一種助表達序列及其無細胞表達ADCY2蛋白系統(tǒng)的制作方法

本發(fā)明涉及無細胞表達領(lǐng)域，具體涉及一種助表達序列及其無細胞表達ADCY2蛋白系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

結(jié)構(gòu)和功能分析需要大量的膜蛋白樣本，但是一個瓶頸是如何大批量高效的獲得膜蛋白。在無細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白復雜性降低帶來了轉(zhuǎn)錄翻譯流程的高效運轉(zhuǎn)。采用助表達序列的策略可以基于翻譯起始的優(yōu)化帶來無細胞表達效率的快速提高。高頻使用稀有密碼子以及不利起始翻譯已被確定為蛋白質(zhì)生物合成的主要限制步驟，在mRNA的5'端區(qū)域，如核糖體結(jié)合位點涉及高風險的二級結(jié)構(gòu)的形成可以減緩甚至阻止啟動程序，高頻的稀有密碼子可能造成翻譯停頓，錯配的氨基酸，甚至過早終止事件，但這樣的問題可以由合成基因表達的優(yōu)化來解決。

腺苷酸環(huán)化酶，簡稱ADCY，是膜整合蛋白，12次跨膜糖蛋白，是G蛋白的效應物，能催化ATP生成cAMP，引起細胞應答。腺苷酸環(huán)化酶廣泛分布于哺乳動物的細胞膜中，此酶催化ATP生成cAMP并釋放焦磷酸。腺苷酸環(huán)化酶主要分布于細胞質(zhì)膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。腺苷酸環(huán)化酶(ADCY)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)下游的關(guān)鍵信號分子?；旧蠘藴实臒o細胞是無法表達出完整的蛋白分子的，所以需要對無細胞表達條件進行改進。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供助表達序列及其無細胞表達ADCY2蛋白系統(tǒng)，能解決無細胞蛋白表達量低的問題。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種助表達序列及其無細胞表達ADCY2蛋白系統(tǒng)，所述助表達序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示。

作為進一步優(yōu)選的，所述助表達序列主要應用于多次跨膜蛋白的無細胞表達。

本發(fā)明還提供了一種如上述所述的助表達序列的無細胞表達ADCY2蛋白系統(tǒng)，所述表達體系包括如下成分：HEPES-KOH緩沖液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸鉀、醋酸銨、醋酸鎂、亞葉酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大腸桿菌抽提物；將含助表達序列表達質(zhì)粒加入無細胞蛋白表達體系中進行表達。

作為進一步優(yōu)選的，所述表達質(zhì)粒是由將待表達的ADCY2蛋白基因進行密碼子優(yōu)化后與助表達序列的基因和組氨酸標簽進行連接，設計引物并引入雙酶切位點，將連接得到的目的片段克隆到含T7啟動子的表達載體pET28a上獲得；

作為進一步優(yōu)選的，所述ADCY2基因進行密碼子優(yōu)化后的序列如序列表2所示。

作為進一步優(yōu)選的，通過SOE-PCR方法以及平端連接方法在ADCY2基因密碼子優(yōu)化后的片段的N端連接助表達序列的基因片段、C端連接組氨酸標簽。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過在ADCY2基因上添加助表達序列進行無細胞表達，蛋白表達量高，解決了無細胞蛋白表達量低的問題。

附圖說明

圖1為實施例1的ADCY2無細胞表達后的蛋白純化電泳圖；

圖2為對比例1的ADCY2無細胞表達后的蛋白純化電泳圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明做進一步的詳細說明。以下實施例僅是范例性的，僅用以對本發(fā)明的技術(shù)方案做更進一步的詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，在不偏離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍內(nèi)，對技術(shù)方案進行的修改或者替換均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍內(nèi)。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種助表達序列及其無細胞表達ADCY2蛋白系統(tǒng)，所述助表達序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示。

作為進一步優(yōu)選的，所述助表達序列主要應用于多次跨膜蛋白的無細胞表達。

本發(fā)明還提供了一種如上述所述的助表達序列的無細胞表達ADCY2蛋白系統(tǒng)，其特征在于：所述表達體系包括如下成分：HEPES-KOH緩沖液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸鉀、醋酸銨、醋酸鎂、亞葉酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大腸桿菌抽提物；將含助表達序列表達質(zhì)粒加入無細胞蛋白表達體系中進行表達。

