含唑雜環的嘧啶類化合物，組合物及其用途的制作方法

本發明涉及含唑雜環的嘧啶類化合物，組合物及其用途，屬于醫藥技術領域。

背景技術：

蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTKs)通過控制細胞的信號傳導通路調節細胞的生長、分化、凋亡等一系列生理生化過程。受體型酪氨酸激酶是一類橫跨細胞膜相對較大的激酶，其具有配體結合的胞外結構域、跨膜結構域和起激酶作用—在磷酸化特定酪氨酸殘基并且由此影響細胞增殖的胞內結構域。在一般人類癌癥中(如肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤)已發現所述激酶的異常表達。蛋白酪氨酸激酶已成為抗腫瘤藥物研究開發的重要靶點之一。

表皮生長因子受體酪氨酸激酶(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase，EGFR)是最早發現的蛋白酪氨酸激酶之一，EGFR的胞內區有ATP結合位點，EGFR抑制劑可以競爭性與ATP結合位點相結合，從而抑制EGFR的磷酸化過程，阻斷下游信號的傳導，進而抑制腫瘤細胞的生長、分化和轉移(Yun,et al.Cancer Cell 2007,11,217-227)。EGFR作為抗腫瘤靶點的生化過程已被闡明，其晶體結構和活性部位也已比較清楚，以此為靶點的藥物吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)等已經應用于臨床，且隨著EGFR結構和活性關系的深入研究，許多效果更佳優秀的EGFR抑制劑(EP0566226、WO9961428、WO0051587、WO0375947、WO0132651、WO9633980、WO9630347、US7709479、US6716847、US6593333、US6251912、CN201080060451.4、CN201110191525.4等)已被發現。然而這些藥物不可避免地存在著抗耐藥性差的問題。研究表明：氨基酸The790到Met790的突變(T790M)是此類藥物產生耐藥性的主要誘因。有臨床案例數據顯示，大約有60％的患者獲得性耐藥都源于T790M位點的突變所致。因此開發抗耐藥性更強、毒性更小、活性更強的新型EGFR抑制劑具有非常重要現實價值。

Osimertinib(AZD9291)是口服不可逆的，T790M突變選擇性EGFR抑制劑，在LoVo細胞中對Exon 19缺失的EGFRL858R/T790M和EGFR^WT的IC₅₀分別為11.44和493.8nM，于2015年12被美國FDA批準上市(WO2013014448)用于治療EGFR^T790M耐藥型肺癌。Rociletinib(CO-1686,AVL-301)是另一種不可逆的，突變選擇性EGFR^T790M抑制劑，在無細胞試驗中作用于EGFR^T790M和EGFR^WT的IC₅₀分別為21.5nM和303.3nM，目前處于臨床Ⅲ期研究研究(WO 2012061299)。其它如HM61713，EGF816，PF-06747775，Avitinib，ASP8273也是進入臨床研究的新型EGFR抑制劑(Ma et al.,J.Med.Chem.,2016，DOI:10.1021/acs.jmedchem.5b00840.)，涉及的專利如：US20120157426、US8563568B2、CN102740847、CN102083800。

鑒于治療癌癥的迫切需要，本領域有必要開發新的效果更佳良好的藥物。

技術實現要素：

本發明的目的之一在于提供一種含唑雜環的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的鹽，該類化合物具有良好的抗腫瘤活性。

本發明的另一目的在于提供含所述含唑雜環的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物。

本發明的再一目的在于提供所述含唑雜環的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的鹽，或所述組合物的用途。

為此，一方面，本發明提供一種通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，所述通式(Ⅰ)所示的化合物具有如下結構：

其中，

R¹選自選氯、氫、氟、三氟甲基或硝基；

R²選自氫、氯、氟、甲基或甲氧基；

Z選自-OCH₂CH₂-、-CH₂-、-NHC(＝O)CH₂-、直接的單鍵、-OCH₂CH₂CH₂-，當Z兩端含有雜原子O或N時，該雜原子與苯環相連；

X選自CH或N；

Y選自CH或N。

作為本發明的一種具體實施方式，本發明所述通式(Ⅰ)所示的化合物具有I-1～I-39所示的結構：

如上所示結構化合物為含唑雜環的嘧啶類化合物，本發明抗腫瘤活性篩選顯示，大部分此類化合物具有較強的抑制非小細胞肺癌(NSCLC)細胞增殖能力，部分化合物顯示出比Rociletinib更加優良的抗EGFR^T790M活性。作為一類結構新穎的分子，本發明中的化合物具有開發成新型高效EGFR抑制劑的潛力，對治療相關的腫瘤疾病尤其是非小細胞肺癌、小細胞肺癌有較大的應用價值。

