溶瘤腺病毒，用于制備該腺病毒的載體及其應用的制作方法

本發明涉及生物技術和基因治療領域，具體而言，涉及一種溶瘤腺病毒，用于制備該腺病毒的載體及其應用。

背景技術：

結直腸癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。2015年，我國新診斷結直腸患者超過37萬例，死亡19萬余例，分別占所有惡性腫瘤的8.77％和6.79％。結直腸癌的治療原則為以手術為主的綜合治療，其中，完整結腸系膜切除術(CME)和完整直腸系膜切除術(TME)，已經作為局部進展期結直腸癌的規范化手術予以推薦。然而，晚期結直腸癌患者往往出現轉移，包括遠處淋巴結有、肝臟或其他臟器的轉移等，手術治療無法達到根治的目的。此時，化療、免疫治療等輔助手段，雖能在一定程度提升腫瘤患者的生活質量和延緩腫瘤的發展，但是仍然無法提高腫瘤患者的長期存活率。因此，急需探索新的、更加有效的治療手段和方案。

近年來，免疫治療發展迅速，以PD-1抗體為代表的腫瘤免疫治療被《Science》評為2013年十大科學突破之首，免疫治療有望成為繼放療、化療、手術治療之外的第四大腫瘤治療手段。然而，以PD-1抗體為代表的腫瘤治療藥物，容易引發細胞因子風暴等毒副作用，如何管控這些毒副作用依然是阻擋免疫治療發展的絆腳石。2015年10月，美國FDA批準了攜帶粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF)的單純皰疹溶瘤病(T-VEC)上市，不僅為溶瘤病毒的發展注入了一支強心針，也為腫瘤免疫治療開辟了新的途徑。

溶瘤病毒可在腫瘤細胞中復制并裂解腫瘤細胞，釋放病毒，進一步感染周圍的其他腫瘤細胞，進而發揮級聯放大作用，最終達到消滅腫瘤的目的。目前，應用最為廣泛的溶瘤病毒是溶瘤腺病毒。然而，單純應用溶瘤腺病毒的療效往往受到多種因素的制約：(1)人體內普遍存在5型腺病毒抗體，可清除溶瘤腺病毒溶瘤病毒；(2)啟動病毒復制的腫瘤特異性啟動子效率達不到預想等。基因修飾是提高溶瘤腺病毒療效的重要手段，近年來，包括自殺基因、血管新生抑制基因、免疫基因等被應用于溶瘤病毒介導的基因治療。溶瘤腺病毒作為免疫基因治療的載體，其優勢是：(1)溶瘤病毒裂解腫瘤細胞釋放大量腫瘤抗原，可為特異性抗腫瘤免疫反應的激活提供物質基礎；(2)溶瘤病毒發揮溶瘤功能，可以降低腫瘤負荷，為免疫基因功能發揮贏得時間。因此，將溶瘤腺病毒與基因治療，特別是免疫基因治療聯合應用，已經成為腫瘤免疫治療的熱點領域和方向。

有鑒于此，特提出本發明。

技術實現要素：

本發明的目的是為了制備一種聯合decorin和GM-CSF蛋白表達的溶瘤腺病毒，并將其應用于結腸癌的治療，為結腸癌的治療提供一種有效的免疫基因治療方案。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種溶瘤腺病毒重組載體，所述重組載體上同時攜帶有decorin基因表達框及GM-CSF基因表達框；

優選的，所述表達框均插入在腺病毒基因組E1區中。

核心蛋白聚糖(decorin，DCN)作為細胞外基質的重要組成成份，可以通過多種途徑抑制腫瘤的發生、發展和轉移，是重要的抑癌基因。臨床數據分析結果顯示，DCN在乳腺癌、前列腺癌、腎癌等多種腫瘤組織中表達下調。我們系統地分析了II/III期結腸癌患者腫瘤組織中DCN及其靶基因的表達，結果顯示，DCN在結腸癌組織中表達下調；而DCN的重要靶基因，如Met、血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)等，均表達上調。此外，DCN的相對表達水平與結腸癌的轉移、預后等密切相關：轉移患者的DCN表達水平相對更低；回顧性分析結果提示，DCN表達水平低與腫瘤復發關系密切。已有研究報道，高表達DCN能夠抑制腫瘤細胞增殖和遷移、促進腫瘤細胞凋亡；在乳腺癌骨轉移模型中，溶瘤腺病毒介導的DCN高表達，能夠抑制骨轉移的發展、促進骨轉移的愈合。因此，作為連接腫瘤與腫瘤微環境的重要分子，DCN已經成為腫瘤治療的重要靶標。

DCN抑制腫瘤生長、進展和轉移的主要的分子機制包括：(1)激活EGFR/MAPK/p21信號通路，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡；(2)結合并滅活轉化生長因子β(Transforming growth factorβ，TGFβ)，降低VEGF表達水平，進而抑制腫瘤血管新生和上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。TGF-β也是重要的免疫調節因子，可通過多種機制抑制腫瘤微環境的抗腫瘤免疫。研究證實，阻斷TGFβ信號，可抑制骨髓來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和CD4⁺Foxp3⁺調節性T淋巴細胞(Regulatory T cells，Tregs)，促進自然殺傷細胞(Natural Killer cells，NK)和細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)的活性，增強干擾素γ(Interferonγ，IFNγ)的表達及分泌，進而激活抗腫瘤免疫反應。在理論上，作為TGFβ的抑制分子，decorin必然具有一定的免疫調節功能，促進抗腫瘤免疫的形成。然而，對于decorin在結腸癌中的免疫調節作用尚無明確報道。

