一種大麥亞端粒寡核苷酸探針及其應用的制作方法

本發明涉及分子細胞遺傳學領域，特別是涉及大麥染色體原位雜交(FISH)過程中亞端粒的標記，具體地是能夠快速、有效地標記大麥亞端粒區域的寡核苷酸探針Oligo-HvT01。

背景技術：

高等生物染色體序列復雜多樣，在不同區間存在大量的重復序列，這為標記與鑒定染色體提供了新的思路與方法。在分子細胞遺傳學領域，可通過構建重復序列探針對染色體進行標記，分析染色體上探針信號的分布狀態，從而區分基因組與染色體組。此外，通過比較染色體上探針信號的變化亦是分析染色體行為的普遍做法。

目前，已經報道的大麥亞端粒探針僅有HvT01，其是通過擴增大麥基因組亞端粒重復序列而得到的(Schubert et al.The Plant Journal 1998,14:494)。然而，通過標記擴增產物制作FISH探針流程復雜，耗時費力，且受多種因素影響使得標記效果往往不理想。尤其是在進行大量試驗操作時，這一方法將在很大程度上影響試驗進程與效果。

技術實現要素：

為克服現有技術的上述不足，本發明提供一種能穩定標記大麥亞端粒區域的核苷酸探針以及該探針在原位雜交中檢測大麥材料亞端粒區域中的應用。

基于以上目的，本發明根據Schubert et al.(The Plant Journal 1998,14:494)對大麥染色體亞端粒區的研究結果確定的引物，

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用該引物對栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027全基因組DNA進行PCR擴增反應，通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現其產物存在如圖1所示的4條較亮條帶。選取其250bp左右條帶回收并構建質粒進行測序，結果顯示，其序列長度為113-116bp，說明所回收的核苷酸中存在兩個前后相連的相似性極高的片段。利用DNAMAN5.0軟件對測序結果進行序列比對分析，并從其3’端選取出一段相對保守的全長為52bp的核苷酸用于探針制備，其堿基序列為：

5’-CCGCTGCGATCCAAACGTTTCGGGAACCCCGGGGGCCGGTTACGGGAACTCT-3’，將其命名為Oligo-HvT01，合成該序列并對其進行熒光標記物質標記用于制作探針。本發明提供了上述寡核苷酸探針在大麥熒光原位雜交中的應用。

本發明的寡核苷酸探針可用于檢測大麥材料染色體亞端粒區域。

本發明提供了上述寡核苷酸探針在檢測大麥材料染色體亞端粒區域的應用，是用上述寡核苷酸探針對大麥染色體開展熒光原位雜交試驗，若在熒光顯微鏡下大麥染色體亞端粒區域檢測出信號，說明寡核苷酸探針Oligo-HvT01能用于標記大麥染色體亞端粒區域，為一種新的大麥亞端粒區域探針。

本發明提供了檢測大麥材料染色體亞端粒區域的寡核苷酸探針，即Oligo-HvT01，探針核苷酸序列為：

5’-CCGCTGCGATCCAAACGTTTCGGGAACCCCGGGGGCCGGTTACGGGAACTCT-3’。(SEQ ID NO.3)

進一步地，提供了Oligo-HvT01在檢測大麥材料染色體亞端粒區域的應用。

本發明提供了Oligo-HvT01探針在鑒定大麥染色體亞端粒區域形態中的應用。

本發明提供了Oligo-HvT01探針在大麥熒光原位雜交中的應用。

本發明提供了Oligo-HvT01探針在大麥種質資源改良中的應用。

本發明提供了一種檢測大麥材料染色體亞端粒區域的檢測方法，用寡核苷酸探針Oligo-HvT01對大麥材料染色體開展熒光原位雜交試驗，若在熒光顯微鏡下大麥染色體亞端粒區域檢測出信號，說明寡核苷酸探針Oligo-HvT01能用于標記大麥染色體亞端粒區域。

