植物體系表達人源化抗AGR2單克隆抗體18A4的質粒構建的制作方法

本發明涉及生物
技術領域：
，具體涉及植物表達體系表達人源化抗AGR2單克隆抗體18A4的質粒構建。
背景技術：
：AGR2是通過轉錄組和蛋白組篩選研究新發現的一種與多種腺癌發生發展和惡化相關的蛋白質。AnteriorGradientHomolog2(AGR2)蛋白最早是Aberger等人在研究非洲爪蟾神經發展中進行基因差異性表達篩選時發現，人AGR2是Thompson和Weigel在研究雌激素受體陽性乳腺癌的基因分化表達時發現的。多項研究發現，AGR2在大部分腺癌中均有過量表達，這些腺癌包括乳腺癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌，并且AGR2的過量表達與多種腫瘤表征有關，這些表征包括腫瘤生長、細胞性狀轉化、細胞遷移、轉移和化藥抗性。已有文獻報導，AGR2蛋白可作為乳腺癌前期的檢測指標，同時也成為了多種癌癥中最具有潛力的靶點蛋白。18A4蛋白是將AGR2蛋白注射小鼠進行單克隆抗體實驗后所獲得的抗體之一。前期實驗已驗證18A4蛋白可有效的抑制多種腫瘤細胞的生長遷移等表征，并且我們實驗室對此蛋白及其人源化蛋白已申請了國際專利。多項研究成果表明，18A4抗體可潛在成為靶向治療腫瘤的生物藥劑。因此，找到快速、大批量、低成本、安全有效且可規模化的生產人源化抗體18A4的實驗方法刻不容緩。我們實驗室前期采用CHO細胞生產人源化18A4蛋白，目前該細胞株及其作用已申請了中國專利。然而，近幾年采用植物細胞生產重組蛋白漸漸形成了趨勢。相對傳統的表達人源化重組藥用蛋白的其他體系，采用植物生產體系有著諸多優勢，包括生產所需成本低、擴大規模快、不存在人的病原體和能夠準確地折疊和組裝復雜的蛋白質等。植物來源的親和素與β-葡萄糖醛酸苷顯示了其在商業應用上的成功，這些蛋白已經可以從Sigma公司以低于同種天然蛋白的價格獲得。這也顯示出，在植物上進行分子農場生產的產品具有和現有市場競爭的能力。經濟而又安全的植物體系有朝一日可能會在生產藥用蛋白方面優于其它蛋白生產體系，尤其是動物細胞培養體系。此外，第一支來自于植物的重組藥用蛋白Elelyso用于治療戈謝病已經被美國FDA批準進入商用過程，這是首個被FDA批準的基于植物細胞表達系統的藥物，采用懸浮培養的胡蘿卜細胞生產。它的成功展現出了采用植物體系作為人源化重組蛋白表達平臺的巨大潛力。技術實現要素：為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種抗AGR2單克隆抗體植物表達載體及其應用。為了實現上述目的及其相關目的，本發明采用如下技術方案：本發明的第一方面，提供一種T-DNA元件，所述T-DNA元件包括從5’端到3’端方向排列的抗體輕鏈克隆位點、IRES序列、抗體重鏈克隆位點。所述抗體輕鏈克隆位點用于插入抗體輕鏈序列。所述抗體重鏈克隆位點用于插入抗體重鏈序列。所述IRES序列如SEQIDNO.8所示，具體為：CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC。優選地，所述T-DNA元件包括從5’端到3’端方向排列的CPMV5’UTR序列、抗體輕鏈克隆位點、3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV序列、抗體重鏈克隆位點。所述抗體輕鏈克隆位點用于插入抗體輕鏈序列。所述抗體重鏈克隆位點用于插入抗體重鏈序列。優選地，所述CPMV5’UTR序列SEQIDNO.20所示，具體為：TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。優選地，所述3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV序列如SEQIDNO.23所示，具體為：TAACTCTGGTTTCATTAAATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTTGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTCCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACATATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。本發明的第二方面，提供一種用于轉染植物細胞的抗體表達載體，所述表達載體包括抗體基因表達單元，所述抗體基因表達單元包括從5’端到3’端方向排列的啟動子序列、T-DNA元件序列和終止子序列。所述啟動子用于啟動目的基因的表達。啟動子的類型與目的基因是否能表達及表達量息息相關。所述啟動子優選CaMV35S啟動子。所述啟動子序列如SEQIDNO.5所示，具體為：TGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACA。優選地，所述T-DNA元件包括從5’端到3’端方向排列的抗體輕鏈克隆位點、IRES序列、抗體重鏈克隆位點。所述抗體輕鏈克隆位點用于插入抗體輕鏈序列。所述抗體重鏈克隆位點用于插入抗體重鏈序列。所述IRES序列如SEQIDNO.8所示，具體為：CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC。優選地，所述T-DNA元件包括從5’端到3’端方向排列的CPMV5’UTR序列、抗體輕鏈克隆位點、3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV序列、抗體重鏈克隆位點。所述抗體輕鏈克隆位點用于插入抗體輕鏈序列。所述抗體重鏈克隆位點用于插入抗體重鏈序列。優選地，所述CPMV5’UTR序列SEQIDNO.20所示，具體為：TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。優選地，所述3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV序列如SEQIDNO.23所示，具體為：TAACTCTGGTTTCATTAAATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTTGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTCCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACATATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。所述終止子用于終止目的抗體基因的表達。所述終止子優選CaMV終止子。所述終止子序列如SEQIDNO.6所示，具體為：TTTCTCCATAAATAATGTGTGAGTAGTTTCCCGATAAGGGAAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCCAGATC。優選地，所述表達載體中還包括抗性基因。所述抗性基因用于表達載體所在宿主的篩選。例如，抗性基因可以是KanR，亦即卡那霉素抗性基因。