本發明屬于細胞培養領域。更具體地，本發明涉及一種中國倉鼠卵巢細胞培養基。
背景技術：
：真核細胞中中國倉鼠卵巢細胞(ChineseHamsterOvary，中國倉鼠卵巢細胞)是目前重組糖基蛋白生產的首選體系，因為與其他表達系統相比，其具有諸多優點。目前已有越來越多的藥用蛋白在中國倉鼠卵巢細胞中獲得了高效表達，其中許多CHO表達的藥物已投放市場，例如EPO、Enbrel等。國際和國內有很多人開發了各種CHO培養基和補料配方，如：國內華東理工大學張立、張元興等人在中國專利申請200410018258.0中公布的CHO培養基。國際上有商業出售的培養基，如JRHBiosciences公司是專業從事細胞培養基產品(cellculturemedia)的公司，是美國FDA指定生物醫藥企業專用培養基。Invitrogen公司也出品無血清培養基。但是大規模的進行抗體藥物蛋白質表達需要的培養基量很大，費用昂貴，比如JRH基礎培養基的價格在每升100元人民幣以上，在成本中占很大比例，在我國，蛋白藥物廠家也面臨著培養基的巨額費用的問題，而且同時蛋白產量低也是一個很大的問題。因此，本領域迫切需要開發新的適合中國倉鼠卵巢細胞培養的、高蛋白產量的無血清培養基。技術實現要素：本發明的目的就是為解決上述問題，提供一種新的培養中國倉鼠卵巢細胞的培養基，本發明培養基是適合中國倉鼠卵巢細胞培養的、高蛋白產量的無血清培養基。本發明培養基通過以下技術方案實現的：一種中國倉鼠卵巢細胞培養基包括以下組分：DMEM基礎培養基10-50g/L，酵母抽提物1-20g/L，碳酸氫鈉0.2-3.4g/L，氨基酸5-50g/L，維生素1.5-10g/L，無機鹽2.9-15g/L，白蛋白1-20g/L，轉鐵蛋白30-50g/L和亞油酸1-30mg/L。優選地，所述氨基酸(g/L)包括：精氨酸0.05-1.59g/L，亮氨酸1.25-2.56g/L，異亮氨酸0.86-3.42g/L，天冬氨酸0.12-1.27g/L，谷氨酸0.21-4.25g/L，賴氨酸0.13-2.47g/L，蘇氨酸2.46-5.64g/L，脯氨酸0.19-0.95g/L，甘氨酸0.023-0.45g/L和丙氨酸1.38-5.35g/L。優選地，所述無機鹽(g/L)包括：檸檬酸鐵2.42-4.87g/L，硫酸鋅0.13-1.24g/L，硫酸銅0.98-4.58g/L，亞硒酸鈉0.05-3.84g/L，硫酸鎂0.0042-0.05g/L和偏釩酸鈉0.00047-0.0085g/L。優選地，所述維生素(g/L)包括：維生素B10.10-0.58g/L，維生素B20.25-1.38g/L，維生素B50.02-0.65g/L，維生素B120.001-0.056g/L，維生素C0.13-0.84g/L，維生素E0.23-2.41g/L和維生素D1.0-3.85g/L。優選地，所述中國倉鼠卵巢細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM基礎培養基32g/L，酵母抽提物13g/L，碳酸氫鈉0.85g/L，白蛋白16g/L，轉鐵蛋白35g/L和亞油酸21mg/L，精氨酸1.32g/L，亮氨酸1.58g/L，異亮氨酸2.92g/L，天冬氨酸0.73g/L，谷氨酸2.51g/L，賴氨酸1.42g/L，蘇氨酸3.65g/L，脯氨酸0.87g/L，甘氨酸0.19g/L，丙氨酸2.13g/L，檸檬酸鐵3.29g/L，硫酸鋅1.04g/L，硫酸銅2.97g/L，亞硒酸鈉1.03g/L，硫酸鎂0.03g/L，偏釩酸鈉0.0022g/L，維生素B10.36g/L，維生素B20.97g/L，維生素B50.24g/L，維生素B120.031g/L，維生素C0.54g/L，維生素E1.33g/L和維生素D2.67g/L。DMEM基礎培養基為細胞的生長提供所需的營養成分，酵母抽提物的加入使培養基營養更加豐富。氨基酸作為最主要的氮源物質，存在于細胞培養基中。