作為進一步優(yōu)選的，所述表達質(zhì)粒是由將待表達的ADCY2蛋白基因進行密碼子優(yōu)化后與助表達序列的基因和組氨酸標簽進行連接，設計引物并引入雙酶切位點，將連接得到的目的片段克隆到含T7啟動子的表達載體pET28a上獲得；

作為進一步優(yōu)選的，所述ADCY2基因進行密碼子優(yōu)化后的序列如序列表2所示。

作為進一步優(yōu)選的，通過SOE-PCR方法以及平端連接方法在ADCY2基因密碼子優(yōu)化后的片段的N端連接助表達序列的基因片段、C端連接組氨酸標簽。

ADCY2基因進行密碼子優(yōu)化后的序列如序列表2所示。通過SOE-PCR方法以及平端連接方法在ADCY2基因密碼子優(yōu)化后的片段的N端連接助表達序列的基因片段、C端連接組氨酸標簽，三段序列連接成整個序列，作為PCR反應的模板，ADCY2基因和助表達序列還含有蛋白酶酶切位點序列，所述蛋白酶酶切位點序列為凝血酶酶切位點或腸激酶酶切位點；

設計引入NcoⅠ酶切位點的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’)和引入XhoⅠ酶切位點的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3’)，以連接目的片段為模板，加入DNA聚合酶和10倍的DNA聚合酶緩沖液進行PCR擴增反應，擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，進行DNA純化，純化后的待表達基因片段進行雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，DNA純化試劑盒純化回收，將含酶切位點的待表達基因片段與線性pET28a質(zhì)粒混合，加入T4DNA連接酶、10×T4DNA連接酶緩沖液，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，取陽性克隆菌株進行DNA測序，對經(jīng)測序確證的、含pET28a重組質(zhì)粒的菌落進行質(zhì)粒提純，得到pET28a-ADCY2質(zhì)粒。

所述表達時為半連續(xù)性物質(zhì)交換反應，將表達體系中包括如下反應液成分：57mM HEPES-KOH緩沖液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸鉀、80mM醋酸銨、15mM醋酸鎂、34μg/ml亞葉酸、33μg/ml T7 RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大腸桿菌抽提物；取300μl反應液于透析管中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2質(zhì)粒；供應試劑包括如下成分：57mM HEPES-KOH緩沖液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸鉀、80mM醋酸銨、15mM醋酸鎂、34μg/mL亞葉酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大腸桿菌抽提物；供應試劑裝于離心管中；將裝有反應液的透析管置于離心管中進行無細胞蛋白表達，通過SDS-PAGE來檢測ADCY2的表達情況。

實施例1

1.對ADCY2基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的密碼子序列見序列表2，在密碼子優(yōu)化后序列的ADCY2基因的N段添加助表達序列B-tag(ATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTAT；氨基酸序列為IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCY)，C端添加10×his(絲氨酸)標簽(CATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT；HHHHHHHHHH)，基因合成整個序列，作為基因克隆的模板。

2.取上述合成的含B-tag和10×his標簽目的片段作為PCR反應的模板，設計引入NcoⅠ酶切位點的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’)和引入XhoⅠ酶切位點的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3’)。分別取4.0μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0μL DNA聚合酶(5U/μL)、10μL 10×DNA聚合酶緩沖液、5.0μL dNTP混合作為PCR反應體系。用無菌水將反應液調(diào)至50μL，于95℃條件下預變性處理2min，然后分別在94℃變性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最終72℃終延伸5min，整個PCR反應體系共進行35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，進行DNA純化。純化后的ADCY2片段進行雙酶切，反應體系如下：30μL添加了酶切位點的ADCY2片段、5μL 10×緩沖液、1μL NcoⅠ(20U/μL)、lμL XhoⅠ(20U/μL)，用無菌水將反應液調(diào)至50μL后，于37℃下保溫1h，然后在65℃條件下處理20min進行熱失活。經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，DNA純化試劑盒純化回收。另一方面，將pET28a質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，并進行雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，切下線性質(zhì)粒條帶進行純化回收。