優選地，所述表達載體中還包括選擇性標記基因。所述選擇性標記基因用于后期對于轉染后的植物細胞的篩選。例如EGFP-puromycin。優選地，所述表達載體中還包括引物的結合位點。所示引物的結合位點用于PCR引物的結合或應用于表達載體的測序。優選地，所述表達載體是由pGreenII0800質粒改造獲得。優選地，所述表達載體是在pGreenII0800質粒的左border位點和右border位點之間插入前述T-DNA元件，構建獲得。本發明第三方面公開了前述表達載體的制備方法，可采用本領域技術人員公知的常規方法來制備。例如，所述方法包括步驟：在pGreenII0800質粒的左border位點和右border位點之間插入前述T-DNA元件，構建獲得所述表達載體。本發明的第四方面提供了前述表達載體在植物體系表達人源抗體中的用途。本發明的第五方面，提供了一種人源抗體表達試劑盒，所述試劑盒包括用于轉染植物細胞的雙元載體，所述雙元載體包括前述轉染植物細胞的抗體表達載體和輔助質粒。優選地，所述輔助質粒是pSoup。本發明第六方面提供了一種表達人源抗體的方法，包括如下步驟：(1)重組載體構建：將抗體輕鏈序列和抗體重鏈序列分別插入至前述轉染植物細胞的抗體表達載體的T-DNA元件中，構建獲得重組載體；(2)轉化與表達：將步驟(1)所得重組載體和輔助質粒轉化感受態細胞，再將感受態細胞注射入植物葉子中，培養表達，獲得人源抗體。優選地，所述感受態細胞為農桿菌。本發明一優選實施例中，所述農桿菌型號為GV3101。優選地，所述輔助質粒為pSoup。優選地，所述人源抗體為人源化抗AGR2單克隆抗體。進一步優選地，抗體輕鏈序列如SEQIDNO.7所示，具體為：ATGGACATGAGGGTTCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGAGATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACCTTATCTCTCTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCAAGAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGCCAGGCCCCCAGACTCCTCATCTATCTTGCATCTAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCTAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACACTCACCATCAGCAGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCTGTGTATTACTGTCAGCACATTAGAGAGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAACTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG。抗體重鏈序列如SEQIDNO.9所示，具體為：ATGGCCACAACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCTTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATGGACTGGGTTCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACTATGACACTACTAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACAATGACTGTGGACAAGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGATGATGGGATATGGTTCCCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGACACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG。本發明的第七方面，提供一種人源化抗體，由采用前述表達人源抗體的方法獲得。優選地，所述人源化抗體為人源化抗AGR2單克隆抗體。與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明可將目的基因有效轉染至植物細胞中，并能夠有效表達目的蛋白，且轉染方法簡單高效。附圖說明圖1：PCR反應所得18A4片段1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中1為1kbMarker，2、3列為延伸溫度為65℃時的PCR產物，4、5列為延伸溫度為70℃時的PCR產物。圖2：PCR反應所得pGreenII0800片段1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中M為1kbMarker，1～6分別為梯度溫度55.4、57.2、60.1、63.1、66.2、67.2℃對應的PCR產物。圖3：質粒pGDS18A4OverlapPCR反應產物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中1為1kbMarker，2為最終的OverlapPCR反應產物。圖4：酶切鑒定反應1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中1為1kbMarker，2為質粒pGreenII0800(對照)，3為質粒18A4Hu(對照)，4～13為挑選的克隆酶切鑒定后的結果。圖5：成功構建質粒pGDS18A41％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中1為1kbMarker，2～8為所得最終質粒pGDS18A4。圖6：使用SnapGeneViewer軟件畫出的pGDS18A4質粒結構示意圖。圖7：片段CAMV.CPMV，Tnos和3’UTR的PCR反應產物2％瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖；其中1為5000bpMarker，2為片段CAMV.CPMV(904bp)，3為片段Tnos(252bp)，4為片段3’UTR(183bp)。圖8：片段3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV5’UTR的PCR反應產物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中1為1kbMarker，2為PCR反應產物條帶。圖9：質粒pGDS18A4cpmv.3I酶切鑒定1％瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖；其中M為1kbMarker；1和6為質粒pGDS18A被BglII和HindIIII酶消化后的結果，做為陰性對照；2～5為所挑選的克隆pGDS18A4cpmv.3I3A7，3A11，31K，31L被BglII酶消化后的結果，7～10為所挑選的克隆pGDS18A4cpmv.3I3A7，3A11，31K，31L被HindIII酶消化后的結果。