一種制備重組內參GAPDH抗體的表達載體的構建方法與流程

本發明涉及表達載體技術領域，具體涉及一種制備重組內參GAPDH抗體的表達載體的構建方法。

背景技術：

要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎。特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析。通常會使用內參抗體來檢測實驗系統，或者校準實驗結果。內參即是內部參照(Internal Control)，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發光體系是否正常。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)幾乎在所有組織中都能高水平表達，在同種細胞或者組織中的蛋白質表達量一般是恒定的，且不受含有的部分識別位點、佛波脂等的誘導物質的影響而保持恒定，故被廣泛用作Western blot等實驗操作的標準化的內參。

技術實現要素：

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種制備重組內參GAPDH抗體的表達載體的構建方法，該方法構建的表達載體能夠進行高效表達，以解決GAPDH表達量低的問題。

本發明通過以下技術方案實現：一種制備重組內參GAPDH抗體的表達載體的構建方法，包括以下步驟：

步驟(1)：以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為免疫原對小鼠進行免疫后，提取脾臟總RNA，在兩端序列設計特異性引物，引物序列見核苷酸序列表，分別以引物VH對和引物VL對擴增重鏈可變區和輕鏈可變區；

步驟(2)：將助表達序列的基因、組氨酸標簽基因和β2微球蛋白基因分別連接到重鏈可變區和輕鏈可變區得到目的片段，所述助表達序列的基因序列見序列表1；

步驟(3)：在重鏈可變區的上游和輕鏈可變區下游分別引入雙酶切位點，通過PCR技術將目的片段克隆到載體pFUSEss-CHIg-hG1上，即獲得重組內參GAPDH表達載體。

作為進一步優選的，所述步驟(2)中，通過SOE-PCR方法或平端連接方法將助表達序列的基因連接到重鏈可變區的上游，將組氨酸標簽基因和β2微球蛋白基因連接到輕鏈可變區下游。

作為進一步優選的，所述步驟(3)中，通過PCR技術將目的片段克隆到載體pFUSEss-CHIg-hG1上，將產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，進行菌落PCR，篩選陽性單克隆菌落，提取得到pFUSEss_CHIg重鏈表達質粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達質粒。

本發明的有益效果為：本發明構建的表達載體能夠在系統中進行高效表達，通過重組抗體技術制備表達量高的內參GAPDH抗體，應用于WB(Western Blot)實驗中檢測或校準實驗系統，能避免現有技術中采用多克隆抗體易出現批間差、雜帶較多受樣本質量干擾影響較大、單克隆抗體細胞株容易丟失，丟失后重新制備周期長等問題。

附圖說明

圖1為以實施例1構建的表達載體制備的重組內參GAPDH抗體的WB驗證結果圖；

圖2為以實施例1構建的表達載體制備的重組內參GAPDH抗體的IF驗證結果圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。以下實施例僅是范例性的，僅用以對本發明的技術方案做更進一步的詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，在不偏離本發明技術方案的精神和范圍內，對技術方案進行的修改或者替換均應涵蓋在本發明的權利要求保護范圍內。

本發明的一種制備重組內參GAPDH抗體的表達載體的構建方法，包括以下步驟：

步驟(1)：以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為免疫原對小鼠進行免疫后，提取脾臟總RNA，在兩端序列設計特異性引物，引物序列見核苷酸序列表，分別以引物VH對和引物VL對擴增重鏈可變區和輕鏈可變區；

步驟(2)：將助表達序列的基因、組氨酸標簽基因和β2微球蛋白基因分別連接到重鏈可變區和輕鏈可變區得到目的片段，所述助表達序列的基因序列見序列表1；

步驟(3)：在重鏈可變區的上游和輕鏈可變區下游分別引入雙酶切位點，通過PCR技術將目的片段克隆到載體pFUSEss-CHIg-hG1上，即獲得重組內參GAPDH表達載體。

步驟(2)中，通過SOE-PCR方法或平端連接方法將助表達序列的基因連接到重鏈可變區的上游，將組氨酸標簽基因和β2微球蛋白基因連接到輕鏈可變區下游。β2微球蛋白基因能將不易表達的外源蛋白連接在β2m基因下游，能使外源蛋白高效表達。

