一種小麥耐鹽基因及其應用的制作方法

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及耐鹽基因及其應用。

背景技術：

土壤鹽漬化嚴重影響農作物產量。特別是隨著工業的發展，土壤鹽漬化愈來愈嚴重，已成為一個全球關注的社會問題。我國人口眾多，而土壤鹽漬化更為嚴重，已經成為制約我國經濟和社會發展的重要因素。因此，除了緩解土壤鹽漬化以外，培育耐鹽農作物新品種已成為當前一個十分迫切的任務。

利用轉基因改良植物技術將新的性狀轉入高生物量植物中，以此開發高效的轉基因植物新品種并用于在鹽堿地種植，是一項具有廣闊應用前景的技術。

目前，利用基因工程技術開展植物耐鹽方面研究已取得了較大的進展，克隆了大量相關基因，并將這些基因轉入植物中，用于耐鹽機制研究。一些實驗表明，將植物本身以及其它生物中與耐鹽相關的基因轉入植物中，其異源轉錄和翻譯產物可以使轉基因植物的抗鹽能力得到提高。

技術實現要素：

解決的技術問題：本發明的目的是提供一種小麥耐鹽基因和其在植物耐鹽性狀改良中的應用。

技術方案：一種小麥耐鹽基因，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述小麥耐鹽基因編碼的蛋白。

所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

含有上述基因的植物表達載體。

上述基因在培育抗鹽植物中的應用。

上述植物是普通小麥。

上述植物表達載體在培育抗鹽植物中的應用。

有益效果：利用植物基因工程技術，本發明克隆得到了小麥耐鹽基因，并首次將該基因轉入普通小麥中，經過比較分析證明，轉基因植株的耐鹽能力明顯提高，預示其可廣泛用于培育耐鹽農作物品種，尤其是在培育耐鹽小麥品種中將有重要作用。

附圖說明

圖1為基因全長cDNA 序列的擴增結果；

圖2為轉基因小麥陽性系的鑒定圖，其中“-”為陰性對照，“+”為陽性對照；

圖3為鹽脅迫對轉基因小麥株系與對照株系根系生長的影響。

具體實施方式

實施例1、耐鹽基因的克隆

1.1提取小麥Total RNA

1.將組織材料放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮揮發干，立即轉移到2mL的離心管中，每100mg材料約加入1mL的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加樣槍反復吸吹，劇烈振蕩混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；

3.加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；

4.4℃，12000rpm離心15分鐘；

5.用移液器小心吸出上層水相，加入新的1.5mL的離心管中，加入500μL的異丙醇(1:1體積)，充分混勻，-20℃，沉淀30min或過夜；

6.4℃，12000rpm離心10min，小心棄去上清液；

7.RNA沉淀用1mL的75%乙醇洗滌。4℃，8000rpm離心10min收集沉淀；

8.重復用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入適當體積（30-50μL）的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃長期保存)；

10.紫外分光光度計及1%Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質量。

1.2 cDNA反轉錄

反轉錄酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

1.12μL體系：Oligo（dT） 1μL

Total RNA 100ng-5μg

dNTP 1μL

DEPC水 補至12μL

2.65℃變性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer 4μL

0.1M DTT 2μL

RNase (Invitrogen) 1μL

3.輕輕混勻，37℃反應2min；

4.加入1μL M-MLV RT，混勻，37℃反應50min；

5.70℃溫育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μL RNase H（Invitrogen），37℃反應20min；

7.用超純水稀釋至合適濃度。作為PCR模板。

1.3 開放閱讀框的克隆和序列測定

1．引物序列：根據測序結果，設計基因上下游引物: HKT-B1-F (ATACTTACCAACGAATGGGTTCTC)，HKT-B1-R(GTCTGCTACTAGGTTATACTATCC)，擴增基因的開放閱讀框。

2．PCR 反應體系（50μL）：

2×GC bufferⅠ 10μL

模板cDNA 1μL

dNTPs（2.5mM each） 0.5μL

Primer1 (10μM) 1μL

Primer2(10μM) 1μL

LA Taq(TaKaRa) 0.5μL

ddH₂O 加至終體積50μL

3．PCR 反應程序為： 94℃ 預變性5min；94℃變性45sec，55℃復性45sec，72℃延伸2min，循環35 次；72℃延伸7min。

4．擴增片段回收后與pEASY-T1載體連接并轉化大腸桿菌DH10B，測序由南京金斯瑞公司完成。

實施例2、植物表達載體的構建

利用植物表達載體pGA3626，選用KpnI和BspTI分別對pGA3626 和含有目的基因的pEASY-T1 載體進行雙酶切，分別回收載體大片段和目的基因小片段，用T4 DNA 連接酶連接后轉化大腸桿菌DH10B 感受態細胞，鑒定重組子后即得到帶有目的基因的植物表達載體。

