大腸桿菌重組雞α干擾素、重組表達載體、重組表達工程菌及其制備方法和應用與流程

本發明涉及一種大腸桿菌重組雞α干擾素，同時還涉及重組表達載體、重組表達工程菌及其制備方法和應用，屬于基因工程領域。

背景技術：

我國是一個農業大國，養殖業在我國占有重要地位。但由于經濟發展不平衡等因素，目前養禽業存在著多種飼養模式并存、疫病情況復雜、家禽及其制品流通不規范等問題。據不完全統計，對養禽業造成危害的疫病已達80余種，其中以傳染病為多，約占禽病總數的75％以上。據估計，我國每年因各類禽病所致家禽死亡率高達20％，遠遠高于發達國家8％的水平。

近年來，雞馬立克氏病、新城疫、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎、禽流感、傳染性貧血、減蛋綜合征等病毒病已給養禽業帶來巨大的經濟損失。如2015年6月在山東、河南、安徽等地發生的以心包積液為特點，以肉食雞、三黃雞、麻黃雞為主的死亡病癥，發病無特征，出現蒸籠死亡、添加抗菌藥物治療加速等現象，家禽死亡率高達90％，已成為危害養雞業最為嚴重的疾病之一。該病為安卡拉病毒病(心包積水-肝炎癥)，由禽腺病毒(adenovirus，fav)引起，主要感染5～11周齡蛋雞，發病率高，發病速度快，包括垂直傳播和水平傳播，日齡越小發病率越高，死亡也越多，成年雞也有發生。解剖主要表現為心包積水，約10～30毫升黃色透明液體。目前針對安卡拉病毒病暫無較好的預防和治療方法，主要采用將禽腺病毒疫苗與卵黃抗體相結合的方式防控。有專家稱抗病毒藥物-干擾素可能對腺病毒有較好的治療效果。

干擾素(interferonalpha，ifn-α)是一類具有抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲和調節機體免疫(免疫佐劑)作用的糖蛋白。chifn-α具有安全性高、毒副作用小、效果迅速等特點，是治療現代禽類疾病的理想藥物之一。chifn-α經基因工程改造后可延長半衰期，使效力更加穩定持久。

近年來，各國學者廣泛開展禽類重組干擾素的抗病毒研究。王新衛等將h9n2亞型禽流感病毒與干擾素一同接種雞胚，運用ha方法測定病毒效價，研究發現干擾素抑制h9n2亞型禽流感病毒在雞胚內增殖，并表現出劑量依賴性。王艷等研究發現給雛雞注射干擾素可以提高新城疫滅活苗抗體的滴度。經研究證實，重組雞a-干擾素能夠顯著抑制新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、馬立克病毒、禽流感病毒等的增殖，展現出廣闊的應用前景。因此，研制一種抗fav重組雞a-干擾素具有重要的社會意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種大腸桿菌重組雞α干擾素。

同時，本發明還提供一種編碼上述雞α干擾素的核苷酸序列。

再者，本發明提供一種包含上述序列的重組表達載體，以及包含該重組表達載體的重組表達工程菌。

最后，本發明提供一種上述雞α干擾素的制備方法和應用。

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：

大腸桿菌重組雞α干擾素(rchifn-α)，由seqidno:1所示的核苷酸序列編碼。

編碼大腸桿菌重組雞α干擾素的核苷酸序列如seqidno:1所示，是根據大腸桿菌密碼子偏嗜性優化得到的開放閱讀框。

重組表達載體，其上插入有如seqidno:1所示的編碼大腸桿菌重組雞α干擾素的核苷酸序列。

重組表達載體的制備方法，包括以下步驟：以bglⅱ、hindⅲ限制性內切酶雙酶切出發載體和seqidno:1所示的核苷酸序列，回收酶切片段，連接，轉化大腸桿菌，提取質粒后鑒定，得到重組表達載體。

