自然殺傷細胞的體外純化方法與流程

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種自然殺傷細胞的體外純化方法。

背景技術：

作為天然免疫細胞中的重要淋巴細胞組分，自然殺傷細胞(Nature Killer Cell，NK細胞)擔任著對腫瘤和病原體胞內感染細胞進行免疫監視的重要任務。體外擴增NK細胞是NK細胞治療技術中一項關鍵技術，受到廣泛關注。現有的體外擴增NK細胞技術種類多種多樣，目前主要的NK細胞體外擴增技術分為飼養細胞依賴和飼養細胞非依賴的兩種方式。其中飼養細胞非依賴的NK細胞體外擴增技術安全性較高，但是最終獲得細胞的純度不高，并且受到技術方法限制和供體個體差異的影響，難以達到一致的NK細胞擴增純度。而NK細胞的純度則直接影響到細胞治療的效果，純度越高療效越好。

NK細胞混合培養體系中除了NK細胞外，主要的雜細胞是CD3(Cluster Differentiation 3)陽性的細胞群體。傳統的提高NK細胞純度的方法為MACS(Magnetic Activated Cell Sorting)磁珠分選技術。但是MACS磁珠分選技術會在NK細胞表面結合上磁珠，不能完全去除，存在可能的臨床應用隱患，因而難以大規模應用。

技術實現要素：

基于此，有必要提供一種具有大規模應用的前景的自然殺傷細胞的體外純化方法。

一種自然殺傷細胞的體外純化方法，包括如下步驟：

提供CD3抗體溶液；

將所述CD3抗體溶液承裝在臨床級培養容器內，充分反應后得到表面包被有CD3抗體的臨床級培養容器；

將待純化的自然殺傷細胞混合培養物承裝在所述包被有CD3抗體的臨床級培養容器內，在常規培養條件下培養2h～4h后收集所述包被有CD3抗體的臨床級培養容器內的上清液；以及

對所述上清液進行離心并保留細胞沉淀，洗滌所述細胞沉淀得到純化后的自然殺傷細胞。

在一個實施例中，所述CD3抗體溶液的溶質為CD3單克隆抗體或CD3多克隆抗體；

所述CD3抗體溶液的濃度為100ng/mL～400ng/mL。

在一個實施例中，所述CD3抗體溶液的溶劑為PBS緩沖液或濃度為0.9g/100mL的NaCl溶液。

在一個實施例中，所述臨床級培養容器為培養表面未組織處理過的T175細胞培養瓶。

在一個實施例中，所述充分反應后得到表面包被有CD3抗體的臨床級培養容器的操作中，所述反應的時間為8h～24h，所述反應的溫度為2℃～8℃。

在一個實施例中，所述常規培養條件的溫度為37℃、5％CO₂。

在一個實施例中，所述對所述上清液進行離心并保留細胞沉淀的操作中，所述離心的轉速為600rpm～1000rpm，所述離心的時間為5min～10min。

在一個實施例中，所述洗滌所述細胞沉淀的操作為：采用濃度為0.9g/100mL的NaCl溶液重懸所述細胞沉淀，接著600rpm～1000rpm離心5min～10min，保留洗滌干凈的細胞沉淀。

這種自然殺傷細胞的體外純化方法利用包被有CD3抗體的臨床級培養容器承載自然殺傷細胞混合培養物并培養，自然殺傷細胞混合培養物中的CD3陽性的雜細胞會與CD3抗體結合從而附著在臨床級培養容器內壁，培養完成后收集臨床級培養容器內的上清即可得到純化后的自然殺傷細胞。相對于傳統的MACS磁珠分選技術，這種自然殺傷細胞的體外純化方法不會在純化后的自然殺傷細胞表面結合上磁珠之類的異物，具有大規模應用的前景。

附圖說明

圖1為一實施方式的自然殺傷細胞的體外純化方法的流程圖；

圖2為實施例1中自然殺傷細胞在純化前和純化后的細胞純度對比圖。

具體實施方式

為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合具體實施例對本發明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。

