一種電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的制備方法與流程

本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領域，尤其涉及一種電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的制備方法。

背景技術(shù)：

在過去的幾十年里，為了提高化療藥物的治療效果，納米膠束、囊泡、微球等聚合物載體得到大力發(fā)展。聚合物藥物載體通過鏈段與藥物的親疏水作用物理包封藥物或共價結(jié)合藥物，以改善藥物在體內(nèi)的循環(huán)穩(wěn)定性，提高對治療部位的靶向性以及有效減少對身體的副作用。然而，目前發(fā)展的納米藥物載體仍然面臨一些挑戰(zhàn)，例如載體與血液成分的相互作用、抗體液稀釋穩(wěn)定性差以及低的細胞攝取率等等。

載藥納米載體在進入人體之后，受到大量體液稀釋，穩(wěn)定性變差。為了提高穩(wěn)定性，對載體進行親水殼交聯(lián)、疏水核交聯(lián)或核殼界面交聯(lián)，以降低稀釋引起的載體解離。然而，這些傳統(tǒng)的交聯(lián)方式在穩(wěn)定載體的同時也降低了藥物釋放的效率。此外，極少數(shù)交聯(lián)結(jié)構(gòu)是具有生物相容性以及生物可降解性的，這大大限制了此類載體在生物醫(yī)藥領域的應用。

血液中的復雜蛋白質(zhì)成分，容易與攜帶正電荷的載體或與載體中的活性基團發(fā)生反應而使載體聚集，被清除體外。而順利進入靶向部位的載體因細胞膜排斥減少了細胞對載藥載體的攝入，影響藥物的生物利用度。近年來，研究人員將酸敏感鍵斷裂引起的電荷轉(zhuǎn)換應用于藥物載體，使得載體在體內(nèi)循環(huán)時帶負電荷，有效避免與血液中蛋白的相互作用；進入腫瘤組織中時，弱酸環(huán)境使載體帶上正電荷，可增強載體與癌細胞的相互作用，提高細胞對載體的攝取。此種電荷轉(zhuǎn)換的優(yōu)點在于同時賦予載體抗蛋白吸附性能和提高細胞攝取能力。

目前，關(guān)于具有電荷翻轉(zhuǎn)的可逆核交聯(lián)的藥物載體報道較少，賦予電荷翻轉(zhuǎn)性質(zhì)以及交聯(lián)結(jié)構(gòu)所需的反應繁瑣，且形成的材料多不能滿足生物可降解性，降低了此類材料的應用可行性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種生物相容性良好的電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的制備方法。

本發(fā)明提供一種電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束，該聚合物是由三種單體聚乙二醇二縮水甘油醚、賴氨酸和硫辛酰乙二胺通過親核開環(huán)反應合成，合成示意圖如圖1所示。為了達到合適的親疏水比例形成膠束，所選聚乙二醇二縮水甘油醚分子量為315g/mol。三種單體的投料摩爾比為1:0.9:0.1～1:0.1:0.9，可調(diào)節(jié)組分比例控制膠束的形成以及其等電點。本發(fā)明中親核加成反應在50℃下反應三天，高溫長時間反應有利于形成分子量大且均一的聚合物，使組裝的膠束粒徑分散性更低。三種單體單元在納米膠束中具有各自的功能作用：1)聚乙二醇二縮水甘油醚作為連接兩個功能小分子的橋梁，生物相容性好；2)賴氨酸作為人體必需氨基酸之一，分子中的羧基和胺基可在不同pH條件下實現(xiàn)質(zhì)子化/去質(zhì)子化，從而控制載體表面所帶電荷，同時實現(xiàn)血液抗蛋白吸附以及增強的細胞吸收性能；3)硫辛酸是人體內(nèi)的抗氧化劑，其五元環(huán)中的二硫鍵可在催化量的DTT作用下與多個相鄰的二硫鍵形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，而此交聯(lián)結(jié)構(gòu)在高濃度的還原劑(如GSH)作用下可斷裂，這種特殊的可逆交聯(lián)結(jié)構(gòu)可穩(wěn)定載體在體內(nèi)循環(huán)，而在細胞內(nèi)部高濃度GSH作用下即可被破壞，提高藥物的靶向釋放能力。

本發(fā)明還提供一種電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的制備方法，依次包括以下步驟：