重組工程菌，具體的，包含上述重組表達載體。

大腸桿菌重組雞α干擾素的制備方法，包括以下步驟：取上述重組工程菌培養，誘導表達后收集菌體，破碎，提純蛋白，即得。

大腸桿菌重組雞α干擾素在制備抗病毒藥物中的應用。具體的，在制備抗禽腺病毒-4型(fav-4)藥物中的應用。

大腸桿菌重組雞α干擾素在抑制禽腺病毒-4型對雞胚腎細胞致病變作用，以及在雞胚上增殖、在雞體內復制中的應用。

本發明的有益效果：

本發明通過優化雞α干擾素基因序列并合成全基因，然后構建重組表達載體轉化大腸桿菌，最后通過誘導表達和蛋白純化獲得純度和含量較高的rchifn-α蛋白。重組干擾素rchifn-α在cek細胞、雞胚上和雞體內對fav-4均具有抗病毒作用。其中，在cek細胞上的抗病毒活性為4.17×10⁶iu/ml；在雞胚上能明顯抑制fav-4增殖，延遲雞胚的死亡時間；在雞體內也能顯著抑制fav-4復制，延遲感染雞的死亡時間。說明重組干擾素rchifn-α對fav-4具有較好的抗病毒作用。

附圖說明

圖1為pet-30a-chifn-α-opti雙酶切鑒定電泳圖；

圖2為rchifn-α重組蛋白的sds-page分析圖；

圖3為rchifn-α純化蛋白的sds-page分析圖；

圖4為感染禽腺病毒-4型病毒的cek細胞形態圖；

圖5為經重組干擾素rchifn-α作用的cek細胞形態圖；

圖6為空白對照組的cek細胞形態圖。

具體實施方式

下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。

實施例1

根據大腸桿菌密碼子偏嗜性對chifn-α序列(genbank：dq226094)進行優化，得到優化后的開放閱讀框(如seqidno:1所示)。分別在優化序列的5’端(bglⅱ)和3’端(hindⅲ)添加酶切位點(見下劃線部分)，得到chifn-α-opti序列，如下所示：

實施例2

pet-30a-chifn-α-opti表達載體，其構建步驟為：

1、puc-sp-chifn-α-opti基因克隆載體的合成

根據chifn-α-opti基因序列和puc-sp載體設計合成puc-sp-chifn-α-opti，酶切位點為bglⅱ(上游)、hindⅲ(下游)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、pet-30a-chifn-α-opti基因表達載體的構建與鑒定

1)chifn-α-opti基因與pet-30a(+)的雙酶切

取載體puc-sp-chifn-α-opti和載體pet-30a(+)適量，用bglⅱ和hindⅲ酶切消化。酶切反應體系見下表1。

表1載體酶切反應體系

上述各體系混勻后在孵育器37℃孵育1h，再加入2μlloadingbuffer終止反應。

2)酶切產物的連接與轉化

將chifn-α-opti序列(如seqidno:2所示)和酶切后的pet-30a(+)用t4dna連接酶連接，連接體系見下表2。

表2連接體系

體系混勻后于孵育器上16℃過夜連接；第二天，將dh5α感受態細胞從-80℃冰箱取出，置于冰上融化，取10μl連接產物加入到感受態細胞中，冰浴30min后42℃熱激45s，將熱激后的感受態細胞迅速置于冰上2min，加入500μl不含抗生素的液體lb培養基，置于37℃、220r/min搖床培養1h；培養后取出100μl菌液均勻涂抹于含卡那霉素(k⁺)的lb固體平板上，置于37℃溫箱中倒置過夜培養，培養16h后隨機挑取大小適中的單菌落至k⁺lb液體培養基中，37℃、220r/min培養14h。

3)重組質粒的提取和酶切鑒定

按照質粒抽提試劑盒說明書提取重組質粒，具體操作步驟如下：取細菌培養物于1.5mlep管中，8000r/min離心60s棄上清；沉淀重懸于250μl4℃resuspensionbuffer(用前加入rnase)中；加入250μllysisbuffer，輕柔顛倒ep管(勿震蕩，以防dna被剪切，反應不能超過5min)；加入350μlneutralizationbuffer，立即輕柔顛倒ep管，13000r/min離心8min，直至形成緊密白色沉淀；將離心后的上清液轉移到spincolumn內，6000r/min離心60s，棄廢液；向spincolumn內加650μlwashbuffer，l2000r/min離心60s，棄廢液，重復一次；再次于l2000r/min離心1min，然后向spincolumn內加50μlelutionbuffer，室溫靜置1min；12000r/min離心1min，收集濾液，-20℃保存備用。