如圖1所示的一實施方式的一種自然殺傷細胞的體外純化方法，包括如下步驟：

S10、提供CD3抗體溶液。

CD3抗體溶液的溶質可以為CD3單克隆抗體或CD3多克隆抗體。

CD3抗體溶液的濃度為100ng/mL～400ng/mL。

優選的，CD3抗體溶液的濃度為100ng/mL～250ng/mL。

特別優選的，CD3抗體溶液的濃度為200ng/mL。

CD3抗體溶液的溶劑為PBS緩沖液(pH為7.2～7.4)或生理鹽水。

生理鹽水為0.9g/100mL的NaCl溶液。

S20、將S10得到的CD3抗體溶液承裝在臨床級培養容器內，充分反應后得到表面包被有CD3抗體的臨床級培養容器。

臨床級培養容器可以為培養表面未組織處理過的T175細胞培養瓶。

充分反應后得到表面包被有CD3抗體的臨床級培養容器的操作中，反應的時間為8h～24h(優選為12h)，反應的溫度為2℃～8℃(優選為4℃)。

S30、將待純化的自然殺傷細胞混合培養物承裝在S20得到的包被有CD3抗體的臨床級培養容器內，在常規培養條件下培養2h～4h后收集包被有CD3抗體的臨床級培養容器內的上清液。

加入待純化的自然殺傷細胞混合培養物前，先將表面包被有CD3抗體的臨床級培養容器中的CD3抗體溶液移出，再承裝待純化的自然殺傷細胞混合培養物。

常規培養條件的溫度為37℃、5％CO₂。

S40、對S30得到的上清液進行離心并保留細胞沉淀，洗滌細胞沉淀得到純化后的自然殺傷細胞。

對上清液進行離心并保留細胞沉淀的操作中，離心的轉速為600rpm～1000rpm，離心的時間為5min～10min。

洗滌細胞沉淀的操作為：采用生理鹽水(濃度為0.9g/mL的NaCl溶液)重懸細胞沉淀，接著600rpm～1000rpm離心5min～10min，保留洗滌干凈的細胞沉淀。

這種自然殺傷細胞的體外純化方法利用包被有CD3抗體的臨床級培養容器承載自然殺傷細胞混合培養物并培養，自然殺傷細胞混合培養物中的CD3陽性的雜細胞會與CD3抗體結合從而附著在臨床級培養容器內壁，培養完成后收集臨床級培養容器內的上清即可得到純化后的自然殺傷細胞。相對于傳統的MACS磁珠分選技術，這種自然殺傷細胞的體外純化方法不會在純化后的自然殺傷細胞表面結合上磁珠之類的異物，具有大規模應用的前景。

此外，這種自然殺傷細胞的體外純化方法利用簡便易行的抗體粘附作用，將體外擴增NK細胞培養體系中CD3⁺的非目標細胞通過短時間的孵育選擇性去除，以提高NK細胞純度，獲得質量更佳、安全性好的臨床用NK細胞，而成本可降低至現有基于MACS免疫磁珠細胞分選技術的20％以下(分離1×10⁸cells約合需100元)。

以下為具體實施例。

實施例中采用藥物和儀器如非特別說明，均為本領域常規選擇。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如文獻、書本中所述的條件或者試劑盒生產廠家推薦的方法實現。

實施例1

將CD3單克隆抗體(購自Miltenyi Biotec)直接可溶性添加入1×PBS(Phosphate Buffer Solution)中，配制成濃度為100ng/mL的CD3單克隆抗體溶液。

將CD3單克隆抗體溶液承裝在培養表面未組織處理過的T175細胞培養瓶內，4℃反應12h后得到表面包被有CD3單克隆抗體的T175培養瓶。

將表面包被有CD3單克隆抗體的培養表面未組織處理過的T175細胞培養瓶內的CD3單克隆抗體溶液移出，接著將待純化的NK細胞混合培養物30mL混勻后放入表面包被有CD3單克隆抗體的培養表面未組織處理過的T175細胞培養瓶內，37℃、5％CO₂培養3h后，收集培養表面未組織處理過的T175細胞培養瓶內的上清液。

將上清液在1000rpm下離心5min，保留細胞沉淀。采用生理鹽水(濃度為0.9g/100mL的NaCl溶液)重懸細胞沉淀，接著600rpm離心510min，保留洗滌干凈的細胞沉淀即為純度提高的NK細胞。

對純化前及純化后的NK細胞進行流式檢測，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，純化前NK細胞純度為22.7％，純化后純度能達到73.8％，計算NK細胞得率為64％。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。