一種豌豆SSR指紋圖譜的構建方法與流程

本發明涉及分子生物學和植物品種鑒別
技術領域：
，特別是涉及一種豌豆SSR指紋圖譜的構建方法以及利用構建得到的豌豆SSR指紋圖譜鑒別豌豆品系或其野生近緣種的方法及應用。
背景技術：
：豌豆(PisumsativumL.)屬豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)野豌豆族(Vicieae)豌豆屬(Pisum)中的一個栽培中，屬一年生(春播)或越年生(秋播)攀巖性草本自花授粉植物。豌豆是世界上第四大食用豆類作物，全球有60多個國家生產干豌豆；我國是世界豌豆主產國，總面積、總產均為世界第一。豌豆適用冷涼氣候、多種土地和干旱環境，具有高蛋白質含量、維生素豐富、易消化吸收，糧、菜、飼、肥兼用以及深加工增值的諸多特點，是種植業結構調整中重要的間、套、輪作和養地作物，在我國的可持續農業發展和我國人民食物結構中產生著重要影響。因此開展豌豆品種的有效甄別顯得尤為重要。目前我國對豌豆品種進行鑒定主要方法是按照NY/T2436-2013《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南豌豆》進行田間測定來鑒定的。該方法簡便、經濟，但受限于許多形態學性狀鑒定周期長、易受環境影響等因素，因此不能精確、快捷地為新品種侵權案件提供鑒定依據，同時也常出現不同測試人員對某些性狀的認識存在偏差，導致判定結果不一致的問題。當前，隨著育種骨干親本的利用集中化，傳統的形態學測試已經不能適應品種鑒定和純度分析的要求。隨著生物技術的飛速發展，基于分子標記技術而建立起來的DNA指紋圖譜(fingerprint)在品種、品系鑒別方面發揮著重要作用。品種DNA指紋數據庫的構建在豌豆品種純度及真實性鑒定、種子質量標準化、品種審定及產權登記保護、真假種辨別、品種糾紛等方面具有重要應用價值，在探究我國豌豆種質資源的親緣關系、雜種優勢群劃分、種質資源創新利用及新品種選育等方面發揮著顯著作用。當前用于構建作物DNA指紋圖譜的標記技術主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。簡單重復序列(Simplesequencerepeat，SSR)，是第二代基于PCR技術的分子標記技術，具有多態性豐富、遺傳信息多、操作便利、共顯性、高度可重復性等優點，已被廣泛應用于植物資源遺傳研究和分子輔助育種實踐中。DNA指紋圖譜能夠從DNA水平上鑒定出品種間的差異或遺傳相似性。微衛星(又稱為簡單重復序列，SSR)是由1-6個核苷酸組成的短序列串聯重復多次而組成的一段DNA。由于微衛星中重復單元的重復次數不同，因而擴增出的微衛星序列的長度呈現多態性。微衛星序列具有多態性較高，重復性和穩定性好等特點，是十分有效的分子標記，被廣泛應用于品種鑒定、指紋圖譜構建等領域。為了有效保護我國豌豆的品種知識產權，有必要在我國開展豌豆開發微衛星標記開發，并應用于豌豆優良品種“分子身份證”構建的研究。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種豌豆SSR指紋圖譜的構建方法，本發明的另一目的在于提供一種高效、準確、低成本的利用豌豆SSR指紋圖譜鑒別豌豆品系或其野生近緣種的方法。本發明的目的還在于提供該方法的應用。為實現上述目的，本發明以49份代表性豌豆品種和32份豌豆種質資源基因組DNA為模板，通過分析豌豆基因組序列和EST序列，合成核心基因組SSR和EST-SSR引物。經過篩選，分別有19對基因組SSR和12對EST-SSR引物組成的分子標記組合可完全鑒別49份豌豆品種和32份豌豆種質資源的差異。所述的81份代表性參試豌豆材料見表1。表1中，有49份豌豆育成品種(W7-W55，6份國外豌豆資源(W1-W6)，18份豌豆核心種質資源(W56-W73)，共計73份豌豆材料，統稱“豌豆品系”，表1中另外8份野生豌豆資源(W74-W81)為豌豆野生近緣種。表181份豌豆品系或其野生近緣種經過多次篩選，選擇在連鎖群上的均勻分布、多態性較高、PCR擴增較穩定，同時滿足常規非變性凝膠電泳檢測和毛細管熒光電泳檢測兩種技術平臺，最終篩選出在豌豆品系或其野生近緣種間多態性信息含量值最高、等位位點數最多、重復性好、擴增帶型清晰度高、連鎖群分布均勻的SSR引物作為豌豆SSR指紋圖譜庫構建的核心引物。基于上述篩選方法，本發明提供用于鑒別豌豆品系或其野生近緣種的分子標記組合，其特征在于，含有19個基因組SSR分子標記和12個EST-SSR分子標記，分別為SSR4825、SSR4696、SSR28304、SSR24036、B83、EST671、SSR27844、SSR25888、SSR24882、SSR23759、SSR21491、EST619、SSR24112、EST599、SSR22754、P14、SSR24731、SSR25334、EST876、SSR28967、SSR21399、SSR21405、P282、EST643、SSR25799、SSR25965、P291、P292、SSR22052、P344、EST617；所述分子標記分別通過以下引物對擴增得到：SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10、SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14、SEQIDNO.15-16、SEQIDNO.17-18、SEQIDNO.19-20、SEQIDNO.21-22、SEQIDNO.23-24、SEQIDNO.25-26、SEQIDNO.27-28、SEQIDNO.29-30、SEQIDNO.31-32、SEQIDNO.33-34、SEQIDNO.35-36、SEQIDNO.37-38、SEQIDNO.39-40、SEQIDNO.41-42、SEQIDNO.43-44、SEQIDNO.45-46、SEQIDNO.47-48、SEQIDNO.49-50、SEQIDNO.51-52、SEQIDNO.53-54、SEQIDNO.55-56、SEQIDNO.57-58、SEQIDNO.59-60、SEQIDNO.61-62所示的引物。本發明提供一種引物組合，含有以下31對特異性引物對，其核苷酸序列分別如SEQIDNO.1-62所示。