其中，所述熒光原位雜交方法反應程序為：于光學顯微鏡下檢查染色體，選取染色體形態清晰、分散較好的載玻片，變性處理后脫水晾干，滴加混合雜交液于載玻片上，蓋蓋玻片，置于潮濕的黑暗中孵育，清洗，滴加染液蓋蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察染色體。

具體地反應程序為：于光學顯微鏡下檢查染色體，選取染色體形態清晰、分散較好的載玻片，滴加70μl 70％甲酰胺變性劑，蓋蓋玻片于80℃下變性2min，迅速甩掉蓋玻片于-20℃下70％、95％、99％酒精梯度脫水，每梯度脫水5min，取出后自然晾干。滴加10μl(0.35μl 1OD/ml Oligo-HvT01探針與9.65μl雜交液)混合雜交液于晾干的載玻片上，蓋蓋玻片，置于潮濕的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC緩沖液清洗雜交液兩次，ddH₂O洗1次，滴加10μl DAPI染液，蓋蓋玻片，于OLYMPUS BX63DP80熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

在本發明的實施例中，采用羥基熒光素(FAM)標記本發明的寡核苷酸探針，利用該探針對大麥材料染色體開展熒光原位雜交試驗，若在熒光顯微鏡下大麥染色體亞端粒區域出現綠色信號，說明寡核苷酸探針Oligo-HvT01能用于標記大麥染色體亞端粒區域。

本發明提供了上述方法在大麥細胞學中的應用。

本發明所開發的大麥染色體亞端粒區域寡核苷酸探針，可直接對大麥染色體亞端粒區域進行檢測。該方法不僅具有靈敏度高、檢測效果好的特點，同時還克服了傳統的質粒標記方法所帶來的流程復雜、標記效果受干擾較大的不足，這就檢測大麥染色體亞端粒區域而言是一種很好的探針。利用本發明的鑒定方法，將使后續研究操作更加便捷有效。

附圖說明

圖1為栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027PCR擴增凝膠電泳檢測圖，從左到右依次為Marker、Baudin、CN4027。圖中從100bp-500bp間存在4條較亮條帶，250bp左右條帶為回收條帶。

圖2為栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027擴增序列對比結果。各材料從涂板中選取24株長勢較好菌落涂板，再從涂板中挑選3條菌落條帶測序，Baudin1、Baudin9、Baudin21分別表示材料Baudin第1、9、21條菌落條帶，CN402711、CN402717、CN402719分別表示材料CN4027第11、17、19條菌落條帶。

圖3為寡合苷酸序列探針Oligo-HvT01在栽培大麥Baudin(左)、野生大麥CN4027(右)染色體上的標記效果圖，其中灰色區域為DAPI標記的大麥染色體，亞端粒高亮區域為Oligo-HvT01信號點。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。本發明所使用的大麥材料：栽培品種Baudin、野生品種CN4027，均來自四川農業大學資源學院。本發明所使用生化試劑均為市售。本發明各試劑及配方如下：

DNA提取試劑盒：TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit(TaKaRa)。

PCR擴增試劑盒：EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(TaKaRa)。

cDNA回收試劑盒：TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(TaKaRa)。

質粒：pMD^TM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)。

感受態細胞：Agrobacterium tumefaciens LBA4404Electro-Cells(TaKaRa)。

瓊脂糖凝膠：采用0.5％瓊脂糖凝膠檢驗gDNA，2.0％瓊脂糖凝膠檢驗cDNA。其具體配方如表1。

表1

LB培養基(pH 7.0)：1％(W/V)tryptone,0.5％(W/V)Yeast Extract,1％(W/V)NaCl。

2×SSC緩沖液：0.3M NaCl,0.03M檸檬酸鈉。

70％甲酰胺變性劑：70％甲酰胺，溶于2×SSC緩沖液中。

雜交液：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

實施例1大麥亞端粒重復序列分析及寡核苷酸探針序列的確定

1、大麥基因組DNA的提取

選取待測材料Baudin、CN4027幼嫩葉片，采用柱式法(TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit)提取DNA，提取步驟如下：

a)取150mg新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細粉迅速加入500μl的Buffer HS I和10μl的50×DTT Buffer混勻，然后加入10μl的RNase A(10mg/ml)，充分振蕩混勻，于56℃水浴中溫育10分鐘。