提取的質粒用限制性內切酶bglⅱ和hindⅲ雙酶切鑒定，結果見圖1(圖中m1：dl5000marker，m2：dl2000marker，1：pet-30a-chifn-α-opti雙酶切產物)。由圖1可知，雙酶切鑒定結果與預期一致，將正確的重組質粒命名為pet-30a-chifn-α-opti。

實施例3

bl21(de3)/pet-30a-chifn-α-opti重組工程菌，其構建步驟為：將上述陽性pet-30a-chifn-α-opti重組質粒轉化bl21(de3)感受態細胞(操作同上)，培養后取菌液均勻涂抹于含卡那霉素(k⁺)的lb固體平板上，置于37℃溫箱中倒置過夜培養；挑取k⁺lb平板上的白色單個菌落，接種于5ml含k⁺的lb培養液中，20℃、220r/min搖床培養14h，即得。

實施例4

大腸桿菌重組雞α干擾素的制備，包括以下步驟：

1、蛋白表達

1)chifn-α-opti基因的原核表達

取上述重組工程菌菌液，加入100ml含k⁺的lb培養基中(1:50接種)，20℃、220r/min培養至od600值為0.6，加入iptg誘導劑，使其終濃度為0.2mol/l，誘導表達12h。

2)重組蛋白rchifn-α的sds-page電泳鑒定

取上述菌液于8000rpm、4℃離心10min，棄上清，將沉淀用20mlpbs溶液重懸，于冰浴中超聲至清亮(250w，超聲5s，間歇5s，功率35％)；破碎后菌液于12000rpm、4℃離心15min，分別標記為超聲上清和超聲沉淀。

裝配好凝膠板，按12％的濃度配制分離膠，加矮面凝膠板的4/5，(切忌產生氣泡，否則影響電泳結果)，以去離子水壓平分離膠面，室溫放置，待水與膠出現明顯界線，表明分離膠已凝固，倒置控出去離子水，用濾紙將殘留的水除去。然后按配制濃縮膠，加入到凝膠板中，插入梳子，加入電泳液備用。

電泳分析：取20μl樣品加樣，以120v電壓進行濃縮膠電泳，以180v電壓進行分離膠電泳，溴酚藍指示劑到達分離膠底部時，電泳結束。考馬斯亮藍染色、脫色液脫色后進行觀察，電泳結果見圖2(圖中m：蛋白marker，1：誘導的空載體，2：誘導的重組菌液，3：誘導破碎后上清，4：誘導破碎后沉淀)。由圖2可知，重組蛋白大小約為25kd，與預測大小一致。并且，重組蛋白存在于超聲上清中，以可溶形式存在。

2、蛋白純化

1)rchifn-α蛋白的大量表達

挑取上述陽性克隆，接種于lb培養液中，37℃、220r/min振搖培養過夜；培養后菌液按1:50的比例轉種于500mllb卡那陽性培養基中，37℃、220r/min振搖培養至菌液od600值約為0.6，加入終濃度0.2mmol/l的iptg，20℃、220r/min振搖培養12h，取菌液于8000rpm、4℃離心10min，收集菌體。

2)超聲波破碎

稱重菌體濕重，按每克菌濕重加入10ml裂解緩沖液(預先加入蛋白酶抑制混合液10μl/ml)，重懸菌液；將菌液于冰浴中超聲至清亮(250w，超聲5s，間歇5s，功率35％)。破碎后菌液于12000rpm、4℃離心15min，取上清。

3)組裝層析柱

將ni-agaroseresin填料混勻后加入層析柱中，室溫靜置10分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出；向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水，將乙醇沖洗干凈后，再用8倍柱體積的bindingbuffer平衡柱子，平衡結束后即可上樣(柱體積指的是填料的體積)。

4)蛋白純化

取離心后的上清負載上柱，流速為10倍柱體積/小時，收集流穿液；使用15倍柱體積的bindingbuffer沖洗柱子，洗去雜蛋白；使用適量elutionbuffer洗脫，收集洗脫峰；洗脫后，依次使用5倍柱體積的bindingbuffer，5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20％乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒)，封柱后4℃保存(2～8℃均可)。