本發明提供含有上述引物組合的試劑盒。本發明提供了上述分子標記組合或引物組合在鑒定豌豆品系或其野生近緣種中的應用。本發明提供了上述分子標記組合或引物組合在豌豆種質資源改良中的應用。本發明提供了上述分子標記組合或引物組合在構建豌豆SSR植物圖譜中的應用。本發明還提供一種豌豆SSR指紋圖譜的構建方法，以本發明所述的含有上述31對引物的引物組合對不同豌豆品種和種質資源的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測或對PCR產物進行熒光毛細管電泳檢測：純合位點的等位變異大小數據記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0；上述“/”前為小片段，“/”后為大片段；通過對不同位點的數據整合，形成不同豌豆材料的SSR指紋圖譜。其中，PCR擴增方法為：反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35個循環；72℃延伸5min，10℃保溫5min；10μL擴增體系為：2×TaqPCRMasterMix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O2.5μL。其中，當采用非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測時，是采用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電壓300V，電流280mA，功率260W。當采用熒光毛細管電泳檢測時，為引物加入熒光標記，詳細情況見表2。本發明提供了利用上述構建方法構建得到的豌豆指紋圖譜。本發明構建得到的豌豆指紋圖譜，如表5-表20所示。本發明進而提供一種鑒定豌豆品系或其野生近緣種的方法，包括如下步驟：(1)提取待檢豌豆的DNA，以本發明所述的引物組合中的31對引物對分別對待檢豌豆的DNA進行PCR擴增；(2)擴增產物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，銀染顯色，根據擴增產物在電泳凝膠上的相對位置；或對擴增產物進行熒光毛細管電泳檢測，根據擴增產物的相對位置：純合位點的等位變異大小數據記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0；上述“/”前為小片段，“/”后為大片段；(3)結果對照表5-表20的豌豆品系或其野生近緣種指紋圖譜，材料間差異位點數≥3，則為不同豌豆品系或不同豌豆野生近緣種；材料間差異位點數<3，則為近似豌豆品系或其野生近緣種。本發明提供了上述方法在豌豆種質資源改良中的應用。本發明豌豆DNA指紋圖譜的構建方法，利用了SSR引物組合對某一豌豆品系或其野生近緣種DNA進行擴增，得到一組特有的DNA指紋，于是本發明方法采用引物組合鑒別的方法對豌豆品系或其野生近緣種進行分析和篩選，使每一個豌豆品系或其野生近緣種都找到了它特有的DNA指紋。本發明的基因組SSR和EST-SSR引物的擴增產物帶型間大小差異明顯，能夠很好的區分不同的豌豆品種或豌豆材料。對同一品種內的個體間的擴增產物，其帶型一致。本發明的檢測方法在短時間內即可完成豌豆品系或其野生近緣種鑒定與遺傳多樣性評價工作，具有高效、準確、低成本、操作簡便等優勢。同時本發明的檢測方法可以有效的對豌豆種子真偽進行監控，從DNA水平揭示品種的遺傳變異與親緣關系，保護了作物品種，防止假冒偽劣品種進入市場，也為豌豆品種選育過程中優異種質的合理利用提供了技術參考。附圖說明圖1為81份豌豆品系或其野生近緣種聚類分析結果圖。具體實施方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。本發明品種判定原則遵照以下國家標準進行，NY/T2594-2014植物品種鑒定DNA指紋方法總則；NY/T2436-2013《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南豌豆》；GB/T19557.1植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南總則。實施例1用于鑒定豌豆豌豆品系或其野生近緣種的基因組SSR和EST-EST引物的篩選本實施例以我國豌豆主產區代表性推廣的49個豌豆品種和32份豌豆種質資源(見表1)基因組DNA為模板，通過分析豌豆基因組序列和EST序列，合成核心基因組SSR和EST-SSR引物。經過篩選，分別有19對基因組SSR和12對EST-SSR引物組成的分子標記組合可完全鑒別49份豌豆品種和32份豌豆種質資源的差異。最終篩選得到19對基因組SSR分子標記和12對EST-SSR分子標記。表231對SSR核心引物上述表2的引物分別對應序列表中的SEQIDNO.1-62。實施例2豌豆特征指紋圖譜的構建與豌豆品系或其野生近緣種鑒定方法的建立1、豌豆總DNA提取采用改良CTAB法提取供試樣品DNA：取2g左右的新鮮幼嫩葉片，在液氮中研磨成粉末狀裝入2.0ml離心管中，放入-80℃冰箱保存待用；將預熱到65℃的2×CTAB提取液，按占溶液容量的1％的比例加入β-巰基乙醇，充分混勻；取出研磨好的葉片組織，每份樣品中加入800μL預熱后的CTAB提取液，渦旋1-2min，65℃水浴1h(每15min上下顛倒輕翻一次，充分混勻)；水浴加熱結束后，加入800μL氯仿/異戊醇(24：1)溶液于離心管中，混合15-20min，之后10000rpm離心15min；吸取600μL左右上清液移至新離心管(量可適當減少，但切不可接觸蛋白質層)，后加入95％等體積乙醇，搖勻后于-20℃冰箱放置2h或者4℃冰箱過夜，保證充分沉淀；12000rpm離心10min，倒掉上清，保留沉淀；用90％乙醇500μL清洗白色沉淀，10000rpm離心5min，小心倒掉上清；室溫風干，加入100μLddH2O充分溶解沉淀。利用Nanodrop2000/2000C儀器檢測樣品DNA濃度，將DNA濃度稀釋到50ng/μL，4℃保存備用。