作為多功能的細胞因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF)，可促進樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)、巨噬細胞的成熟和分化，目前已被廣泛應用于腫瘤的免疫與基因治療中。研究證實，攜帶GM-CSF的溶瘤病毒局部給藥，可調節腫瘤局部和機體的免疫狀態，促進機體產生有效的抗腫瘤免疫反應。2015年10月，美國FDA批準了攜帶GM-CSF的單純皰疹溶瘤病毒(T-VEC)進入市場，成為免疫基因治療的重要里程碑。

綜上所述，目前對于結腸癌，特別是晚期和轉移的結腸癌患者仍然缺乏有效的治療手段。Decorin與GM-CSF聯合溶瘤腺病毒應用于腫瘤治療，可集合溶瘤病毒治療、靶向治療、基因治療和免疫治療的優勢，有效干預腫瘤微環境和機體抗腫瘤免疫反應，有望為結腸癌的治療提供一種更加有效的免疫基因治療方案。

本發明證實，攜帶decorin和GM-CSF的溶瘤腺病毒，能夠有效殺傷腫瘤細胞，并實現腫瘤局部目的基因的高效表達；同時，腫瘤細胞裂解釋放的大量腫瘤抗原，在GM-CSF協助下，有效激活機體的抗腫瘤免疫反應。

優選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體，所述decorin基因表達框由CMV啟動子和decorin蛋白開放讀碼框序列組成。

優選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體，所述重組載體上還包含腺病毒復制調控基因序列；

所述腺病毒復制調控基因序列包括端粒酶啟動子TERTp、腺病毒E1區復制起始基因E1A和E1B55K；

更優選的，從序列的5’至3’方向為：decorin基因表達框-腺病毒復制調控基因序列-GM-CSF基因表達框；

優選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體，所述E1A由端粒酶啟動子TERTp調控，所述E1B55K由天然E1B啟動子調控；

更優選的，從序列5’至3’方向為：端粒酶啟動子TERTp-腺病毒E1A基因-天然E1B啟動子-E1B55K；

優選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體，所述GM-CSF基因表達框位于所述天然E1B啟動子下游，由核糖體內部進入位點IRES連接GM-CSF和E1B55K，實現共同表達；

Internal ribosome entry site,IRES。IRES能招募核糖體對mRNA進行翻譯。

優選的，從序列的5’至3’方向為：天然E1B啟動子-GM-CSF基因表達框-IRES序列-E1B55K。

如上所述的溶瘤腺病毒重組載體的構建方法，包括：

1)、將decorin基因表達框序列插入到穿梭載體中得到第一重組穿梭載體；

2)、從TE-TP-E1A-GM-55K載體上酶切得到包含GM-CSF基因表達框的核酸片段，并將其定向克隆至步驟1)得到的第一重組穿梭載體中，得到第二重組穿梭載體；

3)、將所述第二重組穿梭載體與復制缺陷型病毒載體同源重組，得到如上所述的溶瘤腺病毒重組載體。

TE-TP-E1A-GM-55K載體為現有載體，本領域技術人員可根據Cancer Gene Ther.2008Mar；15(3):173-82.Epub 2007Dec 21.A simplified system for generating oncolytic adenovirus vector carrying one or two transgenes.文章中記載的相關內容自行構建該載體，此處不做贅述。

優選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體的構建方法，所述穿梭載體為pShuttle-CMV。

優選的，如上所述的溶瘤腺病毒重組載體的構建方法，所述復制缺陷型病毒載體為pAdEasy。

一種溶瘤腺病毒，其如上所述的溶瘤腺病毒重組載體線性化后轉染至病毒包裝細胞中進行包裝、擴增、純化后獲得；

優選的，所述腺病毒包裝細胞為HEK293細胞。

如上所述的溶瘤腺病毒重組載體及權利要求如上所述的溶瘤腺病毒在制備用于治療結腸癌的藥物中的應用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

附圖1溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM和對照病毒的構建；

A，溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM、rAd.DCN、rAd.GM、rAd.Null和復制缺陷型腺病毒Ad.Null和Ad.DCN的基因組結構示意圖；B，pShuttle-CMV-DCN的BglII和XhoI酶切鑒定結果：M為λ-HindIII Marker，C1為pShuttle-CMV載體的酶切產物，C2為DCN基因，1-8為pShuttle-CMV-DCN的1-8號克隆；C，重組腺病毒載體PacI酶切鑒定結果：M1為DL2000Marker；M2為λ-HindIII Marker；C1為pShuttle-CMV-DCN酶切產物，1為pAd.DCN.GM.RE酶切產物，2為pAd.DCN.RE酶切產物；

附圖2磺酰羅丹明B比色法測定溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM對結腸癌細胞系SW480、SW620和CT26的殺傷作用；

附圖3溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM在結腸癌細胞系中的復制能力檢測結果；

附圖4 ELISA檢測溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM介導DCN蛋白表達的能力；

附圖5溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM及對照病毒治療小鼠結腸癌細胞CT26移植瘤的療效評價：A為腫瘤生長曲線；B為治療后第22天(Day29)剝離腫瘤的體重與Buffer組相比，***，p<0.001,**,p<0.01；與rAd.Null組相比，##，p<0.01；