步驟(3)中，在重鏈可變區的上游和輕鏈可變區下游分別用內切酶進行雙酶切引入雙酶切位點，載體pFUSEss-CHIg-hG1用同樣的內切酶雙酶切，然后用T4DNA連接酶將載體和目的片段進行連接，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，進行菌落PCR，篩選陽性單克隆菌落，提取得到pFUSEss_CHIg重鏈表達質粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達質粒。

實施例1

本發明的一種制備重組內參GAPDH抗體的表達載體的構建方法，包括以下步驟：

步驟(1)：以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為免疫原對小鼠進行免疫，在取小鼠脾臟前3d加強免疫一次，測定抗血清效價，取效價高的小鼠，提取脾臟總RNA，在兩端序列設計特異性引物，引物序列見核苷酸序列表，分別以引物VH對和引物VL對擴增重鏈可變區和輕鏈可變區；擴增反應條件如下:94℃預變性5min，94℃45s，58℃1min，72℃45s，共進行30個循環，72℃延伸10min；

步驟(2)：通過SOE-PCR方法或平端連接方法將助表達序列的基因連接到重鏈可變區的上游，將組氨酸標簽基因和β2微球蛋白基因連接到輕鏈可變區下游得到目的片段，所述助表達序列的基因序列見序列表1；PCR反應如下:首先在常規PCR反應體系(50μL)中加入等摩爾VL、VH基因,94℃預變性5min，94℃45s，68℃1min，72℃45s，共進行10個循環，72℃延伸10min；

步驟(3)：在重鏈可變區的上游和輕鏈可變區下游分別用內切酶AgeI和NcoI進行雙酶切引入酶切位點SfiⅠ和NotⅠ酶切位點，37℃過夜，載體pFUSEss-CHIg-hG1用同樣的內切酶雙酶切，然后用T4DNA連接酶將載體和目的片段進行連接，16℃下過夜，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，轉化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養過夜，次日隨機挑取8個平板上單克隆菌落進行菌落PCR，篩選陽性單克隆菌落，擴增提取得到pFUSEss_CHIg重鏈表達質粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達質粒。

表1核苷酸序列表

實施例2

通過實施例1構建的表達載體制備重組內參GAPDH抗體的方法如下：將獲得的pFUSEss_CHIg重鏈表達質粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達質粒質粒混合，通過PEI緩釋液轉染至293T細胞中，轉染前將293T細胞傳代，保證細胞匯合度達到80％～85％，將DNA稀釋液和PEI稀釋液混合，靜置5min后加入293T細胞中，放于37℃的二氧化碳培養箱中培養，轉染48h取樣檢測抗體是否表達，根據檢測情況確定收樣時間；用抗性篩選含有兩種質粒的細胞株293T細胞，培養細胞株后得到GAPDH抗體。

1、通過ELISA檢測293T細胞株

以抗人KAPPA鏈抗體用包被酶標板，4℃包被過夜，5％牛奶封閉液封閉2h；，分別加入正常未轉染293T細胞上清(-)和人IgG標準品(100ng/mL---+)和293T細胞表達上清，各100μL，37℃孵育30min，用ELISA洗滌液洗5次，3min/次；將HRP標記的羊抗人IgG Fcγ特異性抗體用ELISA稀釋液稀釋后，分別加入孔中，37℃孵育30min，用ELISA洗滌液洗5次，3min/次；加入顯色液100μL/孔，37℃避光顯色10min，最后加入50μL/孔2mol/L硫酸終止，用酶標儀上機檢測。根據酶標儀檢測結果確定抗生素雙篩選的293T細胞株的抗體分泌能力。

2、用Western blot方法檢測實施例2篩選出來的GAPDH抗體

WB選取HepG2細胞，A549細胞，HEK293細胞，Jurkat細胞和K562細胞，裂解后，使用制得的重組抗體作為一抗，進行WB試驗。結果如圖1所示。

3、用免疫熒光檢測實施例2篩選出來的GAPDH抗體

采用石蠟切片和SABC法進行，結果如圖2所示。

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> Mus musculus

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1 5 10 15

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