3.pET28a-ADCY2重組表達載體的構(gòu)建：將上述含酶切位點的ADCY2片段與線性pET28a質(zhì)粒按2:1比例、在45℃下保溫5min后，置于冰浴中冷卻，冷卻后分別加入1μL T4 DNA連接酶、2μL 10×T4 DNA連接酶緩沖液，l6℃保溫16h。連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后，挑選3～5個菌落做PCR驗證，進一步進行酶切鑒定，陽性克隆用于DNA測序。對經(jīng)測序確證的、含pET28a-ADCY2重組質(zhì)粒的菌落進行質(zhì)粒提純。

4.無細胞蛋白半連續(xù)反應表達體系的合成，反應液包括如下成分：57mM HEPES-KOH緩沖液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸鉀、80mM醋酸銨、15mM醋酸鎂、34μg/ml亞葉酸、33μg/ml T7RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大腸桿菌抽提物；取300μl反應液于D-Tube^TM透析管中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2質(zhì)粒；取4.5mL供應試劑裝于50mL離心管中，供應試劑包括如下成分：57mM HEPES-KOH緩沖液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸鉀、80mM醋酸銨、15mM醋酸鎂、34μg/mL亞葉酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大腸桿菌抽提物；將裝有反應液的透析管置于離心管中進行無細胞蛋白表達，通過SDS-PAGE來檢測ADCY2的表達情況。

對比例1

1.取含ADCY2基因的克隆片段作為PCR反應的模板，設計引入NcoⅠ酶切位點的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATGTGGCAGGAGGCG-3’)和引入XhoⅠ酶切位點的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGGGATGCCACGTTGCTCTGGG-3’)。分別取4.0μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0μL DNA聚合酶(5U/μL)、10μL 10×DNA聚合酶緩沖液、5.0μL dNTP混合作為PCR反應體系。用無菌水將反應液調(diào)至50μL，于95℃條件下預變性處理2min，然后分別在94℃變性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最終72℃終延伸5min，整個PCR反應體系共進行35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，進行DNA純化。純化后的ADCY2片段進行雙酶切，反應體系如下：30μL添加了酶切位點的ADCY2片段、5μL 10×緩沖液、1μL NcoⅠ(20U/μL)、lμL XhoⅠ(20U/μL)，用無菌水將反應液調(diào)至50μL后，于37℃下保溫1h，然后在65℃條件下處理20min進行熱失活。經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，DNA純化試劑盒純化回收。另一方面，將pET28a質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，并進行雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，切下線性質(zhì)粒條帶進行純化回收。

2.pET28a-ADCY2重組表達載體的構(gòu)建：將上述含酶切位點的ADCY2片段與線性pET28a質(zhì)粒按2:1比例、在45℃下保溫5min后，置于冰浴中冷卻，冷卻后分別加入1μL T4 DNA連接酶、2μL 10×T4 DNA連接酶緩沖液，l6℃保溫16h。連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后，挑選3～5個菌落做PCR驗證，進一步進行酶切鑒定，陽性克隆用于DNA測序。對經(jīng)測序確證的、含pET28a-ADCY2重組質(zhì)粒的菌落進行質(zhì)粒提純。

3.無細胞蛋白半連續(xù)反應表達體系的合成，反應液包括如下成分：57mM HEPES-KOH緩沖液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸鉀、80mM醋酸銨、15mM醋酸鎂、34μg/ml亞葉酸、33μg/ml T7 RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大腸桿菌抽提物；取300μl反應液于D-Tube^TM透析管(3.5kDa)中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2質(zhì)粒；取4.5mL供應試劑裝于50mL離心管中，供應試劑包括如下成分：57mM HEPES-KOH緩沖液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸鉀、80mM醋酸銨、15mM醋酸鎂、34μg/mL亞葉酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大腸桿菌抽提物；將裝有反應液的透析管置于離心管中進行無細胞蛋白表達，通過SDS-PAGE來檢測ADCY2的表達情況。