前述I-1～I-39所示的結構分別具有如下名稱：

(I-1)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-2)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-三唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-3)N-[3-[[5-氟-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-4)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-5)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-6)N-[3-[[5-氟-2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-7)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙酰氨基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-8)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[(1H-咪唑基)]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-9)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-10)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[3-(1H-四氮唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-11)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-12)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-13)N-[3-[[5-氯-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-14)N-[3-[[5-氟-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-15)N-[3-[[5-氟-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-16)N-[3-[[5-氟-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-17)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-18)N-[3-[[5-氟-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-19)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-20)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-21)N-[3-[[5-氯-2-[[3-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-22)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-23)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-24)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-25)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-26)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-27)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-28)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-29)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-30)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-31)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-32)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-33)N-[3-[[5-三氟甲基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-34)N-[3-[[2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-35)N-[3-[[5-三氟甲基-2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-36)N-[3-[[2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-37)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氟-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-38)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-39)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氟-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

另一方面，本發明提供一種藥物組合物，其含有有效劑量的本發明所述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，及藥用載體。

本發明所述化合物由于它們在藥物中的可能用途，式(Ⅰ)化合物的鹽優選藥物可接受的鹽。本發明的化合物為堿，其中所需鹽形式可以通過本領域已知的合適方法制備，包括用無機酸處理游離堿，所述無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有機酸處理游離堿、所述有機酸例如乙酸、三氟乙酸、馬來酸、琥珀酸、扁桃酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羥基乙酸、水楊酸、吡喃糖苷酸(pyranosidy1acid)，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羥基酸，例如檸檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。藥學上可接受的鹽的實施例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙酸鹽(propiolates)、草酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯基乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽(phenylbutrates)、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、羥基乙酸鹽、酒石酸鹽、苦杏仁酸鹽和磺酸鹽、例如二甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽和萘-2-磺酸鹽。

本發明的藥物組合物通常含有一種本發明化合物。然而，在一些實施方案中，本發明的藥物組合物含有超過一種本發明的化合物。另外，本發明的藥物組合物還可任選包括一種或多種其它藥學活性化合物。

本發明還提供所述含唑雜環的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的載體，所述藥物組合物通過抑制EGFR表皮因子受體酪氨酸激酶進而抑制腫瘤增殖的用途。具體地，該用途主要為制備用于治療非小細胞肺癌、小細胞肺癌的藥物中的用途。

本發明提供所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，或本發明所述的藥物組合物在制備EGFR表皮因子受體蛋白酪氨酸激酶抑制劑中的應用。

本發明提供所述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或本發明所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。優選地，所述腫瘤選自非小細胞肺癌或小細胞肺癌，進一步優選非小細胞肺癌。更優選地，所述用途主要通過抑制EGFR表皮因子受體蛋白酪氨酸激酶實現的。

附圖說明

圖1為化合物I-5在50nmol/L濃度下引起H1975細胞凋亡的結果。

圖2為空白條件下引起H1975細胞凋亡的結果。.

圖3為化合物I-5在500nmol/L濃度下引起H1975細胞凋亡的結果。

圖4為化合物I-5在200nmol/L濃度下引起H1975細胞凋亡的結果。

圖5為空白條件及化合物I-5在5～15μM/L下引起H1975細胞凋亡的結果。

具體實施方式

以下結合具體實施例進一步描述解釋本發明，但這些實施例并非意味著限制本發明的范圍。

本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品制造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1目標分子的制備

薄層層析硅膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，薄層色譜法(TLC)使用的硅胺板采用的規格是0.15mm-0.2mm，薄層層析分離純化產品采用的規格是0.4mm-0.5mm。

本發明使用的原料主要購自可購買自國藥集團化學試劑有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化學試劑有限公司、達瑞化學品等公司。

實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。

實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫，為20℃-30℃。

本發明采用的技術方案如下：

化合物(Ⅰ)的合成路線.試劑及條件:(a)間硝基苯胺,DIPEA,1,4-二氧六環,rt,2h,91％；b)DIPEA,1,4-二氧六環,60℃,2h,49–72％；(c)Fe-NH₄Cl,MeOH-H₂O,80℃至rt,62–85％；(d)丙烯酰氯,NaHCO₃,丙酮,10min,43–68％，上述路線中各取代基的定義同上。