1)硫辛酸和乙二胺在催化劑N,N'-羰基二咪唑作用下反應生成硫辛酰乙二胺；

2)將硫辛酰乙二胺、不同分子量的聚乙二醇二縮水甘油醚和賴氨酸通過親核加成反應得到三元共聚物粗液；

3)將反應粗液進行透析，干燥，得到純凈的聚合物粉末；

4)將粉末溶解，在持續(xù)攪拌下，向三元共聚物溶液中緩慢滴加超純水；

5)滴水結(jié)束后，攪拌一段時間將溶液轉(zhuǎn)入透析袋中，透析處理得到非交聯(lián)納米膠束。

6)在氮氣氣氛下，往非交聯(lián)膠束溶液中加入催化量DTT溶液，攪拌24小時后透析24小時，得到交聯(lián)納米膠束溶液。

具體的，所述步驟1)中，硫辛酸和乙二胺酰胺化反應所選催化劑為N,N'-羰基二咪唑，反應溶劑為氯仿，反應后的產(chǎn)物分別用10％氯化鈉、1M氫氧化鈉萃取。

具體的，所述步驟2)中，選用分子量為315g/mol的聚乙二醇二縮水甘油醚進行親核反應，在這個分子量下，可很好地控制聚合物親疏水比例，從而形成膠束。

具體的，所述步驟2)中，三個反應組分之間的摩爾為1:0.9:0.1～1:0.1:0.9，可根據(jù)合適的粒徑、等電點選擇最佳反應比例。反應溶劑為甲醇與水的混合液，體積比為1:1，在氮氣保護下、50℃反應3天。

具體的，所述步驟3)中，采用截留分子量為3500的透析袋進行透析，透析液為甲醇和水的混合溶液(v:v＝1:1)。透析的目的在于除去低分子量的聚合物，有利于形成粒徑均一的膠束。

具體的，所述步驟4)中，將聚合物溶解于二甲基亞砜中，待充分溶解后，再以30s/滴的速度滴加超純水。

具體的，所述步驟5)中，滴完水繼續(xù)攪拌兩小時后轉(zhuǎn)入截留分子量為3500的透析袋中，透析不少于24小時，得到純凈的非交聯(lián)納米膠束溶液。

具體的，所述步驟6)中，DTT為硫辛?；?0mol％，過量的DTT會導致二硫鍵徹底斷裂而無法交聯(lián)。反應在25℃避光條件下進行。

本發(fā)明還提供一種電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束，在制備化療藥物載體中的應用。膠束通過疏水作用負載疏水性抗癌藥物，同時，疏水鏈段硫辛酰乙二胺中的二硫鍵可在催化量的DTT作用下交聯(lián)，形成更加穩(wěn)定的載藥納米膠束。由于癌細胞中特殊的生理環(huán)境，其細胞質(zhì)和細胞核中的GSH含量可高達人體血液中的1000倍，這可使原先在血液中穩(wěn)定包載藥物循環(huán)的納米膠束在進入癌細胞后，交聯(lián)的二硫鍵被高濃度的GSH還原破壞，使藥物在細胞內(nèi)實現(xiàn)控制釋放。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：

1.利用親核加成合成聚合物，無需添加催化劑，反應溫和高效。

2.賴氨酸在親核加成過程中，側(cè)基上的氨基受羧基影響參加反應的可能性大大降低；留下的氨基和羧基在不同pH條件下質(zhì)子化/去質(zhì)子化，可實現(xiàn)在體內(nèi)循環(huán)時優(yōu)異的抗蛋白吸附性能。

3.在達到腫瘤組織時，膠束表面電荷翻轉(zhuǎn)為正電荷，可通過靜電作用提高癌細胞對藥物載體的攝取，無需與特定配體結(jié)合，增加反應難度。

4.納米膠束中的二硫鍵可在催化量的DTT作用下形成內(nèi)部核交聯(lián)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，在人體內(nèi)實現(xiàn)穩(wěn)定循環(huán)；而在含高濃度GSH的細胞核和細胞質(zhì)中快速響應斷裂。該納米膠束可用于負載抗癌藥物并實現(xiàn)藥物的靶向釋放。

5.利用聚乙二醇二縮水甘油醚和人體內(nèi)源性物質(zhì)為原料合成的聚合物，具有良好的生物相容性。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中形成交聯(lián)膠束示意圖；

圖2為本發(fā)明中電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束交聯(lián)前后的透射電鏡圖片，

圖中，N₄代表聚乙二醇二縮水甘油醚、硫辛酰乙二胺與硫辛酸以摩爾比為：1:0.3:0.7時反應所得到的電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束；

圖3為本發(fā)明中電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的臨界膠束濃度，

圖中，N₁、N₂、N₃、N₄分別代表聚乙二醇二縮水甘油醚、硫辛酰乙二胺與硫辛酸以摩爾比為：1:1:0,1:0.7:0.3,1:0.5:0.5,1:0.3:0.7時反應所得到的電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束，C為聚合物膠束濃度，單位：mg/mL；

圖4為本發(fā)明中電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束在不同pH下的zeta電位，

圖中，N₁、N₂、N₃、N₄分別代表聚乙二醇二縮水甘油醚、硫辛酰乙二胺與硫辛酸以摩爾比為：1:1:0,1:0.7:0.3,1:0.5:0.5,1:0.3:0.7時反應所得到的電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束；