氨基酸可合成蛋白質、多肽及其他含氮化合物，其分解產生的能量供細胞生長，本發明培養基中加入的氨基酸及其濃度，對中國倉鼠卵巢細胞有良好的促進作用，并且其中的這些氨基酸會影響中國倉鼠卵巢細胞蛋白表達水平。白蛋白是脂類、無機鹽等小分子物質的載體，可解決脂類的難溶性及細胞毒性的問題；也可增加培養基黏度，保護懸浮細胞免受剪切力的損傷。本發明細胞培養基的制備方法，包括以下步驟：S1.稱取上述DMEM培養基干粉，酵母抽提物，氨基酸，可溶性維生素，無機鹽，白蛋白，轉鐵蛋白，加注射用水至總體積的70％-85％，輕微攪拌溶解，并繼續加入維生素E、D和亞油酸，并加入0.2％的吐溫80，攪拌溶解，得A液；S2.向步驟S1所得A液中加入碳酸氫鈉，輕微攪拌溶解，加注射用水至規定體積，得B液；S3.向步驟S2所得B液中用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調pH至7.2-7.4，得C液；S4.將步驟S3所得C液中用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得。本發明的培養基，為中國倉鼠卵巢細胞生長提供了豐富的營養環境，避免了有血清添加的各種弊端，本發明培養基各組分共同作用，減少了中國倉鼠卵巢細胞生長代謝產生的有害代謝物，在不添加補料培養基的條件下，能夠促進中國倉鼠卵巢細胞功能蛋白的表達。本發明提供了一種中國倉鼠卵巢細胞培養基，是一種無血清培養基，具有以下優點：1、本發明提供的中國倉鼠卵巢細胞的無血清基礎培養基，能夠促進中國倉鼠卵巢細胞生長，減少有害代謝物。2、本發明培養基可以促進中國倉鼠卵巢細胞功能蛋白的表達和積累。具體實施方式下面將結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例1一種中國倉鼠卵巢細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM基礎培養基10g/L，酵母抽提物1g/L，碳酸氫鈉0.2g/L，白蛋白1g/L，轉鐵蛋白30g/L和1-30mg/L的亞油酸。所需添加氨基酸，如表1所示：表1培養基中所需添加的氨基酸(g/L)所需添加無機鹽，如表2所示：表2培養基中所需添加的無機鹽(g/L)檸檬酸鐵2.42硫酸鋅0.13硫酸銅0.98亞硒酸鈉0.05硫酸鎂0.0042偏釩酸鈉0.00047所需添加的維生素，如表3所示：表3培養基所需添加的維生素(g/L)維生素B10.10維生素B20.25維生素B50.02維生素B120.001維生素C0.13維生素E0.23維生素D1.0培養基制備方法：S1.稱取上述DMEM培養基干粉，酵母抽提物，氨基酸，可溶性維生素，無機鹽，白蛋白，轉鐵蛋白，加注射用水至總體積的70％-85％，輕微攪拌溶解，并繼續加入維生素E、D和亞油酸，并加入0.2％的吐溫80，攪拌溶解，得A液；S2.向步驟S1所得A液中加入碳酸氫鈉，輕微攪拌溶解，加注射用水至規定體積，得B液；S3.向步驟S2所得B液中用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調pH至7.2-7.4，得C液；S4.將步驟S3所得C液中用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得。實施例2一種中國倉鼠卵巢細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM基礎培養基50g/L，酵母抽提物20g/L，碳酸氫鈉3.4g/L，白蛋白20g/L，轉鐵蛋白50g/L和亞油酸30mg/L。所需添加氨基酸，如表4所示：表4培養基中所需添加的氨基酸(g/L)精氨酸1.59亮氨酸2.56異亮氨酸3.42天冬氨酸1.27谷氨酸4.25賴氨酸2.47蘇氨酸5.64脯氨酸0.95甘氨酸0.45丙氨酸5.35所需添加無機鹽，如表5所示：表5培養基中所需添加的無機鹽(g/L)所需添加的維生素，如表6所示：表6培養基所需添加的維生素(g/L)維生素B10.58維生素B21.38維生素B50.65維生素B120.056維生素C0.84維生素E2.41維生素D3.85制備方法與實施例1類似。