I-b的合成

取I-a(23.44mmol)和DIPEA(4.5g,35.16mmol)于50mL二氧六環中，慢慢加入3-硝基苯胺(3.8g,23.44mmol)，升溫60℃，反應5小時后，反應完畢，冷卻，加入400mL水，析出黃白色固體，抽濾，烘干，得白色固體，未純化直接下一步反應。

I-c的合成

取I-b(23.44mmol)和三氟乙酸(4.5g,35.16mmol)于2-BuOH(50ml)中，慢慢加入取代芳胺(I-f,3.44mmol)，升溫100℃，反應8小時后，反應完畢，冷卻，倒入飽和碳酸氫鈉溶液中，析出固體，抽濾，水洗，烘干硅膠柱層析分離，得淺褐色固體。

I-d的合成

取I-c(1.9g,6.8mmol)和氯化銨(0.73g,13.6mmol)于反應瓶，加入MeOH(15mL)和水(15mL)，攪拌下加入鐵粉(1.5g,27.2mmol)，升溫60℃反應2小時，趁熱抽濾，水相用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗一次，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得黃色半固體I-d。

目標物(Ⅰ)的合成

取I-d(2.1g,9.7mmol)溶于20mL乙腈中，加入碳酸氫鈉(1.6g,19.4mmol)，和甲基哌嗪(1.2g,11.64mmol)，升溫60℃反應5小時，反應完畢后抽干溶劑，加水200mL，未析出固體，水相用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得目標分子(Ⅰ)。

根據以上方法合成了目標分子，所合成目標分子的理化數據如下：

(I-1)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 476.16[M+H]⁺。

(I-2)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-三唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.07(s,2H),4.26(s,2H),5.70(d,J＝12.0Hz,1H),6.19(d,J＝16.8Hz,1H),6.39(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.64(s,2H),6.84(s,1H),7.17(s,1H),7.24-7.29(m,2H),7.44-7.48(m,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),8.84(s,1H),9.13(s,1H),10.15(s,1H).MS(ESI)m/z 475.15[M+H]⁺。

(I-3)N-[3-[[5-氟-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(t,J＝4.0Hz,2H)),4.31(t,J＝4.0Hz,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.74(d,J＝8.0Hz,2H),6.91(s,1H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.29(d,J＝12.0Hz,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.69(s,1H),7.93(s,1H),8.07(s,1H),9.01(s,1H),9.39(s,1H),10.15(s,1H).MS(ESI)m/z 460.19[M+H]⁺。

(I-4)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.78(s,3H),5.05(s,2H),5.74(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.66(d,J＝8Hz,1H),6.88(s,1H),6.97(s,1H),7.15(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,1H),7.79(s,1H),7.91(d,J＝6.0Hz,1H),7.92(s,1H),8.11(s,1H),8.95(s,1H),10.14(s,1H).MS(ESI)m/z 476.16[M+H]⁺。

(I-5)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(s,1H),7.30(d,J＝6.0Hz,2H),7.50(d,J＝6.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.67(s,1H),7.85(s,1H),8.14(s,1H),8.97(s,1H),9.37(s,1H),10.18(s,1H).MS(ESI)m/z 446.14[M+H]⁺。

(I-6)N-[3-[[5-氟-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.04(s,2H),5.76(dd,J＝2.0,10.0Hz,1H),6.26(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.50(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.88(s,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,2H),7.09(s,1H),7.27(d,J＝6.0Hz,1H),7.43(d,J＝6.0Hz,1H),7.51(d,J＝6.0Hz,1H),7.64(s,1H),7.69(s,1H),7.93(s,1H),8.11(s,1H),9.24(s,1H),9.46(s,1H),10.16(s,1H).MS(ESI)m/z 430.17[M+H]⁺。

(I-7)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙酰氨基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.07(s,2H),5.71(d,J＝10.0Hz,1H),6.21(d,J＝16.8Hz,1H),6.40(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.88(s,1H),7.01(s,1H),7.11(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝6.0Hz,1H),7.52(d,J＝6.0Hz,1H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.69(s,1H),7.83(s,1H),7.95(s,1H),8.51(s,1H),9.04(s,1H),10.32(s,1H).MS(ESI)m/z 500.17[M+H]⁺。