圖5為本發(fā)明中電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束在蛋白質(zhì)溶液中孵育24小時的粒徑變化，

圖中，聚乙二醇二縮水甘油醚、硫辛酰乙二胺與硫辛酸以摩爾比為：1:0.3:0.7時反應所得到的電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束，BSA作為模型蛋白，濃度為45g/L；

圖6為本發(fā)明中電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束稀釋后的粒徑變化，

圖中，N₄代表聚乙二醇二縮水甘油醚、硫辛酰乙二胺與硫辛酸以摩爾比為：1:0.3:0.7時反應所得到的電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束；

圖7為本發(fā)明中電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束在10mmol/L谷胱甘肽溶液中熒光強度的變化，

圖中，聚乙二醇二縮水甘油醚、硫辛酰乙二胺與硫辛酸以摩爾比為：1:0.3:0.7時反應所得到的電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束；

圖8為本發(fā)明中電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的細胞毒性結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

1)硫辛酰乙二胺的合成：

稱取3.00g(1.45×10^-2mol)硫辛酸和2.59g(1.60×10^-2mol)N,N'-羰基二咪唑，溶于30mL氯仿中，25℃、氮氣保護下反應1小時后，將混合液移至滴液漏斗中，逐滴滴入攪拌均勻的乙二胺(8mL，0.12mol)的氯仿(30mL)溶液中,25℃、氮氣保護下反應12小時。結(jié)束反應后將反應混合液移至分液漏斗中，分別用10％NaCl(100mL)、1M NaOH(100mL)進行萃取，并收集有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，得到黃色凝膠狀化合物硫辛酰乙二胺(2.2g，61％)。

2)聚(賴氨酸-co-聚乙二醇二縮水甘油醚-co-硫辛酰乙二胺)的合成：

分別稱取315mg(1mmol)聚乙二醇二縮水甘油醚、102mg(0.7mmol)賴氨酸、和75mg(0.3mmol)硫辛酰乙二胺溶于3mL甲醇與水的混合溶液中(V:V＝1:1)，置于25mL單口燒瓶中，50℃、氮氣保護下反應72小時。反應結(jié)束后，將粗液移入截留分子量為3500的透析袋中，透析3天，冷凍干燥得到黃色產(chǎn)物。聚乙二醇二縮水甘油醚、硫辛酰乙二胺和賴氨酸在混合溶液中相應的溶解比例，如表1所示，本發(fā)明僅提供4種三元共聚物合成配方，具體使用過程中根據(jù)納米膠束不同性能的應用需要，調(diào)節(jié)三種單體的配比。

表1三元共聚物合成配方一覽表

3)電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的制備:

稱取10mg聚合物溶于1mL二甲基亞砜，待完全溶解，逐滴滴加8mL超純水。滴液結(jié)束后，繼續(xù)攪拌2小時，后轉(zhuǎn)入截留分子量3500的透析袋中，透析72小時，得到純凈的非交聯(lián)納米膠束溶液。納米膠束的交聯(lián)在通N₂氣氛下，加入催化量的DTT，具體的，DTT(77μg，0.5μmol)溶液加入到10mL非交聯(lián)N₄膠束(1mg/mL)溶液中，于25℃下避光攪拌24小時。通過透析法透析24小時獲得純凈的交聯(lián)的納米膠束溶液。圖2為交聯(lián)前后的電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的透射電鏡圖片，圖中N₄對應表1中編號N₄配方的三元共聚物，膠束在交聯(lián)前后都是均一規(guī)整的球形膠束，交聯(lián)之后的膠束粒徑減小約20nm左右。

實施例2

電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束(CMC)的測量：

將實施例1中所得電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束溶液稀釋成一系列不同濃度，取各濃度膠束溶液4mL，分別加入30μL濃度為1.622×10^-5g/mL芘的丙酮溶液，避光置于氮氣氛圍的恒溫震蕩箱中，30℃孵育24小時。利用熒光分光光度計測定發(fā)射光譜，設定熒光激發(fā)波長λ＝333nm，掃描范圍λ＝350～500nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，樣品池厚1cm。通過測定一系列不同濃度納米膠束溶液在373nm(I₁)和384nm(I₃)的熒光強度，以濃度對數(shù)為X軸，I₁/I₃為Y軸作圖，由曲線的突變點求出聚合物納米膠束的CMC值。從圖3中可以看出，N₁、N₂、N₃、N₄具有較低的CMC值，分別為0.011、0.020、0.030和0.038mg/mL，隨賴氨酸含量的增加而增大，均具有良好的抗稀釋穩(wěn)定性。