實施例1的ADCY2無細胞表達后的蛋白純化電泳圖如圖1所示，對比例1的ADCY2無細胞表達后的蛋白純化電泳圖如圖2所示。由圖1和圖2可知，通過添加本發(fā)明的助表達序列后ADCY2無細胞表達明顯，且表達量高。

<110> 武漢華美生物工程有限公司

華, 權(quán)高

<120> 一種助表達序列及其無細胞表達ADCY2蛋白系統(tǒng)

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr

20 25

<210> 2

<211> 3273

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgtggcagg aagctatgcg tcgtcgtcgt tacctgcgtg accgttctga agaagctgct 60

ggtggtggtg acggtctgcc gcgttctcgt gactggctgt acgaatctta ctactgcatg 120

tctcagcagc acccgctgat cgttttcctg ctgctgatcg ttatgggttc ttgcctggct 180

ctgctggctg ttttcttcgc tctgggtctg gaagttgaag accacgttgc tttcctgatc 240

accgttccga ccgctctggc tatcttcttc gctatcttca tcctggtttg catcgaatct 300

gttttcaaaa aactgctgcg tctgttctct ctggttatct ggatctgcct ggttgctatg 360

ggttacctgt tcatgtgctt cggtggtacc gtttctccgt gggaccaggt ttctttcttc 420

ctgttcatca tcttcgttgt ttacaccatg ctgccgttca acatgcgtga cgctatcatc 480

gcttctgttc tgacctcttc ttctcacacc atcgttctgt ctgtttgcct gtctgctacc 540

ccgggtggta aagaacacct ggtttggcag atcctggcta acgttatcat cttcatctgc 600

ggtaacctgg ctggtgctta ccacaaacac ctgatggaac tggctctgca gcagacctac 660

caggacacct gcaactgcat caaatctcgt atcaaactgg aattcgaaaa acgtcagcag 720

gaacgtctgc tgctgtctct gctgccggct cacatcgcta tggaaatgaa agctgaaatc 780

atccagcgtc tgcagggtcc gaaagctggt cagatggaaa acaccaacaa cttccacaac 840

ctgtacgtta aacgtcacac caacgtttct atcctgtacg ctgacatcgt tggtttcacc 900

cgtctggctt ctgactgctc tccgggtgaa ctggttcaca tgctgaacga actgttcggt 960

aaattcgacc agatcgctaa agaaaacgaa tgcatgcgta tcaaaatcct gggtgactgc 1020

tactactgcg tttctggtct gccgatctct ctgccgaacc acgctaaaaa ctgcgttaaa 1080

atgggtctgg acatgtgcga agctatcaaa aaagttcgtg acgctaccgg tgttgacatc 1140

aacatgcgtg ttggtgttca ctctggtaac gttctgtgcg gtgttatcgg tctgcagaaa 1200

tggcagtacg acgtttggtc tcacgacgtt accctggcta accacatgga agctggtggt 1260

gttccgggtc gtgttcacat ctcttctgtt accctggaac acctgaacgg tgcttacaaa 1320

gttgaagaag gtgacggtga catccgtgac ccgtacctga aacagcacct ggttaaaacc 1380

tacttcgtta tcaacccgaa aggtgaacgt cgttctccgc agcacctgtt ccgtccgcgt 1440

cacaccctgg acggtgctaa aatgcgtgct tctgttcgta tgacccgtta cctggaatct 1500

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ggtaaaatct ctaccaccga cgttccgatg ggtcagcaca acttccagaa ccgtaccctg 1620

cgtaccaaat ctcagaaaaa acgtttcgaa gaagaactga acgaacgtat gatccaggct 1680

atcgacggta tcaacgctca gaaacagtgg ctgaaatctg aagacatcca gcgtatctct 1740

ctgctgttct acaacaaagt tctggaaaaa gaataccgtg ctaccgctct gccggctttc 1800

aaatactacg ttacctgcgc ttgcctgatc ttcttctgca tcttcatcgt tcagatcctg 1860

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ctgctgatgt ggctgctgaa atcttctggt atcatcgcta accgtccgtg gccgcgtatc 2040

tctctgacca tcatcaccac cgctatcatc ctgatgatgg ctgttttcaa catgttcttc 2100

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