圖10：溫室中按照正確的培養方法培養4-5周后的煙草示意圖。圖11：菌液注射至煙草葉子背面的操作示意圖。圖12：用構建的質粒轉化到煙草葉子中3天后綠熒光的表達情況示意圖，其中左圖為初始質粒，右圖為優化后的質粒轉化至煙草葉子中的綠熒光表達情況。圖13：人源化抗體18A4SDS-PAGE檢測結果示意圖；其中，1為蛋白Marker，2和3為沒有轉化過質粒的煙草葉子裂解液(作為陰性對照)，4為轉化質粒pGDS18A4后煙草葉子裂解液，5～8為轉化不同克隆質粒pGDS18A4cpmv3I后煙草葉子裂解液。圖14：人源化抗體18A4westernblotting實驗熒光二抗檢測結果示意圖；其中，1為人IgG蛋白(作為陽性對照)，2為蛋白Marker，3和4為未轉化質粒的煙草葉子裂解液(作為陰性對照)，5為轉化質粒pGDS18A4cpmv.3I后煙草葉子裂解液。具體實施方式在進一步描述本發明具體實施方式之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本
技術領域：
技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本
技術領域：
的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術領域：
常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。實施例1：植物體系表達人源化抗AGR2單克隆抗體18A4的質粒(pGDS18A4)的構建1.實驗方法1)OverlapPCR反應的兩對引物設計先使用PrimerPremier5軟件對兩部分片段分別在接口位置設計引物。再將兩段引物拼接起來成為一條長的引物，那么這條長的引物就同時包含了18A4和pGreenII0800載體兩部分片段。使用同樣方法分別在兩個接口位置設計兩對長引物。引物序列見表1：表1overlapPCR反應的引物序列(primersequence)2)片段18A4的PCR反應片段18A4即為質粒pGDS18A4的T-DNA部分，此部分包含抗體的輕鏈、IRES1、抗體重鏈、IRES2和EGFP-puromycin融合蛋白，大小為4840bp。以p15-Agtuzumab表達載體為模板，表1中的18A4HuFN、18A4HuRN為引物進行PCR反應。PCR反應采用兩步法，循環參數為98℃20s，95℃1min，70℃/65℃5.5min，25個循環，hold4℃。反應體系見表2：表2PCR反應各組分ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul10uMPrimerforward1.5ul10uMPrimerreverse1.5ulTemplateDNA(ng)5ngKODFX1ulddH2OTo50ul3)片段pGreenII0800載體部分的PCR反應片段pGreenII0800載體部分即為質粒pGDS18A4的載體部分。此部分包含了pSaORI、LeftBorderRepeat(LB)、CaMV35Spromoter、KanR、pUcORI、RightBorderRepeat(RB)、CaMVTerminator，大小為3198bp。以pGreenII0800質粒為模板，表1中的PG0800FN、PG0800RN為引物進行PCR反應。PCR反應采用兩步法，循環參數為98℃20s，95℃1min，55-68℃3.3min，25個循環，hold4℃。本次PCR反應使用梯度溫度，設定55.4、57.2、60.1、63.1、66.2、67.2℃6個梯度。反應體系與上一步片段18A4的PCR反應體系相同，見表2。4)片段18A4與片段pGreenII0800的overlapPCR反應將上述所得片段18A4與片段pGreenII0800以一定比例混合，再加入反應所需的酶，Buffer和dNTPs進行最終的OverlapPCR反應。反應的循環參數為98℃30s，72℃10min，15個循環，72℃20min。最終所得質粒pGDS18A4的大小應為8032bp。具體反應體系見表4。表4OverlapPCR反應各組分ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul片段18A41ug片段pGreenII08005ugKODFX1ulddH2OTo50ul5)質粒的轉化、抽提、酶切鑒定及測序取上述所得OverlapPCR反應產物5ul加到50ul的感受態細胞(DH5α)中，輕輕搖勻，冰浴30min。42℃熱激90s，快速轉到冰浴2-3min，注意不要搖動管。向管中加入500ul的LB培養基，150rmp，37℃，搖45min。將菌液全部涂到含100ug/mlKanamycin的LB平板上。將平板正置直至液體全部吸收。倒置平板，于37℃培養16h。挑取轉化后的單菌落，接種到2ml含有卡那霉素(100μg/ml)的LB培養基中，37℃，150rpm，搖床培養12～16h。使用北京索萊寶生物科技有限公司的質粒小抽試劑盒進行質粒抽提。所得最終質粒當中應含有三個BglII的酶切位點，故使用BglII酶對所得質粒進行酶切鑒定。酶切鑒定體系見表5。表5質粒pGDS18A4酶切鑒定反應各組分最后將挑選酶切鑒定中獲得的正確的質粒送公司測序進行最終的驗證。2.實驗結果PCR反應所得18A4片段1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。其中1為1kbMarker，2、3列為延伸溫度為65℃時的PCR產物，4、5列為延伸溫度為70℃時的PCR產物。從結果可得，延伸溫度為65℃時不能得到18A4片段，將延伸溫度提高至70℃時可得到大小正確的18A4片段，大小為4840bp。PCR反應所得pGreenII0800片段1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示。其中1～6分別為梯度溫度對應的PCR產物，結果可知此步PCR反應中溫度對產物影響不大，6個梯度溫度均能得到正確大小的pGreenII0800片段，大小為3198bp。OverlapPCR反應1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3所示。其中1為1kbMarker，2為最終的OverlapPCR反應產物，大小為8032bp。酶切鑒定結果1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖4所示。最終的pGDS18A4質粒中含有三個BgLII的酶切位點，所切出來的片段大小應為4450bp、2495bp和2087bp。結果可知克隆5、20、24的酶切鑒定結果正確。將這三個克隆質粒進行測序。最后的測序結果顯示，這三個克隆即為構建成功的pGDS18A4質粒，且不含有任何突變。成功獲得pGDS18A4質粒。具體地，CaMV35Spromoter的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，具體為：TGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACA。CaMVTerminator的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具體為：TTTCTCCATAAATAATGTGTGAGTAGTTTCCCGATAAGGGAAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCCAGATC。T-DNA部分，抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，具體為：ATGGACATGAGGGTTCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGAGATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACCTTATCTCTCTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCAAGAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGCCAGGCCCCCAGACTCCTCATCTATCTTGCATCTAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCTAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACACTCACCATCAGCAGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCTGTGTATTACTGTCAGCACATTAGAGAGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAACTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG。IRES1的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，具體為：CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC。抗體重鏈的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，具體為：ATGGCCACAACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCTTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATGGACTGGGTTCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACTATGACACTACTAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACAATGACTGTGGACAAGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGATGATGGGATATGGTTCCCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGACACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG。IRES2的核苷酸序列與IRES1的核苷酸序列相同。pGDS18A4質粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖5所示。質粒大小為8032bp。使用SnapGeneViewer軟件畫出的pGDS18A4質粒結構如圖6所示。實施例2：優化質粒pGDS18A4.CPMV.3I的構建1.實驗方法CPMV(Cowpeamosaicvirus)是豇豆花葉病毒，此病毒為RNA病毒，由兩條RNA鏈組成。其中RNA-2上的5’UTR和3’UTR可保護該病毒在侵入宿主細胞后RNA不被降解，從而達到提高RNA翻譯、蛋白表達的效果。pGDS18A4.CPMV.3I的優化即為將初始質粒pGDS18A4中的IRES1替換為3’UTR、Tnos、CAMV-CPMV，并在輕鏈前插入CPMV5’UTR。本實施例中優化質粒的構建同樣使用OverlapPCR反應。具體構建步驟如下：(1)片段3’UTR、Tnos、CAMV-CPMV、5’UTR的PCR反應先在NCBI網站上查到CPMV病毒的5’UTR、Tons、3’UTR的序列并合成出來。以合成出來的序列為模板進行PCR擴增反應。其中CAMV-CPMV5’UTR片段大小為904bp，3’UTR片段大小為183bp，Tnos片段大小為252bp。PCR反應的循環參數為98℃1min，95℃30s，55℃30s，68℃Xmin(1min/1kb)，20個循環，68℃10min。PCR反應所需引物序列見表6。表6片段3’UTR、Tnos、CAMV-CPMV5’UTR的PCR反應引物序列(2)質粒pGDS18A4.CPMV.3I的OverlapPCR反應反應所需的引物見表7，反應體系見表8。表7OverlapPCR反應引物序列(primer)表8OverlapPCR反應各組分ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul片段1ugvector片段5uginsertKODFX1ulddH2OTo50ul(3)轉化、質粒抽提、酶切鑒定及測序本實施例質粒的轉化及抽提步驟見質粒pGDS18A4的轉化、抽提。質粒pGDS18A4cpmv3I含有4個BglII酶切位點，2個HindIII酶切位點，故用這兩種酶對這種質粒進行酶切鑒定。酶切鑒定體系見表9。表9質粒pGDS18A4cpmv3I酶切鑒定反應各組分最后將挑選酶切鑒定中獲得的正確的質粒送公司測序進行最終的驗證。2.實驗結果片段CAMV.CPMV，Tnos和3’UTR的PCR反應產物2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖7所示。其中1為5000bpMarker，2為片段CAMV.CPMV(904bp)，3為片段Tnos(252bp)，4為片段3’UTR(183bp)。從瓊脂糖凝膠電泳檢測結果來看，PCR反應所得到的條帶單一，說明PCR產物較純，反應較好。片段3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV5’UTR的PCR反應產物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖8所示。其中1為1kbMarker，2為PCR反應產物條帶。條帶單一，較純，因此無需純化，可直接用于下一步的OverlapPCR反應。質粒pGDS18A4cpmv.3I酶切鑒定1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖9所示。其中M為1kbMarker。1和6為質粒pGDS18A被BglII和HindIIII酶消化后的結果，做為陰性對照。