附圖6溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療后5天，腫瘤組織中DCN及其靶基因Met、β-catenin和VEGF表達的real-time檢測結果*,與rAd.Null組相比，p<0.05；

附圖7溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療后5天，外周血中CD4⁺T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比例與Buffer組相比，*,p<0.05，**，p<0.01；

附圖8溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療后5天，脾臟細胞中書突狀細胞(DCs)與骨髓來源抑制細胞(MDSCs)的比例；

附圖9溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療后5天，脾臟中細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ和TGF-β表達的real-time檢測結果。

具體實施方式

在本發明的一個具體實施方式中，本發明采用AdEasy系統，將“端粒酶啟動子TERTp調控E1A的表達框，E1B啟動子調控GM-CSF和E1B-55KDa的表達框，及cmv啟動子調控decorin的表達框”構建到穿梭質粒。采用限制性內切酶PmeI將其線性化并去磷酸化，并于BJ5183菌株中與骨架質粒AdEasy-1同源重組。得到的重組腺病毒質粒，經PacI線性化后，轉染HEK293細胞，包裝得到溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。并在人結腸癌細胞、小鼠結腸癌細胞中鑒定目的基因sTGFβRIIFc的表達；在體外證實了rAd.DCN.GM對結腸癌細胞的溶瘤作用；在小鼠結腸癌細胞CT26移植瘤模型中明確其治療效果和機制。

在進一步優選的實施方式中，本發明采用的方法具體為：

1、溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的構建與制備：

采用本實驗建立的“一種簡單的能夠攜帶1-2個基因的溶瘤腺病毒制備體系”，構建并制備溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。具體為：從本實驗室保存的質粒載體TE-TP-E1A-GM-55K中，通過酶切方式，獲得“由端粒酶啟動子TERTp啟動腺病毒復制必需基因E1A表達，由E1B啟動子啟動GM-CSF和E1B55K表達”的序列TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，并克隆到攜帶DCN基因的穿梭質粒上；最后，采用AdEasy系統制備重組腺病毒載體pAd.DCN.GM。并于HEK293細胞中包裝獲得重組腺病毒rAd.DCN.GM。

此外，在更優選的具體實施方式中，為了進行功能和機制研究，還制備了多種對照病毒：(1)rAd.Null，具有溶瘤功能，不攜帶目的基因的對照病毒；(2)rAd.DCN，僅攜帶DCN基因的溶瘤腺病毒；(3)rAd.GM，僅攜帶GM-CSF的基因溶瘤腺病毒；(4)Ad.Null，不攜帶目的基因的復制缺陷性腺病毒；(5)Ad.DCN，攜帶DCN基因的復制缺陷性腺病毒。

2、溶瘤腺病毒介導的目的基因表達和溶瘤功能評價；

為明確目的基因在結腸癌細胞中的表達及其效率，采用溶瘤腺病毒和對照病毒感染結腸癌細胞48h后，采用Western-blotting和ELISA檢測目的基因DCN和GM-CSF的表達水平。

為檢測病毒復制和殺傷效應，采用不同感染復數(multiplicity of infection,MOI)的溶瘤腺病毒感染結腸癌細胞，采用SRB檢測病毒對不同結腸癌細胞的殺傷效率；采用病毒擴增法，檢測溶瘤病毒的復制能力。

3、溶瘤腺病毒體內抗腫瘤效應評價

為評價小鼠體內抗腫瘤效應，建立了小鼠結腸癌CT26細胞的小鼠移植瘤模型，通過瘤內給藥方式進行治療后，觀察溶瘤腺病毒對移植瘤生長的抑制作用，明確其治療效果。

4、溶瘤腺病毒體內抗腫瘤機制研究

為明確溶瘤病毒的體內抗腫瘤機制，檢測了腫瘤局部DCN及其相關靶基因表達水平，檢測脾臟及腫瘤局部炎癥因子表達水平、免疫細胞表型等，初步闡明了其作用機制。

本發明的創新點在于有效集合溶瘤腺病毒、靶向治療、基因治療和免疫治療的優勢，聯合發揮decorin對腫瘤微環境和免疫調控作用、GM-CSF對DC和巨噬細胞的活化作用、以及溶瘤病毒的溶瘤及免疫激活效應。

具體為，(1)溶瘤病毒裂解腫瘤細胞，減輕腫瘤負荷，為目的基因功能發揮贏得時間，為免疫激活贏得“時間可能”；同時，腫瘤細胞裂解釋放的大量腫瘤抗原利于抗腫瘤免疫反應的激活。(2)Decorin通過多種途徑下調轉移相關基因的表達，抑制腫瘤轉移；同時，調節腫瘤免疫微環境，改善腫瘤局部免疫抑制狀態，募集免疫細胞，為抗腫瘤免疫激活創造“空間可能”。(3)GM-CSF可促進腫瘤局部DCs和巨噬細胞的成熟和分化，有利于形成強效的腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞，從而最終清除腫瘤。

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購買獲得的常規產品。

實施例1重組腺病毒rAd.DCN的構建與制備

其方法是合成是人DCN基因，將其插入到pShuttle-CMV載體中，獲得pShuttle-CMV-DCN；MfeI酶切由本實驗室保存的質粒載體TE-TP-E1A-GM-55K，獲取含有復制相關基因、GM-CSF的基因片段——TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，并將其正向克隆到pShuttle-CMV-DCN的相應位點，獲得穿梭質粒pSh.cmv.DCN.GM.RE；參照AdEasy系統，獲得重組腺病毒質粒pAd.DCN.GM.RE；并于HEK293細胞制備獲得溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。具體為：