2、以實施例1所述81份豌豆參試材料，利用實施例1篩選得到的用于擴增31個分子標記的引物分別對實施例1所述的49個豌豆品種和32份豌豆種質資源基因組DNA進行PCR擴增，反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35個循環；72℃延伸5min，10℃保溫5min；10μL擴增體系為：2×TaqPCRMasterMix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O2.5μL。3、PCR擴增產物凝膠電泳及銀染顯色：擴增產物采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為0.5×TBE，200V穩壓電泳2-2.5h，至加樣緩沖液移到凝膠底部時電泳結束。銀染顯色，照相記錄。(1)玻璃板清洗用清水和洗滌劑將平、凹玻璃板充分清洗干凈，然后用蒸餾水沖洗，置于玻璃板架晾干；為防止灌膠時有氣泡產生，灌膠前用酒精擦洗玻璃板，晾干備用；將組裝好的玻璃板水平放齊，用夾子固定。(2)灌膠在45ml8％PAGE膠中加入TEMED45μL和10％過硫酸銨450μLTEMED(注：TEMED和過硫酸銨的使用量應依據環境溫度做出相應調整)，迅速混勻后灌膠。待膠液充滿玻璃板夾層時，在上部輕輕插入梳子，使其聚合25min左右(注：具體聚合時間應隨不同環境溫度做出相應調整)。在灌膠過程中，應防止氣泡的產生。(3)PCR擴增產物預處理在10μLPCR擴增產物中加入2.5μL6×Loadingbuffer，混勻30s待用。(4)電泳用移液器吹吸加樣槽，清除雜質和氣泡。每加樣孔點入1.5μL產物進行檢測，電泳1-1.5小時(電壓300V，電流280mA，功率260W)，電泳時間長短可根據目標片段大小和實際功率適度調節。待上部的指示帶(二甲苯青)到達膠板底部，電泳結束，小心剝離聚丙烯酰胺凝膠，待染色。(5)銀染漂洗：使用蒸餾水快速漂洗聚丙烯酰胺凝膠1次，時間不超過10s。銀染：按以下銀染液配比對凝膠進行染色，然后平行震蕩染色10min。表3清洗：染色10min后，將染色液倒入廢液桶，繼續用蒸餾水漂洗2次，每次不超過15s。顯色：按以下顯色液配比，加入適當的顯色液于塑料盒中，輕輕混勻后置于平行震蕩儀，使凝膠與顯色液充分作用，直至條帶清晰。表4洗滌：將顯影液倒掉并用蒸餾水清洗2-3次，每次不超過15s。保存：清洗干凈后，將凝膠平鋪在玻璃板上，用保鮮膜將其密封，讀出條帶結果并統計記錄，然后照相留存。結果記錄：純合位點的等位變異大小數據記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異(小片段在前，大片段在后)；無效等位變異的大小記錄為0/0。構建的81份豌豆材料的指紋圖譜見表5-表20。表5表6SSR24112B83P291SSR24036SSR28304SSR22754SSR25799SSR21405W1195/199162/162220/220206/220133/133173/173104/104130/144W2195/195158/162220/220194/194127/127161/161102/102130/157W3187/187159/162210/219212/212125/134173/173102/102130/130W4199/199160/160201/201192/192125/125173/173102/102144/144W5205/205158/158219/219194/194127/127173/173102/102143/143W6223/225161/161219/219218/218128/128173/173102/102157/157W7195/195163/163201/201206/206127/127161/173144/144130/130W8195/195163/163219/219206/206127/127170/170134/134130/130W9189/189156/156208/208192/192134/134173/173108/108159/159W10199/199164/164219/219218/218133/133173/173104/104144/144W11187/187142/142208/208192/192134/134158/174102/108134/159W12199/199156/156201/201194/194133/133158/158100/102159/159W13188/188142/142219/219194/194133/133170/170108/108134/134W14189/225161/161219/219193/193128/128161/161151/151159/159W15195/195155/155219/219194/194134/134161/161102/102158/158W16195/195161/161219/219194/194127/127158/158134/134130/130W17195/195155/161219/219194/194127/127158/158134/134144/160W18199/199161/161207/207194/194127/127161/173134/151144/144W19186/186161/161219/219194/194127/127161/161132/132144/144W20195/195142/142208/219193/193127/127161/161151/151144/144表7表8EST643P344EST876P14SSR25965SSR27844SSR21491W1139/142138/145154/177181/187159/159113/113158/158W2157/157145/145154/189187/190167/167114/114172/172W3144/144145/157154/164187/190159/163113/113172/172W4142/142152/157154/177187/190165/165112/112175/175W5141/141157/157154/176190/190142/142115/115175/175W6139/139145/145154/188190/190147/147112/112172/172W7142/142157/157154/163187/197146/146112