一種快速高選擇性分析銅離子的比色熒光探針及其制備方法與流程

本發明涉及2-吡啶甲酸酯類化合物作為銅離子比色熒光探針，能夠迅速對銅離子高選擇性靈敏識別，或者其可測定樣品中銅離子的濃度。

背景技術：

銅作為第三個最豐富的過渡金屬在人體中細胞能量的產生、氧的傳輸和活化、以及信號轉導等方面起著舉足輕重的作用。銅離子是一個特定的金屬陽離子，它可以作為多種金屬酶的催化輔助因子，如酪氨酸酶、過氧化物歧化酶、細胞色素氧化酶、賴氨酰氧化酶等，在人體代謝過程起著非常關鍵的作用。銅雖然在人體內含量很低，但缺乏銅元素可以導致機體代謝和生長的紊亂，銅的含量過高同樣也會對人體產生很大的毒害作用。如果人體內的銅代謝平衡受到破壞，將會導致一些嚴重的神經退行性疾病的產生，如威爾森氏綜合癥、家族性肌萎縮癥、緬克斯綜合癥和阿爾茨海默氏癥等疾病。近年來，銅一直被懷疑引起嬰兒的肝損害。短期暴露于高銅離子水平的環境中可引起胃腸道紊亂，長期接觸可引起肝臟和腎臟的損害。

另一方面，由于銅離子被廣泛應用于工農業中，所以它是重要的環境污染物。因此，探索一個高效的能夠檢測生物體內銅離子的方法是非常重要的。目前檢測銅離子的方法主要有分光光度測定方法、電感耦合等離子體-原子發射光譜法、原子吸收光譜法、循環伏安法、電感耦合等離子體-質譜法等方法。但這些檢測銅離子方法的過程特別繁瑣，并且這些檢測設備的價格普遍都很昂貴，不適合用于大批量的檢測和進行實時的檢測。比起其他的方法，熒光探針有著其內在的優勢，包括高靈敏度，特異性，實施簡單，響應快速，能實現實時檢測，能應用于生物成像等。然而，目前報道的比色熒光探針仍存在一些問題，包括選擇性不夠好、響應速度不夠快、合成復雜。所以，發展一個有高選擇性和超靈敏的用以檢測銅離子的比色熒光探針是非常有必要的。飲水中含銅離子的適宜濃度為0.5～1.0mg/L，這給銅離子的檢測帶來很大困難，因此發展能夠高靈敏性檢測生命體內銅離子的分析方法是急需的。總之，發展快速、高選擇性、高靈敏度、合成簡單的銅離子比色熒光雙通道探針是本領域技術人員急需解決的。

技術實現要素：

本領域急需一種制備簡單的快速高選擇性銅離子比色熒光探針，從而能夠有效檢測銅離子。為此，本發明合成了一類新穎的銅離子比色熒光探針，其合成簡單、選擇性好、靈敏度高、能夠快速識別銅離子。具體而言，本發明提供了一種銅離子熒光探針，其為2-吡啶甲酸酯類化合物，其結構如下：

優選的，本發明的熒光探針是：

本發明還提供了銅離子比色熒光探針的制備方法，其是通過將對應于本發明探針的相應類熒光素化合物與2-吡啶甲酸在二氯甲烷(或乙腈或四氫呋喃或N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜或它們的混合物)溶液中反應制得。

本發明還提供了用于檢測樣本中銅離子濃度的檢測制劑或試劑盒，其包含本發明的探針。優選地，本發明的檢測制劑或試劑盒還包含產品的使用說明書。還優選地，本發明的試劑盒還包含用于測定樣本中的銅離子濃度的緩沖劑。

本發明還提供了檢測樣本中銅離子濃度的方法，其包括將本發明的探針與待測樣本接觸的步驟。

本發明還提供了本發明的探針在制備用于檢測樣本中銅離子濃度的制劑中的用途。

本發明還提供了本發明的探針在制備用于檢測樣本(例如水樣樣本)中銅離子濃度的試劑盒中的用途。

本發明的銅離子比色熒光探針可與銅離子進行作用，產生熒光光譜和紫外吸收光譜的變化，從而實現對銅離子的定性、定量檢測。

具體而言，本發明的銅離子比色熒光探針分別與鉀離子、鈉離子、鈣離子、鎂離子、鋅離子、亞鐵離子、鎳離子、鈷離子、鎘離子、鉛離子等其他離子進行作用均不能導致熒光光譜和紫外吸收光譜的明顯改變，從而實現對銅離子的選擇性識別，進而可任選地用于排除這些鉀離子、鈉離子、鈣離子、鎂離子、鋅離子、亞鐵離子、鎳離子、鈷離子、鎘離子、鉛離子以及人體內其他離子的存在對銅離子的定量測定的干擾。

可選擇地，本發明的銅離子比色熒光探針的穩定性好，進而能夠長期保存使用。

進一步的，本發明的銅離子比色熒光探針是快速高選擇性銅離子比色熒光探針，且合成簡單，有利于商業化的推廣應用。

附圖說明

圖1a是探針(5μM)加入Cu²⁺(5μM)前后的熒光光譜，圖1b是探針(5μM)加入Cu²⁺(5μM)前后的吸收光譜。

圖2是不同濃度Cu²⁺(0-3μM)對探針(5μM)熒光光譜的影響；

圖3是不同離子分析物(5μM)對探針(5μM)熒光強度的影響。a：探針溶液，b:鉀離子，c:鈉離子，d:鈣離子，e:鎂離子，f:鋅離子，g:亞鐵離子，h:鎳離子，i:鈷離子，j:鎘離子，k:鉛離子。