(1)pShuttle-CMV-DCN的構建

通過基因合成技術，合成人DCN基因的全序列，并在上下游分別加入BglII和XhoI的酶切位點，將其酶切后，連接到pShuttle-CMV的相應位點，獲得攜帶目的基因的穿梭質粒pShuttle-CMV-DCN。

(2)pShuttle-CMV-DCN-GM-RE的構建

質粒TE-TP-E1A-GM-55K，含有TERTp啟動子啟動E1A表達、E1B啟動子調控GM-CSF和E1B55K表達兩個表達框，其中，GM-CSF編碼區和E1B55K編碼區之間通過核糖體內部進入位點(internal ribosome entry sites，IRES)連接。MfeI酶切TE-TP-E1A-GM-55K，獲得此部分序列TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，然后將其正向克隆到pShuttle-CMV-DCN的相應位點(MfeI)，獲得含有全部目的序列的穿梭質粒pShuttle-CMV-DCN-GM-RE(如SEQ ID NO：1所示)。

(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的制備

參照AdEasy系統制備重組腺病毒質粒：PmeI酶切穿梭質粒pShuttle-CMV-DCN-GM-RE,電轉BJ5183感受態細胞，與AdEasy-1同源重組獲得重組腺病毒質粒pAd.DCN.GM.RE。PacI酶切重組腺病毒質粒，并將其轉染HEK293細胞，制備獲得溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM(附圖1所示)。鑒定正確后，進行擴增、純化和滴度測定；結果顯示，病毒滴度和純度均符合要求(表1所示)。

(4)對照病毒的構建和制備

按照溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM構建、制備流程，采用pShuttle-CMV替換pSh.cmv.DCN，構建和制備僅攜帶GM-CSF基因的溶瘤腺病毒rAd.GM；采用TE-TP-E1A(本實驗室構建并保存)替換TE-TP-E1A-GM-55K，構建和制備僅攜帶DCN基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN；同時采用pShuttle-CMV和TE-TP-E1A制備不攜帶目的基因的對照溶瘤病毒rAd.Null。同時，采用AdEasy系統，制備復制缺陷型對照病毒Ad.DCN和Ad.Null。對照病毒經鑒定正確后，進行擴增、純化和滴度測定；結果顯示，病毒滴度和純度均符合要求(表1所示)。

表1病毒滴度、純度檢測結果

實施例2溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM體外功能驗證

其方法是，在結腸癌細胞中，采用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色法，檢測溶瘤病毒的殺傷效應；通過Adeno-X Rapid Titer Kit測定從感染后3h到48h，溶瘤病毒在結腸癌細胞中的擴增倍數，明確病毒的復制能力；通過Western-blotting和ELISA檢測目的基因DCN和GM-CSF在結腸癌細胞中的表達。具體為：

(1)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的殺傷能力檢測

將人腎癌癌細胞系SW620、SW480和小鼠結腸癌細胞系CT26，分別以1×103細胞/100μl培養基/孔接種96孔板。第二天，溶瘤腺病毒rAd.DCN,對照溶瘤病毒rAd.GM、rAd.DCN、rAd.Null，和復制缺陷性對照病毒Ad.Null和Ad.DCN，分別以5倍梯度稀釋的方式感染細胞(1.25×106Vps/細胞-80Vps/細胞)。第七天(感染后第六天)，采用SRB染色檢測每孔中細胞的存活率，明確溶瘤腺病毒的細胞殺傷作用。計算方法為：細胞存活率＝相應感染滴度下的OD值/對照孔的OD值。結果顯示，溶瘤病毒不但能夠有效地殺傷人結腸癌細胞SW620和SW480，還能殺傷小鼠結腸癌細胞CT26(如附圖2所示)。

(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的復制能力檢測

接下來，我們進一步明確了溶瘤病毒在結腸癌細胞中的復制能力。具體為：將25000VPs/細胞的溶瘤病毒rAd.DCN和對照病毒感染結腸癌細胞SW620、SW480和CT26；于感染后3h，PBS洗滌細胞去除病毒；洗滌后即刻和48h，收集細胞和上清，反復凍融后，將其感染24孔板中的HEK293細胞(提前一天按照1×105細胞/孔接種)。

48h后，采用Adeno-X Rapid Titer Kit進行染色并計算病毒滴度，明確病毒擴增倍數。結果顯示，與復制缺陷型腺病毒相比，溶瘤病毒rAd.DCN.GM、rAd.GM、rAd.DCN和rAd.Null均能在人結腸癌細胞SW620和SW480中有效復制；而在小鼠結腸癌細胞CT26中卻無明顯復制能力(如附圖3所示)。

(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM可在結腸癌細胞中高效表達目的基因DCN和GM-CSF

采用25000VPs/細胞的溶瘤病毒rAd.DCN.GM和對照病毒感染結腸癌細胞細胞SW620、SW480和CT26后，孵育16h后，將細胞培養基替換為無血清培養基。繼續培養24h-32h，分別收集上清和細胞，采用ELISA分別檢測目的基因DCN和GM-CSF的表達。結果顯示，無論復制缺陷型腺病毒Ad.DCN，還是溶瘤腺病毒rAd.DCN和rAd.DCN.GM均能在結腸癌細胞中高效地表達治療基因DCN；而rAd.GM和rAd.DCN.GM能夠表達治療基因GM-CSF(如附圖4所示)。