實施例3一種中國倉鼠卵巢細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM基礎培養基32g/L，酵母抽提物13g/L，碳酸氫鈉0.85g/L，白蛋白16g/L，轉鐵蛋白35g/L和亞油酸21mg/L。所需添加氨基酸，如表7所示：表7培養基中所需添加的氨基酸(g/L)精氨酸1.32亮氨酸1.58異亮氨酸2.92天冬氨酸0.73谷氨酸2.51賴氨酸1.42蘇氨酸3.65脯氨酸0.87甘氨酸0.19丙氨酸2.13所需添加無機鹽，如表8所示：表8培養基中所需添加的無機鹽(g/L)檸檬酸鐵3.29硫酸鋅1.04硫酸銅2.97亞硒酸鈉1.03硫酸鎂0.03偏釩酸鈉0.0022所需添加的維生素，如表9所示：表9培養基所需添加的維生素(g/L)維生素B10.36維生素B20.97維生素B50.24維生素B120.031維生素C0.54維生素E1.33維生素D2.67制備方法與實施例1類似。對比例1一種中國倉鼠卵巢細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM基礎培養基32g/L，酵母抽提物13g/L，磷酸氫二鈉2.8g/L，白蛋白16g/L，轉鐵蛋白35g/L和亞油酸21mg/L。所需添加氨基酸(g/L)，如表10所示：表10培養基中所需添加的氨基酸所需添加無機鹽，如表11所示：表11培養基中所需添加的無機鹽檸檬酸鐵3.29硫酸鋅1.04硫酸銅2.97亞硒酸鈉1.03硫酸鎂0.03偏釩酸鈉0.0022所需添加的維生素，如表12所示：表12培養基所需添加的維生素維生素B10.36維生素B20.97維生素B50.24維生素B120.031維生素C0.54維生素E1.33維生素D2.67與實施例3的區別在于，用磷酸氫二鈉替換碳酸氫鈉。制備方法與實施例1類似。試驗例1細胞培養基對中國倉鼠卵巢細胞生長及性能的研究試驗對象：實施例1-3及對比例1制備得到的CHO培養基試驗方式：流加培養(加入補料培養基)，加入補料培養基為JRH補料培養基試驗程序：在這個培養試驗中，在細胞生長到對數生長期中期的進行補料，細胞在平臺期的中期進行降溫操作開始表達蛋白，存活率降低到50％左右為培養終點。培養環境：37℃，5％二氧化碳，95％空氣。搖瓶培養過程：在超凈臺內分別向4個125mL搖瓶內加入過濾好的實施例1的培養基、實施例2的培養基、實施例3的培養基和對比例1的培養基，接種后使得細胞總體積為30mL，接種時細胞密度皆為：0.5x106/mL。在細胞生長到對數生長期中期(第七天)進行補料，加入濃縮的相對應的的補料培養基750μl左右，細胞培養液體積沒有太大變化(取樣和蒸發會損失一點體積)。細胞進入平臺期中期后開始降溫，使細胞由生長狀態轉為表達蛋白。實驗結果：細胞生長狀況及表達蛋白濃度如表13所示：表13中國倉鼠卵巢細胞在不同培養基中的生長狀況項目實施例1實施例2實施例3對比例1生長七天后細胞密度(細胞/mL)2.7x1062.3x1063.1x1061.8x106補料后最高密度12.9.x10612.3x10613.6x10610.3x106補料后最高密度時細胞生存率97.897.698.892.1蛋白滴度(g/L)1.211.091.50.69通過實驗比較，實施例3培養基與實施例1、實施例2培養基相比能達到更高的細胞密度，細胞密度、細胞生存率及蛋白滴度均比對比例1高，這說明本發明培養基是一個穩定平衡的整體，各成分相互作用，共同促進中國倉鼠卵巢細胞的生長。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用以限定本發明的實質技術內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。當前第1頁1 2 3