/112172/172W8157/157158/158154/163187/196146/146112/112178/178W9141/141138/145154/154187/190159/161113/113169/169W10139/139157/157154/176181/181147/147112/112172/172W11141/141138/145168/190184/187155/161115/115175/175W12139/139144/151154/191187/197165/165113/113169/169W13141/141144/144154/168187/190155/155114/114178/178W14157/157138/138154/191197/197146/146112/112178/178W15144/144138/138154/191187/196161/161113/113169/169W16157/157139/139154/163187/197146/146113/113175/175W17157/157138/138154/154187/187155/155113/113172/172W18142/142138/145154/176190/190146/159113/113169/169W19157/157157/157154/176196/196146/146113/113169/169W20157/157138/145154/176187/196146/146113/113172/172表9表10SSR24112B83P291SSR24036SSR28304SSR22754SSR25799SSR21405W21195/195159/159201/201194/194133/133158/158134/134126/130W22195/195142/142219/219194/194127/127161/161151/151144/144W23195/195142/142220/220194/194127/127173/173151/151144/144W24220/220161/161201/201202/202133/133183/183144/144130/130W25227/227161/161201/201197/197127/127173/173149/149144/144W26199/199159/161219/219194/194128/128158/158134/134144/144W27189/189161/161219/219194/194128/128161/161151/151144/144W28199/199159/161219/219192/206127/134173/183102/151144/144W29199/199158/158219/219220/220133/133161/161102/149130/143W30195/195161/161219/219194/194128/128161/161151/151130/130W31225/225161/161201/201198/220133/133173/173144/144130/144W32225/225161/161201/201220/220133/133173/173144/144130/130W33195/195161/161219/219194/194128/128173/173151/151144/144W34195/195162/162220/220194/194128/128173/173151/151144/144W35195/195161/161219/219193/193128/128161/161151/151130/130W36220/220163/163201/201220/220127/127173/173144/144157/157W37214/214161/161201/201202/202133/133173/173102/102156/156W38201/201161/161219/219202/202128/128177/177102/102130/130W39201/201161/161219/219193/193127/127158/158151/151130/130W40220/220161/161201/201194/194133/133173/173102/102129/129表11表12EST643P344EST876P14SSR25965SSR27844SSR21491W21157/157145/145154/164187/190153/153113/113175/175W22157/157138/138154/177188/197147/147113/113172/175W23157/157138/138154/177187/197147/147113/113175/175W24142/142157/157154/164187/190159/159115/115172/172W25139/139158/158154/177187/190167/167112/112172/172W26157/15714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152/152208/208115/115131/148166/166138/138136/136W71165/165168/168193/193124/124143/148166/166138/138128/128W72159/159152/152193/198115/115131/148166/166144/144136/136W73175/175150/150202/202126/126143/148166/166144/144139/139W74173/173150/150200/202126/126141/141166/166137/137136/136W75124/124150/150190/190115/115143/143166/166144/144127/127W76146/146154/154192/192115/115131/147166/166144/144136/136W77124/124152