實施例3溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療小鼠結腸癌移植瘤的療效評價

其方法是，采用小鼠結腸癌細胞CT26建立小鼠移植瘤模型，通過瘤內給予溶瘤病毒的方式進行治療，通過對其生長情況的監測，評價溶瘤病毒對小鼠腎癌移植瘤的治療作用。具體為：

小鼠結腸癌細胞CT26，以單細胞懸液(2×106細胞/小鼠)皮下荷瘤6-8周的Babl/c小鼠，觀察腫瘤的生長情況，于荷瘤后8d，檢測腫瘤的體積，并按照體積進行分層隨機分組，劃分為Buffer組、rAd.Null組、rAd.DCN組、rAd.GM組和rAd.DC.GM組。并以未荷瘤小鼠作為正常對照，來評價其免疫指標。

荷瘤后第7天，溶瘤腺病毒以2.5×1010VPs/100μl的劑量，瘤內注射進行治療；第10天，相同劑量溶瘤腺病毒再次給藥。治療后，監測小鼠健康狀況、小鼠體重、腫瘤生長曲線等。

待任意一組小鼠的腫瘤出現破潰或者體積大于2000mm3時，終止實驗。處死小鼠后，檢測腫瘤的體重。結果顯示，與Buffer組和rAd.Null組相比，攜帶目的基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM、rAd.GM和rAd.DCN均能有效抑制腫瘤的生長(p<0.05)(如附圖5所示)。

實施例4溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治療小鼠結腸癌移植瘤的機制研究

為進一步明確rAd.DCN.GM治療結腸癌的機制，分別檢測腫瘤組織中DCN相關靶基因的表達水平、EMT水平以及炎癥因子的表達水平；檢測血液和脾臟中T淋巴細胞亞型、骨髓來源抑制細胞(Bone marrow derived suppressor cells,MDSCs)/細胞因子的表達等，明確rAd.DCN.GM對機體抗腫瘤免疫的調節作用。具體為：

(1)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM對DCN靶基因和轉移相關分子表達的影響

荷瘤后第12d(第一次給藥后第5d)和第29天，分別處死小鼠，分離小鼠腫瘤組織，提取RNA。檢測DCN及其重要靶基因Met、β-catenin和VEGF的表達水平；檢測EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達水平。結果顯示，rAd.dcn和rAd.dcn.GM均能高效介導目的基因DCN在腫瘤局部的表達；同時，可檢測到DCN的重要靶基因Met、β-catenin和VEGF均表達下調(如附圖6所示)。上述結果提示，rAd.DCN.GM可通過高表達DCN，抑制結腸癌抑制瘤的增殖和轉移。

(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM對機體抗腫瘤免疫的調控作用

溶瘤腺病毒可以裂解腫瘤細胞，釋放大量腫瘤抗原，為機體免疫激活提供基礎；而GM-CSF是重要的免疫調節因子，對于機體抗腫瘤免疫反應的激活具有重要意義。在本研究中，我們發現溶瘤病毒治療可以通過調節CD4⁺T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的比例，促進細胞因子的表達和釋放(如附圖7所示)。與單純的溶瘤腺病毒相比，攜帶DCN和GM-CSF的溶瘤腺病毒具有更強的免疫激活效應：例如，攜帶DCN的溶瘤腺病毒能夠有效降低脾臟細胞中MDSCs的數量和比例；而攜帶GM-CSF的溶瘤腺病毒則能夠明顯提升脾臟中DC細胞的數量和比例。此外，聯合應用DCN和GM-CSF獲得的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM則能夠同時發揮DCN和GM-CSF對機體免疫的調節作用(如附圖8所示)。

此外，對于細胞因子的檢測結果顯示，攜帶GM-CSF的溶瘤腺病毒可以誘導TH1型細胞因子，例如IL-2、IL-12、IFN-γ的表達；而攜帶DCN的溶瘤腺病毒則可降低TH2型細胞因子，如IL-6、TGF-β的表達水平。而rAd.DCN.GM則可以同時調控TH1型細胞因子和TH2型細胞因子，有望最大程度激活機體的抗腫瘤免疫反應(如附圖9所示)。

綜上所述，我們成功構建了由端粒酶啟動子調控溶瘤(TERTp啟動E1A表達)、由E1B啟動子(E1Bp)調控GM-CSF和E1B55K表達、由cmv啟動子調控DCN蛋白表達的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。體外結果證實，該溶瘤腺病毒能夠在體外人結腸癌癌細胞系中大量復制并殺傷細胞；能夠實現目的基因在結腸癌細胞中的高效表達。在小鼠結腸癌細胞CT26的小鼠移植瘤模型中，rAd.DCN.GM不但能夠有效抑制腫瘤的生長，降低腫瘤轉移相關分子的表達水平；還能夠激活機體的抗腫瘤免疫反應。其中，DCN和GM-CSF能夠發揮各自的免疫調節作用，從不同角度協同產生有效的抗腫瘤免疫反應。因此，該溶瘤腺病毒有望成為結腸癌晚期或轉移患者治療的重要候選藥物，成為手術治療、放療、化療和免疫治療的重要補充。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。

<110> 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所；北京知光醫學科技股份有限公司

<120> 溶瘤腺病毒，用于制備該腺病毒的載體及其應用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 13033