(I-8)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.67(d,J＝10.0Hz,1H),6.19(d,J＝16.8Hz,1H),6.29(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.01(s,1H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.28(d,J＝6.0Hz,1H),7.38(d,J＝6.0Hz,1H),7.41(s,1H),7.43(s,1H),7.86(s,1H),8.02(s,1H),8.96(s,1H),9.23(s,1H),10.29(s,1H).MS(ESI)m/z 443.15[M+H]⁺。

(I-9)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.86(m,2H),4.07(t,J＝4.0Hz,2H),4.57(t,J＝4.0Hz,2H),5.72(d,J＝10.0Hz,1H),6.17(d,J＝16.8Hz,1H),6.21(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),9.03(s,1H),9.45(s,1H),10.27(s,1H).MS(ESI)m/z 501.20[M+H]⁺。

(I-10)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-四氮唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.87(m,2H),4.10(t,J＝4.0Hz,2H),4.62(t,J＝4.0Hz,2H),5.75(d,J＝10.0Hz,1H),6.18(d,J＝16.8Hz,1H),6.25(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.45(s,1H),6.67(d,J＝8.4Hz,1H),6.87(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.28(d,J＝6.0Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,2H),7.71(s,1H),7.88(s,1H),8.15(s,1H),9.13(s,1H),9.55(s,1H),10.26(s,1H).MS(ESI)m/z 525.17[M+H]⁺。

(I-11)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.66(s,3H),4.13(s,2H),4.35(s,2H),5.76(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.19(s,1H),10.28(s,1H).MS(ESI),m/z:490.17[M+H]⁺。

(I-12)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.19(s,2H),4.41(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.76(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.96(s,1H),9.28(s,1H),10.26(s,1H).MS(ESI),m/z:510.11[M+H]⁺。

(I-13)N-[3-[[5-氯-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.27(s,2H),4.42(s,2H),5.33(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),8.97(s,1H),9.28(s,1H),10.36(s,1H).MS(ESI),m/z:506.16[M+H]⁺。

(I-14)N-[3-[[5-氟-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.76(s,3H),4.23(s,2H),4.35(s,2H),5.76(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.77(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.14(s,1H),10.18(s,1H).MS(ESI),m/z:474.20[M+H]⁺。

(I-15)N-[3-[[5-氟-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.09(s,2H),4.26(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.76(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.74(s,1H),7.89(s,1H),8.20(s,1H),8.96(s,1H),9.28(s,1H),10.36(s,1H).MS(ESI),m/z:494.14[M+H]⁺。

(I-16)N-[3-[[5-氟-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.17(s,2H),4.33(s,2H),5.43(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),9.05(s,1H),9.18(s,1H),10.27(s,1H).MS(ESI),m/z:490.19[M+H]⁺。

(I-17)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.17(s,2H),4.42(s,2H),5.53(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),8.99(s,1H),9.18(s,1H),10.18(s,1H).MS(ESI),m/z:506.16[M+H]⁺。

(I-18)N-[3-[[5-氟-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.09(s,2H),4.22(s,2H),5.37(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.76(s,1H),7.90(s,1H),8.15(s,1H),8.99(s,1H),9.21(s,1H),10.24(s,1H).MS(ESI),m/z:490.19[M+H]⁺。

(I-19)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ2.89(s,3H),5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(s,1H),7.30(d,J＝6.0Hz,2H),7.50(d,J＝6.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(s,1H),7.85(s,1H),8.14(s,1H),8.97(s,1H),9.37(s,1H),10.18(s,1H).MS(ESI),MS(ESI),m/z:46016[M+H]⁺。

(I-20)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.14(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(s,1H),7.39(d,J＝6.0Hz,2H),7.58(d,J＝6.0Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.77(s,1H),7.89(s,1H),8.14(s,1H),8.97(s,1H),9.49(s,1H),10.28(s,1H).MS(ESI),m/z:480.10[M+H]⁺。

(I-21)N-[3-[[5-氯-2-[[3-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.78(s,3H),5.05(s,2H),5.74(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.66(d,J＝8Hz,1H),6.88(s,1H),6.97(s,1H),7.15(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,1H),7.79(s,1H),7.91(d,J＝6.0Hz,1H),7.92(s,1H),8.11(s,1H),8.95(s,1H),10.14(s,1H).MS(ESI)m/z 476.16[M+H]⁺。