（1）質粒pGA3626空載體和pEASY-T1的KpnI和BspTI雙酶切

堿裂解法提取pGA3626 空載體和pEASY-T1 質粒，各取10μg 酶切，酶切體系如下：

KpnI 1μL

BspTI 1μL

pGA3626載體/ pEASY-T1質粒 1~2μL

10×Buffer K 1μL

ddH₂O 補充至 20μL

于30℃恒溫水浴鍋酶切2 小時以上。雙酶切后以1×TAE 為電泳緩沖液，將酶切產

物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下pGA3626中14kb 的載體大片段和pEASY-T1 中大約1.5 kb 的目的基因條帶，回收該條帶。

（2）pGA3626質粒酶切回收的載體大片段的脫磷。

（3）經酶切和脫磷的pGA3626載體片段(約14kb)和pEASY-T1 雙酶切回收片段（約1.5kb）以摩爾比1:4 的比例進行16℃連接過夜。

（4）連接產物熱激法轉化大腸桿菌DH10B 感受態細胞，轉化菌在含Kan 50μg/mL 的LB 固體平板上37℃培養16 小時左右。

（5）重組子的鑒定

① 質粒的PCR 驗證

挑取單菌落分別接種于5mL 含Kan 的LB 液體培養基中37℃振蕩培養過夜，堿變性法提取質粒，用基因特異引物進行PCR 擴增，體系如下：

PCR 反應條件如下：預變性94℃ 3min，35 個循環為：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR 產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

② 質粒酶切鑒定

提質粒進行KpnI和BspTI 雙酶切，酶切體系同上。0.8％瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否含有預期分子量大小的片段，驗證載體的正確構建。

實施例3、轉基因小麥的創制、驗證和表型鑒定

2.1 轉基因小麥的創制

采用合作實驗室建立的生長點轉化方法（國家發明專利ZL200410075773.2），將構建的植物表達載體轉化小麥。

2.2 轉基因小麥陽性株系的驗證

(1) CTAB法提取基因組DNA。

(2) PCR鑒定陽性植株。

PCR 擴增以轉化株系的基因組DNA為模板，引物、PCR 反應體系和反應條件見1.3。驗證結果見圖2。

2.3 轉基因小麥陽性株系的表型鑒定

小麥材料：載體轉基因陽性株系和對照普通小麥濟南177號。

培養條件：水培法在無菌濾紙上20℃培養2天，然后轉移到1/2 Hoagland培養液 (Hoagland and Arnon,1950)中，置于培養室（光周期12小時，光處理與暗處理的溫度分別為22℃和20℃，濕度50%，光合有效輻射為300μmol m-2s-1 ），培養液每天更換。

處理條件：小麥幼苗培養至兩葉期時，進行空白對照處理、鹽處理（50mM NaCl處理第1天，之后NaCl濃度每天遞增50mM，一直到200mM），處理時間為7天，鑒定表型，如圖3所示，載體轉基因陽性株系根系長度、地上部生長情況明顯好于對照株系，說明載體轉基因可促進小麥的耐鹽性，證明該基因可用于小麥等植物的耐鹽性改良。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學院南京土壤研究所

<120> 一種小麥耐鹽基因及其應用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggttctc tgcatgtctc ctgcagtacc actcaacata gcaagcttca gagggtttac 60