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tactgtaata gtaatcaatt 360

acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 420

ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 480

cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 540

actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 600

aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 660

acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 720

tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 780

gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 840

aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 900

agagctggtt tagtgaaccg tcagatccgc tagagatcta tgaaggccac tatcatcctc 960

cttctgcttg cacaagtttc ctgggctgga ccgtttcaac agagaggctt atttgacttt 1020

atgctagaag atgaggcttc tgggataggc ccagaagttc ctgatgaccg cgacttcgag 1080

ccctccctag gcccagtgtg ccccttccgc tgtcaatgcc atcttcgagt ggtccagtgt 1140

tctgatttgg gtctggacaa agtgccaaag gatcttcccc ctgacacaac tctgctagac 1200

ctgcaaaaca acaaaataac cgaaatcaaa gatggagact ttaagaacct gaagaacctt 1260

cacgcattga ttcttgtcaa caataaaatt agcaaagtta gtcctggagc atttacacct 1320

ttggtgaagt tggaacgact ttatctgtcc aagaatcagc tgaaggaatt gccagaaaaa 1380

atgcccaaaa ctcttcagga gctgcgtgcc catgagaatg agatcaccaa agtgcgaaaa 1440

gttactttca atggactgaa ccagatgatt gtcatagaac tgggcaccaa tccgctgaag 1500

agctcaggaa ttgaaaatgg ggctttccag ggaatgaaga agctctccta catccgcatt 1560

gctgatacca atatcaccag cattcctcaa ggtcttcctc cttcccttac ggaattacat 1620

cttgatggca acaaaatcag cagagttgat gcagctagcc tgaaaggact gaataatttg 1680

gctaagttgg gattgagttt caacagcatc tctgctgttg acaatggctc tctggccaac 1740

acgcctcatc tgagggagct tcacttggac aacaacaagc ttaccagagt acctggtggg 1800

ctggcagagc ataagtacat ccaggttgtc taccttcata acaacaatat ctctgtagtt 1860

ggatcaagtg acttctgccc acctggacac aacaccaaaa aggcttctta ttcgggtgtg 1920

agtcttttca gcaacccggt ccagtactgg gagatacagc catccacctt cagatgtgtc 1980

tacgtgcgct ctgccattca actcggaaac tataagtaac tcgagcctaa gcttctagat 2040

aagatatccg atccaccgga tctagataac tgatcataat cagccatacc acatttgtag 2100

aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga 2160

atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2220

gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2280

aactcatcaa tgtatcttaa cgcgcggccg ctggcccctc cctcgggtta ccccacagct 2340

taggccgatt cgacctctct ccgctggggc cctcgctggc gtccctgcac cctgggagcg 2400

cgagcggcgc gcgggcgggg aagcgcggcc cagacccccg ggtccgcccg gagcagctgc 2460

gctgtcgggg ccaggccggg ctcccagtgg attcgcgggc acagacgccc aggaccgcgc 2520

ttcccacgtg gcggagggac tggggacccg ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc 2580

tccgcctcct ccgcgcggac cccgccccgt cccgacccct cccgggtccc cggcccagcc 2640

ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc ctttccgcgg ccccgccctc tcctcgcggc 2700

gcgagtttca ggcagcgctg cgtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc 2760

cccgcggaat tcatgagaca tattatctgc cacggaggtg ttattaccga agaaatggcc 2820

gccagtcttt tggaccagct gatcgaagag gtactggctg ataatcttcc acctcctagc 2880

cattttgaac cacctaccct tcacgaactg tatgatttag acgtgacggc ccccgaagat 2940

cccaacgagg aggcggtttc gcagattttt cccgactctg taatgttggc ggtgcaggaa 3000

gggattgact tactcacttt tccgccggcg cccggttctc cggagccgcc tcacctttcc 3060

cggcagcccg agcagccgga gcagagagcc ttgggtccgg tttctatgcc aaaccttgta 3120

ccggaggtga tcgatcttac ctgccacgag gctggctttc cacccagtga cgacgaggat 3180

gaagagggtg aggagtttgt gttagattat gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct 3240

tgtcattatc accggaggaa tacgggggac ccagatatta tgtgttcgct ttgctatatg 3300

aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg 3360

gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa tttttacagt tttgtggttt aaagaatttt 3420

gtattgtgat ttttttaaaa ggtcctgtgt ctgaacctga gcctgagccc gagccagaac 3480

cggagcctgc aagacctacc cgccgtccta aaatggcgcc tgctatcctg agacgcccga 3540

catcacctgt gtctagagaa tgcaatagta gtacggatag ctgtgactcc ggtccttcta 3600

acacacctcc tgagatacac ccggtggtcc cgctgtgccc cattaaacca gttgccgtga 3660

gagttggtgg gcgtcgccag gctgtggaat gtatcgagga cttgcttaac gagcctgggc 3720

aacctttgga cttgagctgt aaacgcccca ggccataagg tgtaaacctg tgattgcgtg 3780

tgtggttaac gcctttgttt gctgaatgag ttgatgtaag tttaataaag ggtgagataa 3840

tgtttaactt gcatggcgtg ttaaatgggg cggggcttaa agggtatata atgcgccgtg 3900

ggctaatctt ggttacatct gacctcacta gtatgtggct gcagagcctg ctgctcttgg 3960

gcactgtggc ctgcagcatc tctgcacccg cccgctcgcc cagccccagc acgcagccct 4020

gggagcatgt gaatgccatc caggaggccc ggcgtctcct gaacctgagt agagacactg 4080

ctgctgagat gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat gtttgacctc caggagccga 4140