5)sds-page電泳分析

在純化后的蛋白中加入蛋白上樣緩沖液加熱煮沸10min，每孔上樣20μl，蛋白marker上樣5μl，緩慢注入上樣孔，設置電泳參數，濃縮膠用電壓120v，分離膠用180v，溴酚藍指示劑到達分離膠底部時，電泳結束，電泳結果見圖3(圖中m：蛋白marker，1：未純化蛋白，2：純化后蛋白)。由圖3可知，rchifn-α蛋白經ni-agarosehis標簽蛋白純化試劑盒純化后，可得到純度較高的rchifn-α重組蛋白。

6)蛋白含量測定

用lowry法蛋白濃度測定試劑盒測定純化后的蛋白濃度，具體步驟為：a.取8mlfolin酚甲試劑a和160μlfolin酚甲試劑b，按50:1比例混合；b.取30μlbsa標準品用pbs稀釋稀釋10倍至濃度0.5mg/ml；c.將標準品按0、2、4、6、8、12、16、20μl加到96孔板中，加pbs補足到20μl；d.將樣品作適當稀釋，加20μl到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時的誤差，標準線前面的點誤差比較大，所以盡可能的讓樣品點落在標準線1/2后；e.將配好的folin酚甲試劑每孔加入200μl，輕輕震動，混勻，室溫放置10分鐘；f.各孔加入20μlfolin酚乙試劑，迅速混勻，37℃放置30分鐘；g.用酶標儀測定a650值，并計算蛋白濃度達1.36mg/ml。

實施例5

大腸桿菌重組雞α干擾素在制備抗禽腺病毒-4型(fav-4)藥物中的應用。

大腸桿菌重組雞α干擾素在抑制禽腺病毒-4型對雞胚腎細胞致病變作用，以及在雞胚上增殖、在雞體內復制中的應用。

試驗例

大腸桿菌重組雞α干擾素的抗病毒作用：

1、重組干擾素rchifn-α在cek上對禽腺病毒-4型復制的影響以及活性測定

將重組干擾素rchifn-α過濾除菌后，用維持液10倍連續稀釋，從10^-1稀釋至10^-9接入96孔板已培養24h的cek細胞中，cek細胞應為單層貼壁狀態，且生長到約90％左右，加之前棄去原孔內的生長液，每孔加入100μl，每個稀釋度接8個孔(即1列)。9個稀釋度，共9列，a1～a9，剩余的3列中a10列接入1％的細胞維持液作正常細胞對照，a11列加入原液干擾素，100μl/孔，最后1列a12暫時只加入1％細胞維持液，后面將作為病毒對照。將加入rchifn-α的96孔板放入co2培養箱中培養24h，取出棄去上清，a1～a9列以及a12接入100tcid50的禽腺病毒-4型病毒液，在37℃吸附2h，棄去病毒液，再加入1％維持液200μl，放入co2培養箱中培養，隨時觀察細胞是否產生病變。

重組干擾素rchifn-α活性的計算，待病毒對照組細胞產生75％左右的病變，而實驗組細胞的病變等于或小于50％，可以看作對細胞產生了保護作用，將保護50％細胞不產生病變作為標準，按照reedmuech法計算干擾素活性值，結果見下表3。

距離比＝(50％-低于50％的百分比)/(高于50％的百分比-低于50％的百分比)；

干擾素活性＝(低于50％病變率的干擾素稀釋度的對數+距離比×稀釋系數的對數)的反對數。

表3用reedmuech法計算干擾素的活性

由表3可知，重組干擾素rchifn-α在cek上確實能抑制禽腺病毒-4型病毒的復制，病毒對照組的細胞開始變圓、脫落，逐漸呈拉絲狀，可以見到較大片細胞脫落后形成的不規則圓形空白(見圖4)，而加入重組干擾素rchifn-α的細胞與空白對照組的細胞形態良好，未出現明顯病變，只有些許死細胞漂浮(見圖5和圖6)。

2、重組干擾素rchifn-α在雞胚中對禽腺病毒-4型病毒增值的影響

將10日齡無抗體的spf雞胚分成四組(每組六枚)：第一組同時接種40μg的重組干擾素rchifn-α和100eld50的禽腺病毒-4型病毒液；第二組先接種病毒液，24h后再接種重組干擾素rchifn-α；第三組只接種病毒液作為對照；第四組只接種重組干擾素rchifn-α。放入孵箱中孵化，記錄雞胚死亡情況，結果見下表4。