/152193/193115/115130/147176/176144/144130/130W78156/156151/151193/193124/124130/147163/163139/139128/128W79156/156150/150193/193126/126130/147165/165144/144137/137W80158/158154/154200/200126/126140/147177/177139/139132/132W81135/135152/152190/190132/132145/145168/168128/128165/165表204、與上述步驟3平行的檢測方法，還可采用對PCR擴增產物進行熒光毛細管電泳檢測，具體如下：PCR產物樣品準備及電泳分析結果將FAM(藍色)和HEX(綠色)熒光標記的PCR產物用超純水稀釋25倍，分別取等體積的上述2種稀釋后溶液混合形成混合液，吸取1μL混合液、0.1μLLIZ500分子量內標和8.9μL去離子甲酰胺分別加入到DNA分析儀專用深孔板孔中；然后將其在PCR儀上95℃變性5min，取出后立即置于碎冰上，冷卻15min左右；瞬時離心10s，進行毛細管電泳檢測，用GENEMAPPER進行圖像分析和數據采集。以DNAMarkerI為DNA分子量標準，純合位點的等位變異大小數據記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0(注：小片段在前，大片段在后)。通過對多個位點的數據整合，最終形成不同豌豆品系或其野生近緣種的SSR指紋圖譜(表5-表20)。除待測樣品外，每個SSR位點還應同時包括3～5個參照材料的擴增產物。不同熒光標記的擴增產物的最適稀釋倍數最好通過預試驗確定。檢測結果判定：材料間差異位點數≥3，則為不同豌豆品系或不同豌豆野生近緣種；材料間差異位點數<3，則為近似豌豆品系或其野生近緣種。比較81份豌豆材料的指紋數據，發現任意兩個材料間的差異位點數都大于3，說明這31對核心引物可以有效的把這些豌豆品系或其野生近緣種鑒別開；利用PowerMarker和MEGA軟件進行聚類，分析參試材料間的遺傳關系，從圖中可以發現在遺傳相似系數為0.075左右時可以把81份豌豆材料區分開(圖1)。實施例3本發明鑒定豌豆品系或其野生近緣種方法的應用提取已知品種名稱的6個豌豆樣品的葉片DNA，以本發明實施例1篩選得到的分子標記組合中的31對引物分別對待檢豌豆品種的DNA進行PCR擴增；參照本發明實施例2的PCR反應體系，PCR反應程序，聚丙烯酰胺凝膠電泳和變異位點記錄方法(方法1)，同時重復實驗采用熒光毛細管電泳法和變異位點記錄方法(方法2)，將得到的指紋代碼與本發明得到的豌豆品系或其野生近緣種的特征指紋圖譜(表5-表20)進行比對，以驗證本發明實施例2建立的鑒定方法準確度。表21SSR4825SSR21399SSR23759P292SSR4696P282SSR28967EST617F1191/191141/141156/156210/210212/212184/184172/172125/125F2225/225141/141156/156225/225195/195184/184173/173125/125F3205/205158/158163/163225/225216/216201/203172/172134/134F4195/205141/141156/156200/200216/216184/184182/182128/128F5195/224154/154163/163216/216195/195186/186172/172127/127F6191/195154/154163/163216/216212/212186/186172/172128/128表22SSR24112B83P291SSR24036SSR28304SSR22754SSR25799SSR21405F1189/189156/156208/208192/192134/134173/173108/108159/159F2195/195155/155219/219194/194134/134161/161102/102158/158F3189/189161/161219/219194/194128/128161/161151/151144/144F4225/225161/161201/201220/220133/133173/173144/144130/130F5227/227159/159201/201204/204127/127161/161151/151144/144F6225/225159/159201/201194/204127/127161/161151/151144/144表23EST599SSR24882SSR24731EST619EST671SSR25888SSR22052SSR25334F1146/146152/152187/187115/115131/147163/166137/137137/137F2146/177150/150202/202124/124141/141166/166137/137137/137F3158/158153/153187/187126/126140/187163/163141/141137/137F4154/154150/150216/216123/123140/140177/177141/141136/136F5158/158150/150202/202126/126141/141177/177144/144152/152F6158/158150/150202/202126/126139/139177/177144/144150/150表24EST643P344EST876P14SSR25965SSR27844SSR21491F1141/141138/145154/154187/190159/161113/113169/169F2144/144138/138154/191187/196161/161113/113169/169F3157/157138/138154/176187/190146/146112/112172/172F4139/139158/158154/163190/190146/146115/115172/172F5157/157138/138154/176196/196146/146115/115160/160F6157/157145/145154/177187/190146/146115/115172/172結果發現：用本發明實施例1的31對引物組合對6個豌豆品種進行PCR擴增，上述兩種方法測得的6個豌豆樣品變異位點均一致，結果見表21-表24，且與本發明建立的豌豆指紋圖譜目標品種的差異位點數＜3，F1-F6為待測6個豌豆品種，經過對比鑒定得到F1-F6分別對應海門白花豌豆(W9)，無須豆尖1號(W15)，草原276(W27)，科碗2號(W32)，成碗8號(W44)，食莢大菜碗6號(W49)，與已知品種名稱一致，準確度100％。