cctgcctaca gacccgcctg gagctgtaca agcagggcct gcggggcagc ctcaccaagc 4200

tcaagggccc cttgaccatg atggccagcc actacaagca gcactgccct ccaaccccgg 4260

aaacttcctg tgcaacccag attatcacct ttgaaagttt caaagagaac ctgaaggact 4320

ttctgcttgt catccccttt gactgctggg agccagtcca ggagtgagtc gacgaattaa 4380

ttcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac 4440

ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 4500

ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc 4560

aagcttgagg tgtggcaggc ttgagatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac 4620

tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaac tgcaggtcga gcatgcatct 4680

agggcggcca attccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct 4740

tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgtgattttc caccatattg ccgtcttttg 4800

gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 4860

cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 4920

aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 4980

ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 5040

cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 5100

caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 5160

atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 5220

gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca 5280

actcgacgag ttttataaag gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc ggggggtacc 5340

tgctggattt tctggccatg catctgtgga gagcggttgt gagacacaag aatcgcctgc 5400

tactgttgtc ttccgtccgc ccggcgataa taccgacgga ggagcagcag cagcagcagg 5460

aggaagccag gcggcggcgg caggagcaga gcccatggaa cccgagagcc ggcctggacc 5520

ctcgggaatg aatgttgtac aggtggctga actgtatcca gaactgagac gcattttgac 5580

aattacagag gatgggcagg ggctaaaggg ggtaaagagg gagcgggggg cttgtgaggc 5640

tacagaggag gctaggaatc tagcttttag cttaatgacc agacaccgtc ctgagtgtat 5700

tacttttcaa cagatcaagg ataattgcgc taatgagctt gatctgctgg cgcagaagta 5760

ttccatagag cagctgacca cttactggct gcagccaggg gatgattttg aggaggctat 5820

tagggtatat gcaaaggtgg cacttaggcc agattgcaag tacaagatca gcaaacttgt 5880

aaatatcagg aattgttgct acatttctgg gaacggggcc gaggtggaga tagatacgga 5940

ggatagggtg gcctttagat gtagcatgat aaatatgtgg ccgggggtgc ttggcatgga 6000

cggggtggtt attatgaatg taaggtttac tggccccaat tttagcggta cggttttcct 6060

ggccaatacc aaccttatcc tacacggtgt aagcttctat gggtttaaca atacctgtgt 6120

ggaagcctgg accgatgtaa gggttcgggg ctgtgccttt tactgctgct ggaagggggt 6180

ggtgtgtcgc cccaaaagca gggcttcaat taagaaatgc ctctttgaaa ggtgtacctt 6240

gggtatcctg tctgagggta actccagggt gcgccacaat gtggcctccg actgtggttg 6300

cttcatgcta gtgaaaagcg tggctgtgat taagcataac atggtatgtg gcaactgcga 6360

ggacagggcc tctcagatgc tgacctgctc ggacggcaac tgtcacctgc tgaagaccat 6420

tcacgtagcc agccactctc gcaaggcctg gccagtgttt gagcataaca tactgacccg 6480

ctgttccttg catttgggta acaggagggg ggtgttccta ccttaccaat gcaatttgag 6540

tcacactaag atattgcttg agcccgagag catgtccaag gtgaacctga acggggtgtt 6600

tgacatgacc atgaagatct ggaaggtgct gaggtacgat gagacccgca ccaggtgcag 6660

accctgcgag tgtggcggta aacatattag gaaccagcct gtgatgctgg atgtgaccga 6720

ggagctgagg cccgatcact tggtgctggc ctgcacccgc gctgagtttg gctctagcga 6780

tgaagataca gattgaggta ctgaaatgtg tgggcgtggc ttaagggtgg gaaagaatat 6840

ataaggtggg ggtcttatgt agttttgtat ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag 6900

caccaactcg tttgatggaa gcattgtgag ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg 6960

ggccggggtg cgtcagaatg tgatgggctc cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc 7020