實施例3

電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的pH敏感性：

將實施例1中所得電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)節(jié)至不同pH值，利用Zeta電位分析儀測定Zeta電位。結(jié)果從圖4中可以看出，當載體材料組成成分中未添加賴氨酸時(即為N₁)，在pH 7.4條件下，納米膠束幾乎不帶電；而隨著pH的減小，納米膠束表面正電荷增加。在增加賴氨酸組分之后，羧基可在堿性條件下去質(zhì)子化，使得納米膠束帶上負電荷；調(diào)節(jié)三種組分配比，可調(diào)節(jié)載體的等電點，當聚乙二醇二縮水甘油醚：硫辛酰乙二胺：賴氨酸摩爾比為1:0.3:0.7時(即為N₄)，其等電點為7.04，即可在pH 7.4條件下使納米膠束帶負電荷，而在pH 6.5條件下，膠束表面轉(zhuǎn)換為正電荷。

由于在聚乙二醇二縮水甘油醚：硫辛酰乙二胺：賴氨酸摩爾比＝1:0.3:0.7的情況下，納米膠束的粒徑較為合適且在pH＝7.04時實現(xiàn)電荷轉(zhuǎn)化，可賦予納米膠束抗蛋白吸附特性以及增強的細胞攝取，因此，本發(fā)明后續(xù)實施例中所提到的納米膠束，在未特殊說明的情況下，均指該比例下的納米膠束。

實施例4

電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的抗蛋白非特異性吸附性能：

將實施例1中所得電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束(N₄)置于濃度為45g/L的牛血清白蛋白溶液中，在不同時間用激光光散射儀測試納米膠束的粒徑變化，觀察蛋白質(zhì)吸附影響。結(jié)果如圖5所示，圖中BSA為牛血清白蛋白，在觀測的24小時內(nèi)，納米膠束N₄粒徑?jīng)]有發(fā)生較大改變，說明帶負電荷的納米膠束可有效排斥蛋白質(zhì)的吸附，說明能在人體內(nèi)進行穩(wěn)定循環(huán)。

實施例5

電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的抗稀釋穩(wěn)定性：

將實施例1中所得電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束(N₄，0.5mg/mL)用超純水稀釋100倍，使其濃度低于CMC值，利用激光光散射儀測試納米膠束的粒徑變化。結(jié)果如圖6所示，交聯(lián)后，納米膠束粒徑由原先的187nm減小到162nm，與透射電鏡圖片所得結(jié)果一致；將交聯(lián)膠束稀釋到CMC值以下，發(fā)現(xiàn)粒徑及其分布沒有太大改變，說明交聯(lián)后的納米膠束具有很強的抗稀釋穩(wěn)定性，能避免膠束在人體體液大量稀釋情況下解離。

實施例6

電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的還原敏感性：

將實施例1中所得電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束中(N₄，4mL，1mg/mL)加入芘的丙酮溶液，使芘濃度為5.0×10^-6mol/L，在30℃恒溫震蕩箱中孵育24小時后，加入GSH溶液，使GSH濃度為10mmol/L，然后在特定的時間間隔里，利用熒光分光光度計測定膠束溶液中芘的激發(fā)光譜，發(fā)射波長為395nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm。結(jié)果如圖7所示，隨著時間的增加，芘的熒光強度逐漸下降，說明芘由疏水環(huán)境進入親水環(huán)境。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于在GSH作用下，膠束內(nèi)核的二硫鍵斷裂，導致原先的膠束結(jié)構(gòu)被破壞，而釋放出包裹在膠束里的芘。

實施例7

電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束的生物相容性：

以實施例1中所得電荷可翻轉(zhuǎn)的還原敏感可逆交聯(lián)納米膠束N₄為研究對象。采用MTT法測試納米膠束的細胞毒性，取對數(shù)期生長的子宮頸癌細胞(Hela細胞)或小鼠成纖維細胞(L929細胞)，經(jīng)胰蛋白酶(0.25％)消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對細胞進行吹打分散，用培養(yǎng)基將細胞稀釋成濃度為1.0×10⁴個/mL的細胞懸液，以每孔100μL接種于96孔板，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)基，分別加入100μL含不同聚合物濃度(5、25、50、100、250、500μg/mL)的DMEM完全培養(yǎng)基，每組設六個復孔，培養(yǎng)24小時后棄去培養(yǎng)基，每孔加入20μL、5mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后棄去孔板中的溶液，每孔加入150μL二甲基亞砜，震蕩溶解活細胞產(chǎn)生的甲臜，用酶標儀在570nm處測定吸光度，并計算細胞存活率。結(jié)果如圖8所示，L929和Hela兩種細胞在不同濃度的納米膠束溶液中的細胞存活率均在90％以上，說明該納米膠束具有良好的生物相容性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發(fā)明的保護范圍。