一種從棉子糖乳球菌次級代謝物中分離活性化合物的方法與流程

本發明涉及一種從棉子糖乳球菌次級代謝物中分離活性化合物的方法，屬于生物領域。
背景技術：
：天然產物是藥物先導化合物發現的重要來源，近年來，越來越多的天然產物化學家把目光投向生物種類更加多樣的微生物。本發明從一株棉子糖乳球菌次級代謝物中分離出一種活性化合物，并通過優化培養條件，可以高效生產該化合物，成本低。經鑒定，該活性化合物具有顯著的降血脂作用，還具有美白作用。技術實現要素：本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出從一株棉子糖乳球菌次級代謝物中分離出一種活性化合物，并通過優化培養條件，可以高效生產該化合物，成本低。經鑒定，該活性化合物具有顯著的降血脂作用，還具有美白作用。本發明人從廣東微生物保藏中心購得一株棉子糖乳球菌，其編號為：GIM1.1015，根據保藏中心的記載，該菌株的其他編號為：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。對該株棉子糖乳球菌進行培養，在MRS液體培養基中培養24-72h，共發酵100L。過濾、濃縮后得到水相10L，用乙酸乙酯進行萃取，減壓濃縮后得到乙酸乙酯層浸膏20g，經300目硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脫，合并相同組分，各組分再經反復硅膠層析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色譜分離純化以及C18高效液相制備得兩種化合物，1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)經鑒定，化合物1的結構式為：本發明人還驚訝地發現，該活性化合物具有顯著的降血脂作用，還具有美白作用。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。本發明的有益之處在于：本發明從一株棉子糖乳球菌次級代謝物中分離出一種活性化合物，并通過優化培養條件，可以高效生產該化合物，成本低。經鑒定，該活性化合物具有顯著的降血脂作用，還具有美白作用。附圖說明圖1為黑色素代謝原理圖。具體實施方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例1：本發明人從廣東微生物保藏中心購得一株棉子糖乳球菌，其編號為：GIM1.1015，根據保藏中心的記載，該菌株的其他編號為：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。對該株棉子糖乳球菌進行培養，在MRS液體培養基中培養24-72h，共發酵100L。過濾、濃縮后得到水相10L，用乙酸乙酯進行萃取，減壓濃縮后得到乙酸乙酯層浸膏20g，經300目硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脫，合并相同組分，各組分再經反復硅膠層析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色譜分離純化以及C18高效液相制備得兩種化合物，化合物1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)經鑒定，化合物1為淡黃色粉末，溶于二氯甲烷，分子式為C13H14O3；mp.60攝氏度，化合物1的結構式為：其核譜數據如下所示：經檢索核實，和已知文獻報告過的化合物一致(天然產物研究與開發NatProdResDev2014，26:159-161)，但是該文獻沒有對該化合物的功能進行研究。實施例2：本發明人對實施例1的發酵方法進行改進，發現可以大幅提高該化合物的產量，為低成本工業化生產提供了可能性。本發明基于如下發現：特定濃度范圍的甘草查爾酮B配合特定的溫度曲線，可以令人驚訝地大幅提高該化合物的產量。甘草查爾酮B購自上海麗臣公司，純度＞98％。從廣東微生物保藏中心購得一株棉子糖乳球菌，其編號為：GIM1.1015，根據保藏中心的記載，該菌株的其他編號為：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。對該株棉子糖乳球菌進行培養，接種進modified-MRS液體培養基中培養48h：前18h保持35攝氏度；第19-22h保持18攝氏度，第23-48h保持30攝氏度培養；所述modified-MRS液體培養基為MRS+0.002％甘草查爾酮B，共發酵100L。過濾、濃縮后得到水相10L，用乙酸乙酯進行萃取，減壓濃縮后得到乙酸乙酯層浸膏20g，經300目硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脫，合并相同組分，各組分再經反復硅膠層析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色譜分離純化以及C18高效液相制備得兩種化合物，化合物1(36.8mg)、化合物2(8.1mg)。