表4重組干擾素rchifn-α在雞胚上的抗禽腺病毒-4型活性實驗結果

由表4可知，第一組雞胚的平均死亡時間在120h左右；第二組的平均死亡時間在110h左右，第三組陽性對照組的平均死亡時間在89h左右；第四組雞胚生長正常。即加入干擾素的雞胚平均死亡時間均比陽性對照組晚。隨著接入干擾素時間的不同，第一組和第二組的平均死亡時間也有不同。接入干擾素能延長感染雞胚的死亡時間，且干擾素接入時間對死亡時間產生影響。而同時接入干擾素和病毒液的雞胚死亡時間比先接入病毒后接入干擾素的存活時間要長。

3)重組干擾素rchifn-α在雞體內對禽腺病毒-4型病毒復制的影響

取60只3日齡spf雛雞，分6個組，第1、2、3、4組為試驗組，一側胸肌肌肉注射20μg、40μg、60μg、80μg重組干擾素rchifn-α，第5組為空白對照組，第6組為陽性對照組。24h后另一側胸肌肌肉注射100ld50的禽腺病毒-4型病毒液。將雛雞群盡量分開喂養，以免病毒的交叉感染，特別是空白對照組，并隨時觀察，記錄雛雞的死亡情況，結果見下表5。

表5重組干擾素rchifn-α在雞體內抗禽腺病毒-4型活性實驗結果

由表5可知，攻毒24h后，第6組陽性對照組有雛雞開始出現突然性的精神沉郁、羽毛蓬松、腹瀉、貧血、消瘦等癥狀，36h后開始出現死亡；第1組、第2組、第3組雞只48h后陸續出現精神沉郁、羽毛蓬松、腹瀉等癥狀，72h后開始始出現死亡；第四組從96h開始出現相似癥狀并死亡；144h后，除空白對照組未死亡外，其余組雞只全部死亡。試驗組與陽性對照組相比，試驗組的平均死亡時間均大于陽性對照組，并且隨著干擾素劑量的加大，死亡時間逐步延遲。

序列表

sequencelisting

<110>河南后羿生物工程股份有限公司

<120>大腸桿菌重組雞α干擾素、重組表達載體、重組表達工程菌及其制備方法和應用

<170>patentinversion3.5

<211>492

<212>dna

<213>優化序列

<221>編碼雞α干擾素的開放閱讀框序列（未加入bglⅱ、hindⅲ酶切位點）

<222>(1)..(492)

<400>1

atgtgcaaccacctgcgcccgcaggatgccaccttcagccacgatagcctgcagctgctg60

cgtgacatggccccgaccttaccgcagctgtgcccgcagcacaacgcgagctgcagcttc120

aacgacaccatcctggacaccagcaacacccgtcaggccgacaaaaccacccacgacatc180

ctgcagcacctgttcaaaatcctgagcagcccgagcaccccggcccactggaacgacagc240

cagcgccagagcctgctgaaccgtatccaccgctacacccagcacctggaacagtgcctg300

gacagcagcgacacccgcagccgtacacgttggccgcgcaacctgcacctgaccatcaaa360

aaacacttcagctgcctgcacaccttcctgcaagacaacgattacagcgcctgcgcctgg420

gaacacgtccgcctgcaggcacgtgcctggttcctgcacattcataatctgacaggtaac480

acccgtacctag492

<211>504

<212>dna

<213>合成序列

<221>編碼雞α干擾素的核苷酸序列（加入bglⅱ、hindⅲ酶切位點）

<222>(1)..(504)

<400>2

agatctatgtgcaaccacctgcgcccgcaggatgccaccttcagccacgatagcctgcag60

ctgctgcgtgacatggccccgaccttaccgcagctgtgcccgcagcacaacgcgagctgc120

agcttcaacgacaccatcctggacaccagcaacacccgtcaggccgacaaaaccacccac180

gacatcctgcagcacctgttcaaaatcctgagcagcccgagcaccccggcccactggaac240

gacagccagcgccagagcctgctgaaccgtatccaccgctacacccagcacctggaacag300

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gcctgggaacacgtccgcctgcaggcacgtgcctggttcctgcacattcataatctgaca480

ggtaacacccgtacctagaagctt504