表明本發明實施例1篩選得到的31對引物組合可以較好的可以區分不同豌豆品種。應用本發明實施例2提供的鑒別豌豆品種的方法準確性較高，適合推廣使用。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。SEQUENCELISTING<110>中國農業科學院作物科學研究所<120>一種豌豆SSR指紋圖譜的構建方法<130>KHP161119131.4<160>62<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gcatgtgcatttaatcgtgc20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2tgcacacgtacacacaaatca21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3tgcatgtgcatgtaatcgtg20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4tcacacgcacgtacaaatca20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5ttttcagctgatcggatatctaca24<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6ggcagcatcttgaaaatcgt20<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7gaaggaccaaatcaattctctaaa24<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8accgacgtcaacgactgata20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9ccctctcccatctcatctca20<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>10aaagaaagtagagatccagcactga25<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>11ttgcctcatttatcattctcttatg25<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>12caaaaggttatctagctacgacttga26<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13gcttcaagctaccaagtgga20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14cctcacgggctctaccatac20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15aagggggagagaggtggtta20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16tcgccttttctttcttcttca21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17tttctggaacctcgcaaaac20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18ttgcctcaatttggagacct20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19ggggtgacagtgtagggtttt21<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>20taggcacacgctttcatgtt20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21acacgggatcgagctttaga20<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>22tcctttcctctaacttcttccttct25<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>23aagtctctcatacctaaccaaccac25<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>24gcagccaaatttgaggaaga20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>25ttgatcatcctctcgctttt20<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>26tgttgtcgtcatcaaaacacag22<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>27gcaattttctcactccatctcc22<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28aaaggaaagcaactcggtga20