實施例3：法尼酯X受體(FXR)是一種核受體，在體內與配體結合后，通過激活下游靶基因的轉錄對體內生理過程產生廣泛的調節作用，其中最重要的是維持體內膽汁酸和膽固醇的穩態。另外它還能夠調節糖類和脂質代謝。目前已有兩個以FXR為靶標的小分子化合物進入三期臨床，用于治療原發性膽汁酸性肝硬化和高血脂癥。另外，研究表明治療2型糖尿病的藥物曲格列酮也是一種FXR拮抗劑【參見：Kaimal,R.；Song,X.；Yan,B.；King,R.；Deng,R.DifferentialmodulationoffarnesoidXreceptorsignalingpathwaybythethiazolidinediones[J].J.Pharmacol.Exp.Ther.2009,330,125-134】。因此，作用于FXR的小分子化合物有望被開發成為治療代謝性疾病的藥物。化合物的濃度分別為1μM,5μM，所用的細胞系是293T細胞。取對數期293T細胞以25,000/孔接種至96孔板。過夜培養后，表達載體pCMV-GAL4-DBD-hFXR-LBD(5ng/孔)，pFR-Luciferase報告基因(25ng/孔)以及Renilla-Luciferase(RL)質粒(5ng/孔)，按照0.25μL/孔的Lipofectamine進行瞬時轉染。轉染18小時后，用含有CDCA(25μM)的0.5％活性炭處理的FBS的MEM培養液，然后加入5μM化合物1。繼續培養24小時后，根據Dual-Luciferase報告基因說明書檢測Luciferase酶活性。以RL酶活性為內參。化合物1的FXR拮抗活性如下表所示：Antagonistrate(％)1μM22.75μM93.8這表明，細胞轉染和熒光報告實驗表明化合物1在5μM濃度下，能夠對CDCA(鵝去氧膽酸，FXR內源性配體)誘導的法尼酯X受體激活產生強烈的拮抗作用。實施例4：對KKay糖尿病小鼠血脂的的調節作用藥效學實驗：通過體內實驗確證了化合物1能夠顯著降低糖尿病模型小鼠的甘油三酯水平。實驗所使用的動物模型是自發性2型糖尿病KKay小鼠，雌性(購于中國醫學科學院動物中心)。依據胰島素耐量實驗，按空腹血糖、體重、血漿甘油三酯和膽固醇水平隨機分為2組，分別為模型對照組(Con)、f給藥組(50mg/kg)。每天灌胃給藥一次，連續給藥21天后測定血脂水平。給藥組的血漿甘油三酯水平較對照組下降28.3％(p<0.05)。動物實驗結果表明化合物1能夠顯著降低糖尿病小鼠的甘油三酯水平，具有開發成抗糖尿病藥物的潛力。具體數據如下所示：甘油三酯(mg/dl)Con328.2±22.3f236.7±31.2可見，通過體內實驗確證了化合物1能夠顯著降低糖尿病模型小鼠的甘油三酯水平，具有開發成抗糖尿病藥物的潛力。實施例5：黑色素為高分子生物色素，主要由2種醌型的聚合物組成，分別是真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)。黑色素的生物合成首次由Raper和Mason闡明，近年來Cooksey和Schallreuter對其進行了完善。皮膚黑色素的形成過程包括黑色素細胞的遷移、分裂成熟、黑色素小體(melanosome)的形成、黑色素顆粒的轉運以及黑色素的排泄等一系列生制生化過程，黑色素的合成過程過程如附圖所示。黑色素的合成必須有3種物質參與：合成黑色素的主要原料酪氨酸(tyrosine，Tyr)；催化酪氨酸轉變為黑色素的主要限速酶酪氨酸酶(tyrosinase，Tyr)以及參與此催化過程的氧元素①在酪氨酸酶的催化作用下，酪氨酸被氧化為多巴醌；②多巴醌自動氧化生成多巴和多巴色素，多巴也是酪氨酸酶的底物，它被催化后再次生成多巴醌。③多巴色素的反應產物5，6-二羥基吲哚(DHI)和5，6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)經一系列的氧化反應生成真黑素，其為皮膚的色素主要組分。④在半胱氨酸或者谷胱甘肽存在的條件下，多巴醌會轉變成半胱氨酰多巴，最后生成褐黑素，目前褐黑素在皮膚中的功能尚無文獻報道。具有以上6種作用機制的化合物中，只有特異性的酪氨酸酶滅活劑和特異性的酪氨酸酶抑制劑能直接作用于酪氨酸酶，它們的抑制作用相對較強，而其他幾類化合物都是間接作用于酪氨酸酶，抑制作用相對較弱。酪氨酸酶抑制劑根據抑制類型可分為競爭性抑制劑、非競爭性抑制劑和混合型(競爭性/非競爭性)抑制劑3類。酪氨酸酶是一種多活性酶，實驗原理是通過測定催化多巴氧化成多巴醌過程中的多巴化酶活性求得酪氨酸酶的抑制效果。在96孔細胞培養板上以密度為3×104細胞/孔接種人黑色素細胞懸液培養24h，用PBS洗滌細胞兩次，再加入含有曲通100的PBS溶液，添加L-多巴和待測物多巴。繼續培養1h后，計算反應前后的475nmA的差值，結果除以細胞數，作為評價酪氨酸酶活性高低的指標。結果以半數抑制量IC50表示，結果越小，表明美白物質的抑制作用越大。經測定，化合物1的IC50為8.3μM。可見，化合物1具有很好的酪氨酸酶抑制性能，是具有潛力的美白產品。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。當前第1頁1 2 3