具體實施方式：

本發明提供了上述快速高選擇性銅離子比色熒光探針的合成路線、方法及其光譜性能。

本發明的銅離子比色熒光探針是一種2-吡啶甲酸酯類化合物，其具有以下結構通式：

上式中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆和R₇為氫原子，直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆和R₇可以相同或不同。

該類銅離子比色熒光探針的合成路線和方法如下：

具體地，本發明的比色熒光探針可以通過如下方法制備，將一定摩爾比(例如1:2～1:6)的類熒光素化合物與2-吡啶甲酸溶于二氯甲烷(或乙腈或四氫呋喃或N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜或它們的混合物)中反應，反應完全后利用真空泵進行抽濾，得到濾液，將濾液直接過色譜柱，得到純品。

因此，本發明還提供了2-吡啶甲酸在制備用于檢測銅離子的比色熒光探針中的用途。

本發明還提供了類熒光素化合物在制備用于檢測銅離子的比色熒光探針中的用途。

本發明的快速高選擇性高靈敏識別銅離子比色熒光探針的顯著特征是能夠快速高選擇性靈敏識別銅離子以及在人體內的其他離子的存在下能夠準確對銅離子進行定量分析。

下面將通過借助以下實施例來更詳細地說明本發明。以下實施例僅是說明性的，應該明白，本發明并不受下述實施例的限制。

實施例1

(方案1)將387mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于15mL二氯甲烷中，再加入246mg(2mmol)2-吡啶甲酸回流6h，然后利用真空泵進行抽濾，得到濾液，將濾液直接過色譜柱，得到純品。得到淡黃色純凈產品295.2mg，產率為60％。

(方案2)將387mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于15mL二氯甲烷中，再加入307.5mg(2.5mmol)2-吡啶甲酸回流6h，然后利用真空泵進行抽濾，得到濾液，將濾液直接過色譜柱，得到純品。得到淡黃色純凈產品310mg，產率為63％。

(方案3)將387mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于15mL二氯甲烷中，再加入369mg(3mmol)2-吡啶甲酸回流6h，然后利用真空泵進行抽濾，得到濾液，將濾液直接過色譜柱，得到純品。得到淡黃色純凈產品334.6mg，產率為68％。

(方案4)將387mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于20mL二氯甲烷中，再加入492mg(4mmol)2-吡啶甲酸回流6h，然后利用真空泵進行抽濾，得到濾液，將濾液直接過色譜柱，得到純品。得到橙色純凈產品344.4mg，產率為70％。

(方案5)將387mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于15mL二氯甲烷中，再加入369mg(3mmol)2-吡啶甲酸回流10h，然后利用真空泵進行抽濾，得到濾液，將濾液直接過色譜柱，得到純品。得到淡黃色純凈產品364.1mg，產率為74％。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(*10^-6):1.103(t,J＝7.0Hz,6H),3.281-3.401(m,4H),5.580(d,J＝8.0Hz,1H),6.516(d,J＝3.6Hz,2H),6.863(d,J＝8.4Hz,1H),7.072(d,J＝8.4Hz,1H),7.382(d,J＝7.6Hz,1H),7.403(d,J＝2.4Hz,1H),7.734-7.773(m,2H),7.831(t,J＝7.4Hz,1H),8.040(d,J＝7.6Hz,1H),8.096(t,J＝7.6Hz,1H),8.259(d,J＝8.0Hz,1H),8.829d,J＝4.8Hz,1H).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(*10^-6):12.78,44.26,83.31,97.38,104.65,109.44,110.84,117.72,118.28,124.63,125.19,126.37,126.70,128.60,129.17,129.62,130.71,136.16,138.26,146.96,149.88,150.25,150.53,152.08,152.38,152.55,152.69,157.08,163.55,169.10.

實施例2

圖1(a)是探針(5μM)加入Cu²⁺(5μM)前后的熒光光譜。由圖可以清晰地看到，銅離子的加入導致熒光強度增強。

圖1(b)是探針(5μM)加入Cu²⁺(5μM)前后的吸收光譜。由圖可以清晰地看到，銅離子的加入導致吸收值增強，并且溶液顏色變成粉紅色，因此利用該探針能夠實現對銅離子的裸眼比色分析。

實施例3

圖2是不同濃度Cu²⁺(0-3μM)對探針(5μM)熒光光譜的影響；

由圖可以看出，伴隨著探針溶液中Cu²⁺濃度的增加，熒光強度逐漸增強。重要的是，熒光強度與加入的銅離子濃度呈現了良好的線性關系，這證明借助于該熒光探針能夠對銅離子進行定量分析，且具有較高的靈敏度。

實施例4

圖3是不同離子分析物(5μM)對探針(5μM)的熒光強度的影響。所有測定都是15min后完成的。黑色柱狀圖為未加銅離子時的熒光強度，紅色為加入5μM銅離子反應15min后的熒光強度。

分析物包括：銅離子、鉀離子、鈉離子、鈣離子、鎂離子、鋅離子、亞鐵離子、鎳離子、鈷離子、鎘離子、鉛離子。它們的濃度均為5μM。所有測試條件是在純水中完成，所使用的探針是實施例1中所制備的探針，且所有光譜都是在25℃下分析物加入15min后測得的。具體地，加入5mL超純水至10mL比色管中，然后加入50μL的探針儲備液(1mM)，再加入50μL緩沖溶液(PBS＝5μM，pH＝7.0)最后用超純水定容至10mL，搖勻。移取5μL上述分析物儲備液(10mM)加入比色管內，15min后測定。結果如圖3所示。

從圖3可以看出，生物體內存在的常見離子不會明顯干擾探針對銅離子的測定，因此探針具有良好的選擇性。

雖然用上述實施方式描述了本發明，應當理解的是，在不背離本發明的精神的前提下，本發明可進行進一步的修飾和變動，且這些修飾和變動均屬于本發明的保護范圍之內。