Fmoc-L-His-OH(30g，0.08mol)，500mlTHF加入到茄型瓶中，磁力攪拌，攪拌使其全部溶解,在依次加入HOSu(10.2g，0.09mol)，DCC(18.3g，0.09mol)，常溫攪拌一晚上，出現大量白色沉淀，過濾，取濾液，加THF補足500ml體積，常溫下攪拌，分別向濾液中加入L-H-Pro-OCH₃.HCl(16g，0.096mol)，NaHCO₃(20g，0.24mol)，H₂O150ml，常溫攪拌一晚上，TLC顯示反應完全，處理，蒸干THF，加入乙酸乙酯和水，攪拌，分層，取乙酯層，水層用乙酯萃取一次，倒掉，合并乙酯層，乙酯層用稀鹽酸水溶液洗2遍除去過量的H-Pro-OCH₃，在用鹽水洗3遍，水溶液呈中性，乙酯層干燥過濾蒸干，得到白色泡沫狀固體產物Fmoc-His-Pro-OCH₃ 33g。

2.將Fmoc-His-Pro-OCH₃ 20g，加入400mlTHF溶解，在加入10ml哌啶，常溫下攪拌6小時，TLC顯示反應完全，蒸干溶劑，加入乙醚，攪拌，過濾，得白色固體產物L-L型脯組環二肽8g，經質譜以及核磁共振氫譜測定，證明所得產物正確。

實施例6 L-D型脯組環二肽

1.將Fmoc-L-His-OH(30g，0.08mol)，500mlTHF加入到茄型瓶中，磁力攪拌，攪拌使其全部溶解，在依次加入HOSu(10.2g，0.09mol)，DCC(18.3g，0.09mol)，常溫攪拌一晚上，出現大量白色沉淀，過濾，取濾液，加THF補足500ml體積，常溫下攪拌，分別向濾液中加入D-H-Pro-OCH₃.HCl(16g，0.096mol)，NaHCO₃(20g，0.24mol)，H₂O150ml，常溫攪拌一晚上，TLC顯示反應完全，處理，蒸干THF，加入乙酸乙酯和水，攪拌，分層，取乙酯層，水層用乙酯萃取一次，倒掉，合并乙酯層，乙酯層用稀鹽酸水溶液洗2遍除去過量的H-Pro-OCH₃，在用鹽水洗3遍，水溶液呈中性，乙酯層干燥過濾蒸干，得到白色泡沫狀固體產物Fmoc-His-Pro-OCH₃ 32g。

2.將Fmoc-His-Pro-OCH₃ 20g，加入400mlTHF溶解，在加入10ml哌啶，常溫下攪拌6小時，TLC顯示反應完全，蒸干溶劑，加入乙醚，攪拌，過濾，得白色固體產物L-D型脯組環二肽8.3g，經質譜以及核磁共振氫譜測定，證明所得產物正確。

實施例7 D-D型脯組環二肽

1.將Fmoc-D-His-OH(30g，0.08mol)，500mlTHF加入到茄型瓶中，磁力攪拌，攪拌使其全部溶解,在依次加入HOSu(10.2g，0.09mol)，DCC(18.3g，0.09mol)，常溫攪拌一晚上，出現大量白色沉淀，過濾，取濾液，加THF補足500ml體積，常溫下攪拌，分別向濾液中加入D-H-Pro-OCH₃.HCl(16g，0.096mol)，NaHCO₃(20g，0.24mol)，H₂O150ml,常溫攪拌一晚上，TLC顯示反應完全，處理，蒸干THF，加入乙酸乙酯和水，攪拌，分層，取乙酯層，水層用乙酯萃取一次，倒掉，合并乙酯層，乙酯層用稀鹽酸水溶液洗2遍除去過量的H-Pro-OCH₃，在用鹽水洗3遍，水溶液呈中性，乙酯層干燥過濾蒸干，得到白色泡沫狀固體產物Fmoc-His-Pro-OCH₃ 35g.

2.將Fmoc-His-Pro-OCH₃ 20g，加入400mlTHF溶解，在加入10ml哌啶，常溫下攪拌6小時，TLC顯示反應完全，蒸干溶劑，加入乙醚，攪拌，過濾，得白色固體產物D-D-型脯組環二肽8.8g，經質譜以及核磁共振氫譜測定，證明所得產物正確。

實施例8 D-L型脯組環二肽

1.將Fmoc-D-His-OH(30g，0.08mol)，500mlTHF加入到茄型瓶中，磁力攪拌，攪拌使其全部溶解,在依次加入HOSu(10.2g，0.09mol)，DCC(18.3g，0.09mol)，常溫攪拌一晚上，出現大量白色沉淀，過濾，取濾液，加THF補足500ml體積，常溫下攪拌，分別向濾液中加入L-H-Pro-OCH₃.HCl(16g，0.096mol)，NaHCO₃(20g，0.24mol)，H₂O150ml，常溫攪拌一晚上，TLC顯示反應完全，處理，蒸干THF，加入乙酸乙酯和水，攪拌，分層，取乙酯層，水層用乙酯萃取一次，倒掉，合并乙酯層，乙酯層用稀鹽酸水溶液洗2遍除去過量的H-Pro-OCH₃，在用鹽水洗3遍，水溶液呈中性，乙酯層干燥過濾蒸干，得到白色泡沫狀固體產物Fmoc-His-Pro-OCH₃ 34g。

2.將Fmoc-His-Pro-OCH₃ 20g，加入400mlTHF溶解，在加入10ml哌啶，常溫下攪拌6小時，TLC顯示反應完全，蒸干溶劑，加入乙醚，攪拌，過濾，得白色固體產物D-L-型脯組環二肽8.6g，經質譜以及核磁共振氫譜測定，證明所得產物正確。