2～5為所挑選的克隆pGDS18A4cpmv.3I3A7，3A11，31K，31L被BglII酶消化后的結果，7～10為所挑選的克隆pGDS18A4cpmv.3I3A7，3A11，31K，31L被HindIII酶消化后的結果。質粒pGDS18A4cpmv.3I應有4個BglII的酶切位點，2個HindIII的酶切位點，故克隆31K，31L的酶切鑒定結果正確，進行下一步測序。將質粒pGDS18A4cpmv.3I31K，31L進行測序，測序結果與理論序列結果完全一致，即成功構建了優化質粒pGDS18A4cpmv.3I。具體地，CPMV5’UTR的核苷酸序列SEQIDNO.20所示，具體為：TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。3’UTR的核苷酸序列SEQIDNO.21所示，具體為：TAACTCTGGTTTCATTAAATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTTGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATT。Tnos的核苷酸序列SEQIDNO.22所示，具體為：CCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTG。3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV的核苷酸序列如SEQIDNO.23所示，具體為：TAACTCTGGTTTCATTAAATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTTGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTCCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACATATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。實施例3：煙草葉子中人源化抗體18A4的表達1.實驗方法1)煙草的培養：將煙草種子種進肥沃的土壤里，生長所需條件為溫度24℃，濕度40％～65％，光照周期為14h光照/10黑暗(需在溫室中進行培養)。當煙草長至4-5周后即可使用。注：煙草不可培養至過老，否則影響目標蛋白的表達。2)質粒pGDS18A4、pGDS18A4cpmv.3I轉化至煙草葉子中的轉化方法：本次實驗采用的是農桿菌介導的轉化，先將目標質粒轉化至農桿菌中，再將農桿菌注射進煙草葉子中，由農桿菌浸染煙草葉子，從而達到最終轉化的目的。而本次實驗采用的農桿菌型號為GV3101，質粒載體pGreenII0800的輔助質粒為pSoup。具體操作步驟如下：各取5ul的2種目標質粒質粒分別加入含50ulGV3101農桿菌感受態細胞的1.5ml離心管中，再依次加入5ul質粒pSoup，混勻，置于冰上30min。將離心管轉移至液氮中4min。然后37℃水浴4min。再向離心管中加入300ulLB培養基，30℃220rpm，搖3h。搖床期間準備4塊含有利福平，四環素和卡那霉素的LB固體培養板，所需抗生素的終濃度分別為利福平100ug/ml，四環素15ug/ml，卡那霉素100ug/ml。搖床結束后，取離心管中300ul農桿菌培養液進行涂板。將平板倒置于培養箱中，28℃培養2-3天。培養板上會長出農桿菌的單克隆，用20ul的白色小槍頭挑取單克隆后置于5ml含有上述3種抗生素的LB液體培養基中進行過夜搖床培養，條件為30℃，220rpm，16h。次日，將5ml農桿菌培養液進行離心，4000rpm，5min。棄上清。用MS培養基調菌液濃度，此步驟需要使用分光光度計，濃度調整至OD600nm為0.6。再加入0.5M的MES緩沖液和0.2uMAS(乙酰丁香酮)，混勻后黑暗室溫靜置3h。取上述液體使用1ml注射器注射至煙草葉子的背面，即完成煙草葉子轉化的全過程。將煙草放置避光處培養2-3后，使用熒光顯微鏡檢測煙草葉子中的綠熒光表達情況，拍照保存結果。3)Westernblotting檢測煙草葉子中人源化抗體18A4的表達：樣品的處理：剪取100mg煙草葉子，使用研磨儀對煙草葉子進行粉碎處理。向煙草粉末中加入200ul含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液和10％的蛋白上樣緩沖液，混勻后，置于95℃水浴鍋，5min，進行蛋白變性處理。蛋白膠的制備：人源化抗體18A4蛋白的大小約為150KDa，故需制備12％的蛋白膠。制備蛋白膠的過程詳見《分子克隆實驗指南-下冊》1713頁(蛋白質的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)。SDS-PAGE：將樣品上樣后，蓋上蓋子，啟動電泳儀(濃縮膠80V，大約30min；分離膠120V)，啟動后可看見兩塊膠中間會出現大量氣泡，即說明已啟動；注意如果兩塊膠中間的runningbuffer沒有加滿，則會發生短路。進入分離膠后，可看見marker的條帶開始分離，但所需蛋白大小的條帶在分離膠中明顯可見、并與其他條帶分開時，就可以停止電泳。轉膜：打開蓋子，將支架取出，倒掉緩沖液，去除固定架，將兩塊玻璃板分開后用刀片切去壓縮膠的部分，在一個大皿中倒入1×blottingbuffer，將分離膠放入其中。裁減適當大小的6張濾紙(比膠大，比海綿層小都可以)，放入上述大皿中，使其浸濕。裁減同膠一樣大的硝酸纖維素膜(用白色紙保護的)，放入上述大皿中，使其浸濕。將轉移器材打開，黑色一面朝下，將海綿浸濕，覆蓋在黑面上，倆手拿著一張濾紙的上沿將濾紙提起，從另一端起，慢慢將濾紙放在海綿上，注意兩者之間不要產生氣泡，如有氣泡，用一根試管加點blottingbuffer，然后滾動著將氣泡趕去，如上再放上兩片濾紙，總共三層。之后，將膠以放濾紙的方法放在濾紙上，如果膠的邊緣部分有些卷邊，則可以用刀片切去一小部分。同樣注意不要產生氣泡。在膠的一個角上用鉛筆做上標記，以表示其為正面，并說明膜的內容，雙手提起膜，將做標記的一面向下，由下向上緩慢將膜覆蓋在膠上，去除兩者之間的氣泡。同上述方法放上三張濾紙，蓋上海綿，再將轉移盒合上。將轉移盒放入轉移槽中，注意正負極方向，將blottingbuffer倒入其中，直至覆蓋住膠和膜所在的位置。轉膜條件為4℃(冰水浴)，300mA，0.5-1.5h。封閉：加封閉液(TNET中加5％脫脂奶粉，在磁力攪拌器上攪拌約1h，保證奶粉充分溶解)室溫封閉1h(需置于搖床上，輕輕搖晃)。孵育抗體：本次實驗使用的熒光二抗是goatanti-humanIgG800，將其溶于含有2.5％BSA的TNET中(1：20000稀釋)。將已配制好的抗體倒入密封袋中，同時將上一步封閉好的膜轉移至含有抗體的密封袋中，去除密封袋中的氣泡。將密封袋置于搖床上，輕輕搖晃，室溫孵育1h。蛋白膜的檢測：使用掃膜儀進行掃膜，保存結果圖片。2.實驗結果按照正確的培養方法培養4-5周后的煙草如圖10所示，其葉子大小適中。將菌液注射至煙草葉子背面的操作如圖11所示，注意注射時候不可太用力，以免造成對煙草葉子的損傷。所構建的2種質粒轉化到煙草葉子中3天后綠熒光的表達情況如圖12所示。其中左圖為初始質粒，右圖為優化后的質粒。