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>29ggaacgacaacacgaacctc20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>30gacacgttatgcgcacactc20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31tccgcaatgttctctcgaat20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>32ggaggtctccgcattatcaa20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>33agaaaatggcccacgaatta20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34tgcattgcattgtgtttgtg20<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>35tgaagatgtgacaaacaacagaaa24<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>36tccttctctgttcccaccac20<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>37gcagattgactgctcatgatgt22<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>38agctgattattgggcacctg20<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>39ctcgtcctcatcgaaaagcta21<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>40gtgaacaacgcaagggtttc20<210>41<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>41tgattctagttcatttcacaaacaca26<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>42cgtcctgcacctagcttctt20<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>43tccaccatctaatcccctctt21<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>44agctgattattgggcacctg20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>45ggcaagcataaaagggacac20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>46ttcatccaagaaccctcgac20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>47caccaccactctcacaccat20<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>48tgcattgcgagagtaagacaa21<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>49ctgcagaaggccctgttcta20<210>50<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>50gattcttcattctcaacacacattg25<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>51tgattcgtagaccccacaca20<210>52<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>52aaggttaatgtcttctttttgaagtt26<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>53caagcgtcgaagatgaacaa20<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>54gctggctgcaaaagtttacc20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>55gcacatgaaaaatgccaaag20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>56ctgttgctgttggtggtgag20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>57gttaccgatggccatgaatc20<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>58agcgagtgaagagggaagtg20<210>59<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>59atgcaaccggcgcagtat18<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>60ccaccttttcctcgcttttt20<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>61gccaaacggctttaaaacttc21<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>62tcgctgttggaaagagaagaa21當前第1頁1 2 3