(I-22)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ2.89(s,3H),5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(s,1H),7.30(d,J＝6.0Hz,2H),7.50(d,J＝6.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(s,1H),8.05(s,1H),8.64(s,1H),9.17(s,1H),9.78(s,1H),10.38(s,1H).MS(ESI),m/z:471.18[M+H]⁺。

(I-23)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.14(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(s,1H),7.39(d,J＝6.0Hz,2H),7.58(d,J＝6.0Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.77(s,1H),7.89(s,1H),8.14(s,1H),8.97(s,1H),9.69(s,1H),10.39(s,1H).MS(ESI),m/z:491.13[M+H]⁺。

(I-24)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.58(s,3H),5.15(s,2H),5.79(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.66(d,J＝8Hz,1H),6.88(s,1H),6.97(s,1H),7.15(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,1H),7.79(s,1H),7.99(d,J＝6.0Hz,1H),8.02(s,1H),8.51(s,1H),9.15(s,1H),10.34(s,1H).MS(ESI),m/z:487.18[M+H]⁺。

(I-25)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.78(s,3H),5.05(s,2H),5.74(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.66(d,J＝8Hz,1H),6.88(s,1H),6.97(s,1H),7.15(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,1H),7.79(s,1H),7.91(d,J＝6.0Hz,1H),7.92(s,1H),8.11(s,1H),8.95(s,1H),10.14(s,1H).MS(ESI),m/z:487.18[M+H]⁺。

(I-26)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.76(s,3H),4.19(s,2H),4.38(s,2H),5.76(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.86(s,1H),7.97(s,1H),8.40(s,1H),8.99(s,1H),9.49(s,1H),10.38(s,1H).MS(ESI),m/z:501.19[M+H]⁺。

(I-27)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.29(s,2H),4.41(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.76(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.97(s,1H),8.40(s,1H),8.96(s,1H),9.48(s,1H),10.36(s,1H).MS(ESI),m/z:521.14[M+H]⁺。

(I-28)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.27(s,2H),4.66(s,2H),5.73(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.86(s,1H),8.02(s,1H),8.65(s,1H),9.10(s,1H),9.37(s,1H),10.40(s,1H).MS(ESI),m/z:517.19[M+H]⁺。

(I-29)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.17(s,2H),4.33(s,2H),5.43(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),9.05(s,1H),9.18(s,1H),10.27(s,1H).MS(ESI),m/z:517.19[M+H]⁺。

(I-30)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.91(m,2H),4.09(t,J＝4.0Hz,2H),4.57(t,J＝4.0Hz,2H),5.72(d,J＝10.0Hz,1H),6.17(d,J＝16.8Hz,1H),6.21(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),9.18(s,1H),9.64(s,1H),10.37(s,1H).MS(ESI),m/z:515.21[M+H]⁺。

(I-31)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.77(m,2H),4.09(t,J＝4.0Hz,2H),4.67(t,J＝4.0Hz,2H),5.78(d,J＝10.0Hz,1H),6.20(d,J＝16.8Hz,1H),6.29(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),9.03(s,1H),9.55(s,1H),10.38(s,1H).MS(ESI),m/z:535.15[M+H]⁺。

(I-32)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.66(m,2H),4.12(t,J＝4.0Hz,2H),4.77(t,J＝4.0Hz,2H),5.79(d,J＝10.0Hz,1H),6.18(d,J＝16.8Hz,1H),6.26(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),9.13(s,1H),9.49(s,1H),10.29(s,1H).MS(ESI),m/z:531.20[M+H]⁺。

(I-33)N-[3-[[5-三氟甲基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 510.18[M+H]⁺。

(I-34)N-[3-[[2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.77(dd,J＝4.0Hz,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 442.19[M+H]⁺。

(I-35)N-[3-[[5-三氟甲基-2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 480.17[M+H]⁺。

(I-36)N-[3-[[2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.77(dd,J＝4Hz,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 412.18[M+H]⁺。

(I-37)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氟-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,2H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 464.13[M+H]⁺。

(I-38)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,2H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 510.11[M+H]⁺。

(I-39)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氟-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(t,J＝4.0Hz,2H)),4.31(t,J＝4.0Hz,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.74(d,J＝8.0Hz,2H),6.91(s,1H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.29(d,J＝12.0Hz,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,1H),7.69(s,1H),7.93(s,1H),8.07(s,1H),9.01(s,1H),9.39(s,1H),10.15(s,1H).MS(ESI)m/z 494.14[M+H]⁺。