caactcctgt ttttccatgt gcacccgttc tggctccatt tcttgtactt tgtaaccatc 120

tccttcttag gtttcgtgat cctgaaagcc ctgcccatga agaccagcat ggtctcgagg 180

cccatagacc ttgacctgat cttcacctcg gtgtcggcca ccacggtgtc gagcatggtg 240

gccgtggaga tggagtcctt ctccaacccc cagctcctac tcctgaccat ccttatgctc 300

ctcggcggcg aggtgttcac cagcatgctt ggcctttact ttacctacat caagtccaag 360

aagaaagaag ccccccatga ccatggtgat ggtggtggca aagtcgaacc agcaccgtct 420

agcctagagc tccctgctac caccttcatg gacgatagca ctgcacagaa ccagatggag 480

caagggttca acaaggagca gccccgatac ggccgagcct tcctcaccag gttgctcctg 540

ttcatagtgc tgggctatca cgtggtggtg cacctcgccg gctactccct gatgctgctc 600

tacctgagcg tcgtctccgg cgcaagggct gtgctcgccg gcaaggggat cagcctgcac 660

accttctccg tattcaccgt cgtctcgaca ttcgccaatg gtggcttcgt gccgaacaac 720

gaagggatgg tcgtcttccg gtccttcccg ggcctcctgc tcctcgtcat gccgcacgtc 780

ctcctcggca acacgctctt ccctgtcttc ctcaggctgg ccatctgggc tctccggagg 840

gtcaccagga ggcccgagct cggccagctg cagagcatcg gctatggtca cctgctgacg 900

agccggcaca cctgcttctt ggctttcacc gtggccacgt tcgtgctggc gcagctgtcg 960

ctcttctgcg ccatggagtg gggctccaac gggctgcacg ggctcaccgc cgcgcagaag 1020

ctcgttgcgg cactgttcat gtcggtcaac tctaggcaca ccggcgagat ggtcgtggac 1080

ctttccacca tgtcgtcagc cgttgtggtg ctctacgtgg tcatgatgta cctaccacct 1140

tacactacat ttctaccagt ggaagacgac agtgaccaac aagtgggagc agatcagcac 1200

caccagaaaa gggtaacaag catatggcgg aagctgctca tgtcgccgct ctcgttcttg 1260

gccatcttca tcgccgtcgt gtgcatcacg gagcggcggc agatctccga tgaccccctc 1320

aacttcaacg tcctcaacat caccgtcgag gttatcagtg cgtacggaaa cgtggggttt 1380

agcaccgggt acagctgtgc ccggcaggtg actgccgacg gcggctgcag ggatacgtgg 1440

gttggcttct ctgggaagtg gagctggcaa gggaagctgg ttctcattgc tgtcatgttc 1500

tacggcagac tcaagaagtt cggcatgcat ggtggcgagg catggaggat agtataa 1557

<210> 2

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Ser Leu His Val Ser Cys Ser Thr Thr Gln His Ser Lys Leu

1 5 10 15

Gln Arg Val Tyr Gln Leu Leu Phe Phe His Val His Pro Phe Trp Leu

20 25 30

His Phe Leu Tyr Phe Val Thr Ile Ser Phe Leu Gly Phe Val Ile Leu

35 40 45

Lys Ala Leu Pro Met Lys Thr Ser Met Val Ser Arg Pro Ile Asp Leu

50 55 60

Asp Leu Ile Phe Thr Ser Val Ser Ala Thr Thr Val Ser Ser Met Val

65 70 75 80

Ala Val Glu Met Glu Ser Phe Ser Asn Pro Gln Leu Leu Leu Leu Thr

85 90 95

Ile Leu Met Leu Leu Gly Gly Glu Val Phe Thr Ser Met Leu Gly Leu

100 105 110

Tyr Phe Thr Tyr Ile Lys Ser Lys Lys Lys Glu Ala Pro His Asp His

115 120 125

Gly Asp Gly Gly Gly Lys Val Glu Pro Ala Pro Ser Ser Leu Glu Leu

130 135 140

Pro Ala Thr Thr Phe Met Asp Asp Ser Thr Ala Gln Asn Gln Met Glu

145 150 155 160

Gln Gly Phe Asn Lys Glu Gln Pro Arg Tyr Gly Arg Ala Phe Leu Thr

165 170 175

Arg Leu Leu Leu Phe Ile Val Leu Gly Tyr His Val Val Val His Leu

180 185 190

Ala Gly Tyr Ser Leu Met Leu Leu Tyr Leu Ser Val Val Ser Gly Ala

195 200 205

Arg Ala Val Leu Ala Gly Lys Gly Ile Ser Leu His Thr Phe Ser Val

210 215 220

Phe Thr Val Val Ser Thr Phe Ala Asn Gly Gly Phe Val Pro Asn Asn

225 230 235 240

Glu Gly Met Val Val Phe Arg Ser Phe Pro Gly Leu Leu Leu Leu Val

245 250 255

Met Pro His Val Leu Leu Gly Asn Thr Leu Phe Pro Val Phe Leu Arg

260 265 270

Leu Ala Ile Trp Ala Leu Arg Arg Val Thr Arg Arg Pro Glu Leu Gly

275 280 285

Gln Leu Gln Ser Ile Gly Tyr Gly His Leu Leu Thr Ser Arg His Thr

290 295 300

Cys Phe Leu Ala Phe Thr Val Ala Thr Phe Val Leu Ala Gln Leu Ser

305 310 315 320

Leu Phe Cys Ala Met Glu Trp Gly Ser Asn Gly Leu His Gly Leu Thr

325 330 335

Ala Ala Gln Lys Leu Val Ala Ala Leu Phe Met Ser Val Asn Ser Arg

340 345 350

His Thr Gly Glu Met Val Val Asp Leu Ser Thr Met Ser Ser Ala Val

355 360 365

Val Val Leu Tyr Val Val Met Met Tyr Leu Pro Pro Tyr Thr Thr Phe

370 375 380

Leu Pro Val Glu Asp Asp Ser Asp Gln Gln Val Gly Ala Asp Gln His

385 390 395 400

His Gln Lys Arg Val Thr Ser Ile Trp Arg Lys Leu Leu Met Ser Pro

405 410 415

Leu Ser Phe Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Val Cys Ile Thr Glu Arg

420 425 430

Arg Gln Ile Ser Asp Asp Pro Leu Asn Phe Asn Val Leu Asn Ile Thr

435 440 445

Val Glu Val Ile Ser Ala Tyr Gly Asn Val Gly Phe Ser Thr Gly Tyr

450 455 460

Ser Cys Ala Arg Gln Val Thr Ala Asp Gly Gly Cys Arg Asp Thr Trp

465 470 475 480

Val Gly Phe Ser Gly Lys Trp Ser Trp Gln Gly Lys Leu Val Leu Ile

485 490 495

Ala Val Met Phe Tyr Gly Arg Leu Lys Lys Phe Gly Met His Gly Gly

500 505 510

Glu Ala Trp Arg Ile Val

515

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atacttacca acgaatgggt tctc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtctgctact aggttatact atcc 24