aaactctact accttgacct acgagaccgt gtctggaacg ccgttggaga ctgcagcctc 7080

cgccgccgct tcagccgctg cagccaccgc ccgcgggatt gtgactgact ttgctttcct 7140

gagcccgctt gcaagcagtg cagcttcccg ttcatccgcc cgcgatgaca agttgacggc 7200

tcttttggca caattggatt ctttgacccg ggaacttaat gtcgtttctc agcagctgtt 7260

ggatctgcgc cagcaggttt ctgccctgaa ggcttcctcc cctcccaatg cggtttaaaa 7320

cataaataaa aaaccagact ctgtttggat ttggatcaag caagtgtctt gctgtcttta 7380

tttaggggtt ttgcgcgcgc ggtaggcccg ggaccagcgg tctcggtcgt tgagggtcct 7440

gtgtattttt tccaggacgt ggtaaaggtg actctggatg ttcagataca tgggcataag 7500

cccgtctctg gggtggaggt agcaccactg cagagcttca tgctgcgggg tggtgttgta 7560

gatgatccag tcgtagcagg agcgctgggc gtggtgccta aaaatgtctt tcagtagcaa 7620

gctgattgcc aggggcaggc ccttggtgta agtgtttaca aagcggttaa gctgggatgg 7680

gtgcatacgt ggggatatga gatgcatctt ggactgtatt tttaggttgg ctatgttccc 7740

agccatatcc ctccggggat tcatgttgtg cagaaccacc agcacagtgt atccggtgca 7800

cttgggaaat ttgtcatgta gcttagaagg aaatgcgtgg aagaacttgg agacgccctt 7860

gtgacctcca agattttcca tgcattcgtc cataatgatg gcaatgggcc cacgggcggc 7920

ggcctgggcg aagatatttc tgggatcact aacgtcatag ttgtgttcca ggatgagatc 7980

gtcataggcc atttttacaa agcgcgggcg gagggtgcca gactgcggta taatggttcc 8040

atccggccca ggggcgtagt taccctcaca gatttgcatt tcccacgctt tgagttcaga 8100

tggggggatc atgtctacct gcggggcgat gaagaaaacg gtttccgggg taggggagat 8160

cagctgggaa gaaagcaggt tcctgagcag ctgcgactta ccgcagccgg tgggcccgta 8220

aatcacacct attaccggct gcaactggta gttaagagag ctgcagctgc cgtcatccct 8280

gagcaggggg gccacttcgt taagcatgtc cctgactcgc atgttttccc tgaccaaatc 8340

cgccagaagg cgctcgccgc ccagcgatag cagttcttgc aaggaagcaa agtttttcaa 8400

cggtttgaga ccgtccgccg taggcatgct tttgagcgtt tgaccaagca gttccaggcg 8460

gtcccacagc tcggtcacct gctctacggc atctcgatcc agcatatctc ctcgtttcgc 8520

gggttggggc ggctttcgct gtacggcagt agtcggtgct cgtccagacg ggccagggtc 8580

atgtctttcc acgggcgcag ggtcctcgtc agcgtagtct gggtcacggt gaaggggtgc 8640

gctccgggct gcgcgctggc cagggtgcgc ttgaggctgg tcctgctggt gctgaagcgc 8700

tgccggtctt cgccctgcgc gtcggccagg tagcatttga ccatggtgtc atagtccagc 8760

ccctccgcgg cgtggccctt ggcgcgcagc ttgcccttgg aggaggcgcc gcacgagggg 8820

cagtgcagac ttttgagggc gtagagcttg ggcgcgagaa ataccgattc cggggagtag 8880

gcatccgcgc cgcaggcccc gcagacggtc tcgcattcca cgagccaggt gagctctggc 8940

cgttcggggt caaaaaccag gtttccccca tgctttttga tgcgtttctt acctctggtt 9000

tccatgagcc ggtgtccacg ctcggtgacg aaaaggctgt ccgtgtcccc gtatacagac 9060

ttgagaggga gtttaaacga attcaatagc ttgttgcatg ggcggcgata taaaatgcaa 9120

ggtgctgctc aaaaaatcag gcaaagcctc gcgcaaaaaa gaaagcacat cgtagtcatg 9180

ctcatgcaga taaaggcagg taagctccgg aaccaccaca gaaaaagaca ccatttttct 9240

ctcaaacatg tctgcgggtt tctgcataaa cacaaaataa aataacaaaa aaacatttaa 9300

acattagaag cctgtcttac aacaggaaaa acaaccctta taagcataag acggactacg 9360

gccatgccgg cgtgaccgta aaaaaactgg tcaccgtgat taaaaagcac caccgacagc 9420

tcctcggtca tgtccggagt cataatgtaa gactcggtaa acacatcagg ttgattcaca 9480

tcggtcagtg ctaaaaagcg accgaaatag cccgggggaa tacatacccg caggcgtaga 9540

gacaacatta cagcccccat aggaggtata acaaaattaa taggagagaa aaacacataa 9600

acacctgaaa aaccctcctg cctaggcaaa atagcaccct cccgctccag aacaacatac 9660

agcgcttcca cagcggcagc cataacagtc agccttacca gtaaaaaaga aaacctatta 9720

aaaaaacacc actcgacacg gcaccagctc aatcagtcac agtgtaaaaa agggccaagt 9780

gcagagcgag tatatatagg actaaaaaat gacgtaacgg ttaaagtcca caaaaaacac 9840

ccagaaaacc gcacgcgaac ctacgcccag aaacgaaagc caaaaaaccc acaacttcct 9900

caaatcgtca cttccgtttt cccacgttac gtcacttccc attttaagaa aactacaatt 9960

cccaacacat acaagttact ccgccctaaa acctacgtca cccgccccgt tcccacgccc 10020

cgcgccacgt cacaaactcc accccctcat tatcatattg gcttcaatcc aaaataaggt 10080

atattattga tgatgttaat taacatgcat ggatccatat gcggtgtgaa ataccgcaca 10140

gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 10200

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tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 10320

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 10380

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 10440

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 10500

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 10560

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 10620

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 10680

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 10740

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tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 10860

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 10920

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 10980

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 11040

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 11100

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 11160

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 11220

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 11280

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 11340

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 11400

atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg cagccatgag attatcaaaa aggatcttca 11460

cctagatcct tttcacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg 11520

tcagctactg ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt 11580

gcagtgggct tacatggcga tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg 11640

aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg 11700

ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat 11760

gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 11820

tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 11880

tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 11940

ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 12000

cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 12060

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tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 12180

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cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 12360

tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 12420

accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 12480

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ttttttaacc aataggccga aatcggcacc atcccttata aatcaaaaga atagaccgag 12660

atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc 12720

aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc 12780

taatcaagtt ttttgtggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc 12840

ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa 12900

gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc 12960

acacccgcgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccat tcgccattca ggatcgaatt 13020

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