目標分子成鹽的方法

無機酸鹽的制備方法：取目標分子(1mmol)溶于10mL無水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加無機酸(1mmol)的5mL無水甲醇溶液，滴加完畢，于此溫度下攪拌30分鐘，然后常溫蒸除甲醇，即得目標分子的無機酸鹽。通過該方法制備了化合物I-5的鹽酸鹽(I-5-1)、氫溴酸鹽(I-5-2)、硫酸鹽鹽(I-5-3)及氫溴酸鹽(I-5-4)；

有機酸鹽的制備方法：取目標分子(1mmol)溶于10mL無水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加有機酸(1mmol)的5mL干燥乙醚，滴加完畢，于此溫度下攪拌30分鐘，然后常溫蒸除溶劑，即得目標分子的有機酸鹽。通過該方法制備了化合物I-9的馬來酸鹽(I-9-5)、琥珀酸鹽(I-9-6)及富馬酸鹽(I-9-7)。

兩個目標分子混合物的制備

取等摩爾量(1mmol)的上述兩個目標分子于無水甲醇中(5mL)，室溫攪拌10分鐘，常溫蒸除溶劑，即得目標分子的混合物。通過該方法制備了(I-5)-(I-6)、(I-5)-(I-9)、(I-6)-(I-10)三個組合物。

實施例2目標分子生物活性評價

1、體外對受體酪氨酸激酶抑制活性測試方法

制備激酶檢測緩沖液

①在室溫融解激酶檢測緩沖液(Kinase Detection Buffer)，觀察是否有沉淀。

②如果出現沉淀，就在37℃孵育(Kinase Detection Buffer)15分鐘并經常搖動，溶解沉淀。或者，小心吸走上清，去除沉淀。

制備激酶檢測試劑

①使用前在室溫平衡激酶檢測緩沖液(Kinase Detection Buffe)和(Kinase Detection Substrate)。

②將激酶檢測緩沖液(Kinase Detection Buffer)全部倒進裝有激酶檢測底物(Kinase Detection Substrate)的棕色瓶中，使凍干粉底物溶解，這樣就制成了激酶檢測試劑。

③輕輕震蕩、渦旋或顛倒混勻，成為均質溶液，底物應在1分鐘內溶解。

④激酶檢測試劑配好后應立即使用，或分裝存于-20℃，我們認為配好的試劑經過幾次凍融后循環信號活性都沒有損失。

制作ATP轉化成ADP的標準曲線

①用1×激酶反應緩沖液(kinase reaction buffer)稀釋試劑盒提供的Ultra Pure ATP和ADP，制成900μL 50μM ATP和500μL 50μM ADP。

②將上一步配好的50μM ATP和50μM ADP溶液按表1所示在384孔板A1-A12中混合，模擬每個轉化百分比的ATP和ADP的濃度，混合好。

表1.制備50μM系列ATP+ADP標準品

③每孔加入5μL的ADP-Glo^TM試劑來終止激酶反應。在室溫孵育40分鐘。

④每孔加入10μL激酶檢測試劑(Kinase Detection Reagent)將ADP轉化成ATP，并引進螢光素酶和螢光素來檢測ATP。

⑤在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標儀測量螢光并記錄螢光值。

⑥繪制ATP轉化成ADP的標準曲線。

確定激酶抑制物的IC₅₀值

①按照promega試劑盒說明書配制1×激酶反應緩沖液(kinase reaction buffer)，2.5×50ng/μL激酶和2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

②在無酶對照孔中加入3μL 1×激酶反應緩沖液(kinase reaction buffer)，2μL2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在陰性對照孔中加入1μL 1×激酶反應緩沖液(kinase reaction buffer)，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在測試孔中加入1μL 5×待測藥物，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

③混合好平板，孵育60分鐘。

④每孔加入5μL的ADP-Glo^TM試劑來終止激酶反應。在室溫孵育40分鐘。

⑤每孔加入10μL激酶檢測試劑(Kinase Detection Reagent)將ADP轉化成ATP，并引進螢光素酶和螢光素來檢測ATP。在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標儀測量螢光并記錄螢光值。

⑥結果分析，結果是表2所示。

2、細胞生長實驗(MTT檢測法)