b)加入62.5μl的Buffer KAC，充分混勻。冰上放置5分鐘，12,000rpm離心5分鐘。取上清，加入與上清液等體積的Buffer GB，充分混勻。

c)將Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中。12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

d)將500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

e)將700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

f)將Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm離心2分鐘。

g)將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入預熱至65℃的40μl Elution Buffer，室溫靜置5分鐘。

h)12,000rpm離心2分鐘洗脫DNA。

i)0.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度及質量。

2、PCR擴增

根據文獻(Schubert I,Shi F,Fuchs J,et al.An efficient screening for terminal deletions and translocations of barley chromosomes added to common wheat.The Plant Journal,1998,14:494.)對大麥染色體亞端粒標記探針的研究結果，參考其公布的引物HvT01，其核苷酸序列如下：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)；

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)。利用該引物對Baudin、CN4027進行PCR擴增反應。PCR反應體系：

PCR反應程序：

擴增結果如圖1。

3、寡核苷酸探針核苷酸序列的確定與探針制備

圖1中存在4條明顯條帶，選擇250bp左右條帶回收，構建質粒后送樣測序，結果如圖2。測序結果顯示堿基序列為113-115bp，說明圖1中存在的間斷條帶極有可能為連續相接的重復序列。用DNAMAN6.0進行序列比對，從3’端選取一段全長為52bp的相對保守的序列，其堿基序列為：

5’-CCGCTGCGATCCAAACGTTTCGGGAACCCCGGGGGCCGGTTACGGGAACTCT-3’，將其命名為Oligo-HvT01，合成該序列并對其進行及羥基熒光素(FAM)標記用于制作探針。

本發明的寡核苷酸探針可便捷快速地鑒定大麥染色體亞端粒區域。

實施例2寡核苷酸探針Oligo-HvT01對大麥染色體亞端粒區域檢測方法的建立

1、大麥根尖細胞染色體制片

選取發芽后根長1-2cm根尖于N₂O中處理4h，醋酸滅活，ddH₂O洗凈，切取分生區于37℃酶混合液(纖維素酶：果膠酶＝1:1)中酶解37min，吸除酶液后依次用ddH₂O、無水乙醇各洗2次。每1根尖加入20μl乙酸充分攪拌至細胞呈現懸浮狀，于每張載玻片上滴10μl懸浮液。光學顯微鏡檢測染色體，選取染色體形態清晰、分散較好的載玻片并做好標記于4℃冰箱中保存備用。

2、染色體原位雜交(FISH)

取出載玻片自然晾干，滴加70μl 70％甲酰胺變性劑，蓋蓋玻片于80℃下變性2min，迅速甩掉蓋玻片于-20℃下70％、95％、99％酒精梯度脫水，每梯度脫水5min，取出后自然晾干。

混合雜交液按每張片子0.35μl 1OD·ml^-1Oligo-HvT01探針與9.65μl雜交液的比例配置，用移液槍將混合雜交液反復吸放打勻，吸取10μl混合雜交液滴于片子上，蓋蓋玻片于濕潤暗盒中37℃孵育2h。取出后避光條件下2×SSC洗2次、ddH₂O洗1次，每次5min。自然晾干后每張片子滴加10μl DAPI，蓋蓋玻片于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機拍攝照片。

結果如圖3，大麥各染色體亞端粒區域均存在顯著的信號點(熒光顯微鏡下，顯示為綠色信號)，表明本發明開發的寡核苷酸探針Oligo-HvT01對大麥亞端粒區域具有顯著地標記效果，能夠快捷、準確地用于檢測大麥染色體亞端粒區域。

雖然，上文已經用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做出一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川農業大學

<120> 一種大麥亞端粒寡核苷酸探針及其應用

<130> KHP161119237.5Q

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaaactcgc attttggcc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagttcccg taaccggccc 20

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 大麥

<400> 3

ccgctgcgat ccaaacgttt cgggaacccc gggggccggt tacgggaact ct 52