由結果可知，初始質粒的綠熒光表達量較低，而優化后的質粒pGDS18A4.cpmv3I的綠熒光表達量明顯提高。人源化抗體18A4SDS-PAGE檢測結果如圖13所示。其中，1為蛋白Marker，2和3為沒有轉化過質粒的煙草葉子裂解液(作為陰性對照)，4為轉化質粒pGDS18A4后煙草葉子裂解液，6～9為轉化不用克隆質粒pGDS18A4cpmv3I后煙草葉子裂解液。由結果可以看出，優化后質粒pGDS18A4cpmv3I的抗體蛋白表達量明顯提高。人源化抗體18A4westernblotting實驗熒光二抗檢測結果如圖14所示。其中，1為人IgG蛋白(作為陽性對照)，2為蛋白Marker，3和4為未轉化質粒的煙草葉子裂解液(作為陰性對照)，5為轉化質粒pGDS18A4cpmv.3I后煙草葉子裂解液。由結果可知，質粒pGDS18A4cpmv.3I能明顯看到人源化抗體18A4的輕鏈和重鏈的表達條帶。且優化質粒pGDS18A4cpmv.3I的抗體蛋白表達量明顯提高。以上所述，僅為本發明的較佳實施例，并非對本發明任何形式上和實質上的限制，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還將可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，當可利用以上所揭示的技術內容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發明的技術方案的范圍內。SEQUENCELISTING<110>上海交通大學<120>植物體系表達人源化抗AGR2單克隆抗體18A4的質粒構建<130>165020<160>25<170>PatentInversion3.3<210>1<211>46<212>DNA<213>Artificial<220><223>18A4HuFN<400>1acagcccaagctctagccaccatggacatgagggttcctgctcagc46<210>2<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>18A4HuRN<400>2cgaattctctagaattacacgcgtataatgtatgctatacgaagttattcag52<210>3<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>PG0800FN<400>3ctgaataacttcgtatagcatacattatacgcgtgtaattctagagaattcg52<210>4<211>46<212>DNA<213>Artificial<220><223>PG0800RN<400>4gctgagcaggaaccctcatgtccatggtggctagagcttgggctgt46<210>5<211>346<212>DNA<213>Artificial<220><223>CaMV35Spromoter<400>5tgagacttttcaacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctat60ctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattg120cgataaaggaaaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacc180cccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagt240ggattgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgca300agacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggaca346<210>6<211>177<212>DNA<213>Artificial<220><223>CaMVTerminator<400>6tttctccataaataatgtgtgagtagtttcccgataagggaaattagggttcttataggg60tttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatac120ttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatc177<210>7<211>723<212>DNA<213>Artificial<220><223>抗體輕鏈<400>7atggacatgagggttcctgctcagctcctgggactcctgctgctctggctcccaggtgcc60agatgtgagattgtgctgacacagtctcctgccaccttatctctctctccaggggagagg120gccaccctgagctgcagggccagcaagagtgtcagtacatctggctatagttatatgcac180tggtaccaacagaaaccaggccaggcccccagactcctcatctatcttgcatctaaccta240gaatctgggatccctgctagattcagtggcagtgggtctgggacagacttcacactcacc300atcagcaggctggaacctgaggacttcgctgtgtattactgtcagcacattagagagctt360cctcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatct420gtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc480ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctc540caatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagc600ctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaactctacgcctgc660gaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt720tag723<210>8<211>587<212>DNA<213>Artificial<220><223>IRES1<400>8cccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtg60tgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccg120gaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaagg180aatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagaca240aacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcct300ctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgcca360cgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaa420ggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggta480cacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacgg540ggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaacc587<210>9<211>1422<212>DNA<213>Artificial<220><223>抗體重鏈<400>9atggccacaaccatggactggacctggagcatccttttcttggtggcagcagcaacaggt60gcccactcccaggtccagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggagcttca120gtgaaggtttcctgcaaggcttctggatacacattcactgactacaacatggactgggtt180cgacaggcccctggacagggccttgagtggattggagatattaatcctaactatgacact240actagctacaaccagaagttccagggcagagtgacaatgactgtggacaagtccacgagc300acagcctacatggagctcagcagcctgagatctgaggacactgcagtctattactgtgca360agatcgatgatgggatatggttcccctatggactactggggtcaaggcacactggtcacc420gtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagc480acctctgggggcacagcagccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtg540acggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtccta600cagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttggac660acccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaa720gttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactc780ctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcc840cggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag900ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag960cagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg1020aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaa1080accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc1140cgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccc1200agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacg1260cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaag1320agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac1380cactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag1422<210>10<211>54<212>DNA<213>Artificial<220><223>LC3UTRF<400>10gagcttcaacaggggagagtgttagtaactctggtttcattaaattttctttag54<210>11<211>51<212>DNA<213>Artificial<220><223>cp3utrtnosr<400>11gaacgatcggggaaattcgagctggaataaaattaaaatctttttgtgtcc51<210>12<211>51<212>DNA<213>Artificial<220><223>CP3UTRTnosF<400>12ggacacaaaaagattttaattttattccagctcgaatttccccgatcgttc51<210>13<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>TnosCAMVR<400>13ctttgacatttttggagtaggggtaccactgatagtttaattcccgatctag52<210>14<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>TnosCAMVF<400>14ctagatcgggaattaaactatcagtggtacccctactccaaaaatgtcaaag52<210>15<211>47<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPMVHCR<400>15gtccagtccatggttgtggccatttcaaatttgggcagaatatacag47<210>16<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>PG0800P1R<400>16gtggctagagcttgggctgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatag52<210>17<211>46<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPMVP2F<400>17atggacatgagggttcctgctcagctcctgggactcctgctgctct46<210>18<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>PG0800P1F<400>18ctatataaggaagttcatttcatttggagaggacagcccaagctctagccac52<210>19<211>46<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPMVP2R<400>19agagcagcaggagtcccaggagctgagcaggaaccctcatgtccat46<210>20<211>511<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPMV5'UTR<400>20tattaaaatcttaataggttttgataaaagcgaacgtggggaaacccgaaccaaaccttc60ttctaaattctctctcatctctcttaaagcaaacttctctcttgtctttcttgcatgagc120gatcttcaacgttgtcagatcgtgcttcggcaccagtacaatgttttctttcactgaagc180gaaatcaaagatctctttgtggacacgtagtgcggcgccattaaataacgtgtacttgtc240ctattcttgtcggtgtggtcttgggaaaagaaagcttgctggaggctgctgttcagcccc300atacattacttgttacgattctgctgactttcggcgggtgcaatatctctacttctgctt360gacgaggtattgttgcctgtacttctttcttcttcttcttgctgattggttctataagaa420atctagtattttctttgaaacagagttttcccgtggttttcgaacttggagaaagattgt480taagcttctgtatattctgcccaaatttgaa511<210>21<211>183<212>DNA<213>Artificial<220><223>3'UTR<400>21taactctggtttcattaaattttctttagtttgaatttactgttatttggtgtgcatttc60tatgtttggtgagcggttttctgtgctcagagtgtgtttattttatgtaatttaatttct120ttgtgagctcctgtttagcaggtcgtcccttcagcaaggacacaaaaagattttaatttt180att183<210>22<211>288<212>DNA<213>Artificial<220><223>Tnos<400>22ccagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatc60ctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaa120taattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccca180attatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatc240gcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattaaactatcagtg288<210>23<211>1328<212>DNA<213>Artificial<220><223>3'UTR+Tnos+CAMV-CPMV<400>23taactctggtttcattaaattttctttagtttgaatttactgttatttggtgtgcatttc60tatgtttggtgagcggttttctgtgctcagagtgtgtttattttatgtaatttaatttct120ttgtgagctcctgtttagcaggtcgtcccttcagcaaggacacaaaaagattttaatttt180attccagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattga240atcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatg300taataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcc360ccaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaatt420atcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattaaactatcagtgtgagacttt480tcaacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactt540catcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaagg600aaaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccac660gaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatg720tgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttc780ctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacatattaaaatcttaataggttttg840ataaaagcgaacgtggggaaacccgaaccaaaccttcttctaaattctctctcatctctc900ttaaagcaaacttctctcttgtctttcttgcatgagcgatcttcaacgttgtcagatcgt960gcttcggcaccagtacaatgttttctttcactgaagcgaaatcaaagatctctttgtgga1020cacgtagtgcggcgccattaaataacgtgtacttgtcctattcttgtcggtgtggtcttg1080ggaaaagaaagcttgctggaggctgctgttcagccccatacattacttgttacgattctg1140ctgactttcggcgggtgcaatatctctacttctgcttgacgaggtattgttgcctgtact1200tctttcttcttcttcttgctgattggttctataagaaatctagtattttctttgaaacag1260agttttcccgtggttttcgaacttggagaaagattgttaagcttctgtatattctgccca1320aatttgaa1328<210>24<211>55<212>DNA<213>Artificial<220><223>CAMV-CPMVF<400>24cctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacagcccaagctctagccac55<210>25<211>55<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPMV-CAMVR<400>25gtggctagagcttgggctgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagagg55當前第1頁1 2 3