細胞接種：收集對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度,以每孔7×10³個細胞,每孔體積100μL接種到96孔板，每組設4個復孔(邊緣孔用無菌PBS填充)；

細胞培養：細胞貼壁后，0％FBS RPMI-1640饑餓8h,對照組用10％FBSRPMI-1640培養,，37℃，5％CO₂培養箱中繼續培養(按實驗要求分別培養不同時間)；

呈色：三組細胞分別于培養72h后加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，4h后終止培養，每孔加入100μL三聯液，于搖床上低速振蕩10min，使結晶充分溶解；

比色：在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光度值(OD值)，選擇570nm波長，以無細胞的即RPMl-1640培養液空白孔調零，測各孔的吸光度值。實驗重復三次

記錄結果：細胞生長抑制率＝(對照組吸光度值一實驗組吸光度值)/對照組吸光度值×100％，細胞增殖率＝(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100；

繪制細胞生長曲線：以時間為橫坐標，抑制率/增殖率為縱坐標繪制細胞生長曲線。

在GraphPad軟件中的GraphPad Prism作圖軟件中針對抑制劑濃度做圖，以便由log[抑制劑]相對于反應，可變斜率模型估算出IC₅₀。

測試結果如表2所示，表2顯示所獲得的化合物在抑制EGFR酪氨酸激酶和抗腫瘤細胞增殖中的活性效果^a。

表2

表3

a:H1975為EGFR^T790M突變細胞株，A431EGFR^WT細胞.b:IC₅₀：半數有效抑制濃度.

3、細胞凋亡(流式細胞術)

3.1實驗材料和試劑

H1975細胞，RAPI1640基礎培養基(Hyclone公司，cat:SH30022.01B)，FBS胎牛血清(GIBCO公司，cat:16400-044)，雙抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:SV30010)，低速離心機(上海貝恩生物科技有限公司，cat:TDZ4B-WS)，CO₂培養箱(上海博訊，cat:BC-J160S)，超凈工作臺(上海博訊型號SW-CJ-2FD)，倒置熒光電子顯微鏡(Leica DMI3000B)。

3.2實驗方法

3.2.1擴大培養H1975細胞；

3.2.2藥物處理：用不同濃度藥物處理細胞48小時。

3.2.3藥物處理后細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗滌細胞兩次，收集細胞1～5×10⁵細胞；

3.2.4加入500μL的AnnexinV結合緩沖液(Binding Buffer)懸浮細胞；

3.2.5加入5μL AnnexinV-FITC混勻后，加入5μL碘化丙錠(Propidium Iodide，(周期檢測只加5uL碘化丙錠)，混勻；

3.2.6避光、室溫反應10min；

3.2.7用流式細胞儀檢測(Ex＝488nm；Em＝530nm)細胞凋亡和周期的情況。

測試結果如圖1～圖5所示，下圖顯示所獲得的化合物I-5在不同濃度下引起H1975細胞凋亡的結果。

以上生物活性結果表明，本發明中的分子對EGFR和EGFR^T790M激酶有強烈的抑制效果，大部分化合物達到納摩爾水平的活性級別，且有將近一半的化合物的有效抑制濃度IC₅₀值小于100nM，化合物I-3(9.1nM)，I-5(3.3nM)，I-6(9.0nM)對EGFR^T790M的IC₅₀更是達到10nM以下，明顯優于吉非替尼和Rociletinib，此外，本發明所涉及的化合物在激酶選擇性上較好，尤其是化合物I-5(SI＝303)，其選擇性是先導化合物Rociletinib(SI＝21.9)的13.8倍，結果預示著化合物I-5作用更專一，因此可能的毒副作用會更小。抗細胞增殖活性結果揭示，大部分化合物對肺癌耐藥型細胞H1975有非常有效的抑制作用，其中化合物I-5(118nM)和I-9(129nM)明顯優于Rociletinib(137nM)的活性，另外，大部分化合物對人正常支氣管上皮細胞HBE的抑制作用較弱，在其發揮抑制H1975細胞的有效濃度下，幾乎對正常細胞沒有影響，證明此類化合物的毒性更小，流式細胞凋亡的結果揭示I-5能夠對H1975引起細胞凋亡，且凋亡數目呈現劑量依賴性。預示此類分子有極大可能開發成新型高效EGFR抑制劑的潛力，對治療相關的腫瘤疾病尤其是非小細胞肺癌和小細胞肺癌有較大的應用價值。

以上所述僅是本發明的優先實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。